韋 媛，董文化，李 薇，曾 軍，陳惠琴，袁靖喆，梅文莉，戴好富，王 昊*，郭志勇

絲沉香中2個α-葡萄糖苷酶抑制活性的2-(2-苯乙基)色酮二聚體

韋 媛1, 2，董文化2，李 薇2，曾 軍2，陳惠琴2，袁靖喆2，梅文莉2，戴好富2，王 昊2*，郭志勇1*

1. 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南省沉香工程技術(shù)研究中心，沉香國際聯(lián)合研究中心，海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室，海南 ?？?571101

研究菲律賓產(chǎn)絲沉香的化學(xué)成分。采用硅膠、凝膠、半制備高效液相色譜等多種色譜技術(shù)分離絲沉香的化學(xué)成分，通過高分辨質(zhì)譜、核磁共振等波譜學(xué)方法鑒定化合物結(jié)構(gòu)，采用改進后的4-硝基苯基-β--吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β--glucopyranoside，pNPG）法測試化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。從菲律賓產(chǎn)絲沉香中分離鑒定了2個2-(2-苯乙基)色酮二聚體，分別為aquifilarone N（1）和diaquilariachrome B（2）?；衔?和2均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值分別為（14.33±0.38）μmol/L和（39.53±2.09）μmol/L?；衔?為新化合物，化合物2為首次從絲沉香中分離得到。

絲沉香；沉香；2-(2-苯乙基)色酮二聚體；α-葡萄糖苷酶抑制活性；aquifilarone N；diaquilariachrome B

沉香為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬Lam. 或擬沉香屬Gaertn. 植物含有樹脂的木材。作為傳統(tǒng)名貴藥材，沉香主要用于治療胸腹脹悶疼痛、嘔吐呃逆、氣逆喘急等癥[1]，還可治療精神疾病，如神經(jīng)官能癥、神經(jīng)分裂癥和神經(jīng)衰弱[2]。此外，沉香還是天然香料，位列“沉檀龍麝”四大名香之首，被稱為“香料之王”，在香文化、日化等領(lǐng)域廣泛使用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，沉香主要含有倍半萜類和2-(2-苯乙基)色酮類化合物[3]，此類化合物具有抗炎、細胞毒、α-葡萄糖苷酶抑制、乙酰膽堿酯酶抑制、神經(jīng)保護等生物活性[3-7]。其中，2-(2-苯乙基)色酮類化合物是沉香真?zhèn)舞b定和品質(zhì)評價的關(guān)鍵成分[1]。據(jù)中國瀕危物種進出口管理辦公室數(shù)據(jù)顯示絲沉香為四大沉香進口品種之一[8]。絲沉香(Oken) Merr.主要分布于印度尼西亞、巴布亞新幾內(nèi)亞、菲律賓、馬魯古群島[9-10]。作為沉香貿(mào)易的重要組成部分，關(guān)于絲沉香中化學(xué)成分的報道屈指可數(shù)，對其鑒定與應(yīng)用也缺乏科學(xué)指導(dǎo)[7,11-15]。本課題組首先系統(tǒng)研究了印度尼西亞產(chǎn)絲沉香的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)5,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮衍生物豐富，且具有顯著的抗炎活性[7,14]。另外，也從菲律賓產(chǎn)絲沉香中發(fā)現(xiàn)一系列結(jié)構(gòu)新穎且有抗炎活性的2-(2-苯乙基)色酮二聚體，聚合方式與印度尼西亞產(chǎn)絲沉香中2-(2-苯乙基)色酮二聚體的結(jié)構(gòu)存在一定差異，尚未發(fā)現(xiàn)5,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮衍生物[5]。本課題繼續(xù)對菲律賓產(chǎn)絲沉香的乙醇提取物醋酸乙酯相進行分離純化，得到2個2-(2-苯乙基)色酮二聚體（圖1），分別為aquifilarone N（1）和diaquilariachrome B（2）。其中化合物1為新化合物，化合物2首次從菲律賓產(chǎn)絲沉香中分離得到?；衔?和2均具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖1 菲律賓產(chǎn)絲沉香中2-(2-苯乙基)色酮二聚體

1 儀器與材料

安捷倫1260分析型高效液相色譜儀和安捷倫1260半制備型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Cosmosil 5PFP色譜柱（250.0 mm×10.0 mm，5 μm，Nacalai tesque公司）；Cosmosil πNAP色譜柱（250.0 mm×10.0 mm，5 μm，Nacalai tesque公司）；布魯克AV-500型超導(dǎo)核磁儀（德國布魯克公司）；沃特世Xevo G2-XS QTof質(zhì)譜儀（美國沃特世科技有限公司）；旋光儀MCP 5100（奧地利Anton Paar有限公司）；圓二色譜儀MOS-500（法國Biologic公司）；CA-1111型冷卻水循環(huán)裝置（上海愛朗儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph Laborota）；Mettler Toledo ME204精密分析天平[萬分之一，梅特勒-托力多儀器（上海）公司]；ELX-800 酶標儀（美國寶特公司）；薄層色譜硅膠板G和柱色譜硅膠G、H（200～300、60～80目，青島海洋化工廠）；ODS（20～45 μm，日本Fuji公司）；凝膠Sephadex LH-20（德國Merck公司）；色譜級甲醇（批號221121）購于康科德科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（批號6052006）購于Sigma-Aldrich公司；阿卡波糖（批號W12J9B52561）購于青島騰龍微波科技有限公司；金雀異黃酮（批號C11903909）購于Macklin公司；4-硝基苯基-β--吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl- β--glucopyranoside，pNPG，批號K22J9B64113）購于源葉生物公司。

菲律賓產(chǎn)絲沉香樣品購于海南省?？谑?，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所戴好富研究員鑒定其基原植物為絲沉香(Oken) Merr.，憑證標本（FLBS20200710）保存在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

2 提取與分離

將干燥的絲沉香樣品（817.0 g）粉碎后經(jīng)95%乙醇（5.0 L）回流提取5次，減壓濃縮得到浸膏（180.4 g）。乙醇提取物均勻分散于去離子水中，用石油醚（3.5 L×3）、醋酸乙酯（3.5 L×3）和正丁醇（3.5 L×3）依次進行萃取，即得石油醚相7.4 g、醋酸乙酯相81.7 g和正丁醇相85.2 g。醋酸乙酯相經(jīng)減壓硅膠柱色譜（9 cm×25 cm），以氯仿-甲醇（100∶1→0∶1）梯度洗脫后，根據(jù)TLC和HPLC分析合并得到14個流分（Fr. 1～14）。Fr. 12（17.8 g）在ODS柱上通過甲醇-水溶液（40%～100%）加壓洗脫，所得洗脫液濃縮后經(jīng)過TLC和HPLC分析合并得到20個流分（Fr. 12.1～12.20）。Fr. 12.6（232.8 mg）經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）得到3個流分（Fr. 12.6.1～12.6.3），F(xiàn)r. 12.6.2（96.3 mg）經(jīng)半制備型HPLC（πNAP柱，甲醇-水65∶35）柱色譜后得到3流分（Fr. 12.6.2.1～12.6.2.3），F(xiàn)r. 12.6.2.2（37.8 mg）再經(jīng)半制備型HPLC（5PFP柱，甲醇-水50∶50）獲得化合物1（3.7 mg，R＝25.0 min）。Fr. 12.9（532.8 mg）經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）得到3個流分（Fr. 12.9.1～12.9.3），F(xiàn)r. 12.9.2（48.9 mg）經(jīng)半制備型HPLC（πNAP柱，甲醇-水65∶35）分離得化合物2（8.0 mg，R＝50.0 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1的1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)和DEPTQ (125 MHz, DMSO-d6)數(shù)據(jù)

圖2 化合物1的關(guān)鍵2D NMR信號

綜合分析化合物1的一維和二維核磁數(shù)據(jù)，化合物1中Unit A和Unit B的結(jié)構(gòu)分別與aquilarone D[16]和6,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮[17]一致，共20個不飽和度，不含有其他環(huán)。由HMBC上H-8到C-8的遠程相關(guān)，ROESY上H-8到H-7的NOE效應(yīng)，確定Unit A與Unit B是通過C8--C8連接?；衔?的相對構(gòu)型通過偶合常數(shù)和NOE效應(yīng)確定。H-5/H-8的偶合常數(shù)[35,6(6.8 Hz)、36,7(9.0 Hz)和37,8(7.2 Hz)] 表明以上4個氫原子均位于假直立鍵，且H-5/H-6、H-6/H-7、H-7/H-8為反式構(gòu)型。ROESY上H-5/H-7和H-6/H-8的NOE效應(yīng)進一步證明以上推斷，該化合物的相對構(gòu)型與crassin B[6]一致（圖2）?；衔?的CD圖譜中Cotton效應(yīng)[243 (?9.7), 210 (＋9.7) nm]與crassin B [236 (?12.65), 214 (＋9.88) nm]的一致，表明該化合物與crassin B的絕對構(gòu)型相同，為5,6,7,8。命名為aquifilarone N。

4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測試

α-葡萄糖苷酶抑制劑能選擇性的作用于小腸黏膜刷狀緣上的葡萄糖苷酶，抑制多糖及蔗糖分解成葡萄糖，延緩碳水化合物的分解，減少葡萄糖的吸收。

采用改進后的pNPG法[21-24]測試化合物1和2的α-葡萄糖苷酶抑制活性。α-葡萄糖苷酶用0.1 mol/L pH 6.8的PBS稀釋成0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液。取65 μL的待測溶液加入650 μL的α-葡萄糖苷酶溶液，陰性對照組和空白對照組待測溶液為DMSO，搖勻后，取110 μL于96孔板中（4次重復(fù)），因以上2個化合物顏色為黃色，需除去本底吸收，多做2組平行。將96孔板于37 ℃放置15 min后，化合物組與陰性對照組加入40 μL的2.5 mmol/L pNPG溶液；空白對照組與化合物本底組加入40 μL 0.1 mol/L PBS溶液。將96孔板于37 ℃放置15 min后，在405 nm波長下檢測每孔的吸光度（）值。以阿卡波糖（質(zhì)量分數(shù)≥95.0%）、金雀異黃酮（質(zhì)量分數(shù)≥97.0%）為陽性對照。并按照公式計算抑制率。

抑制率＝[(DMSO－PBS)－(樣品－本底)]/(DMSO－PBS)

DMSO為陰性對照組的值，PBS為空白對照組的值，樣品為化合物組的值，本底為化合物本底組的平均值

實驗結(jié)果顯示，化合物1和2均具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）分別為（14.33±0.38） μmol/L和（39.53±2.09）μmol/L。陽性對照阿卡波糖和金雀異黃酮的IC50分別為（1 147.05±185.87）μmol/L和（30.57±1.07）μmol/L。

5 討論

沉香中2-(2-苯乙基)色酮類化合物結(jié)構(gòu)類型豐富，其中2-(2-苯乙基)色酮二聚體的單體結(jié)構(gòu)類型和聚合方式多樣，國產(chǎn)沉香、柯拉斯那沉香、絲沉香等不同來源沉香中2-(2-苯乙基)色酮二聚體結(jié)構(gòu)和相對含量存在差異，可為沉香的鑒別提供依據(jù)[3-7]。本研究利用多種現(xiàn)代色譜和波譜學(xué)技術(shù)從菲律賓產(chǎn)絲沉香中分離鑒定2個2-(2-苯乙基)色酮二聚體aquifilarone N（1）和diaquilariachrome B（2），2個化合物都為5,6,7,8-四氫-2-(2-苯乙基)色酮與flindersia型2-(2-苯乙基)色酮通過C8--C8''連接的二聚體。然而，文獻檢索發(fā)現(xiàn)化合物2曾被錯誤鑒定為AH15[18]。化合物1和2對α-葡萄糖苷酶都表現(xiàn)出了較強的體外抑制活性，IC50值分別為（14.33±0.38）μmol/L和（39.53±2.09）μmol/L。以上結(jié)果豐富了絲沉香的化學(xué)成分及α-葡萄糖苷酶抑制活性化合物，為絲沉香鑒定技術(shù)體系的建立提供了科學(xué)依據(jù)，也為絲沉香資源進一步開發(fā)利用提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 192-193.

[2] 戴好富. 沉香的現(xiàn)代研究 [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2017: 1-2.

[3] Li W, Chen H Q, Wang H,. Natural products in agarwood andplants: Chemistry, biological activities and biosynthesis [J]., 2021, 38(3): 528-565.

[4] Chen L Y, Chen H Q, Cai C H,. Seven new 2-(2-phenethyl)chromone derivatives from agarwood of[J]., 2023, 165: 105421..

[5] Yang H R, Wang P, Liu F Z,. Dimeric 2-(2-phenethyl)chromones from agarwood of[J]., 2023, 165: 105422.

[6] Yang Y, Mei W L, Kong F D,. Four new bi-2-(2-phenylethyl)chromone derivatives of agarwood from[J]., 2017, 119: 20-25.

[7] Liu F Z, Wang H, Li W,. Filarones A and B, new anti-inflammatory dimeric 2-(2-phenethyl)chromones from agarwood of[J]., 2021, 46: 11-14.

[8] 董夢妤, 焦立超, 姜笑梅, 等. 沉香的資源分布、識別與貿(mào)易現(xiàn)狀 [J]. 木材工業(yè), 2016, 30(4): 20-24.

[9] 戴好富, 梅文莉. 世界沉香產(chǎn)業(yè) [M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2017: 24-25.

[10] 戴好富, 梅文莉. 沉香實用栽培和人工結(jié)香技術(shù) [M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2015: 17-18.

[11] Mi C N, Yuan J Z, Zhu M M,. 2-(2-phenylethyl)chromone derivatives: Promising α-glucosidase inhibitors in agarwood from[J]., 2021, 181: 112578.

[12] Mi C N, Mei W L, Wang H,. Four new guaiane sesquiterpenoids from agarwood of[J]., 2019, 135: 79-84.

[13] Mi C N, Mei W L, Yuan J Z,. Chemical constituents from agarwood of[J]., 2021, 30(6): 505-517.

[14] 米承能.(Oken) Merr. 產(chǎn)沉香乙醇提取物化學(xué)成分及生物活性研究 [D]. 海口: 海南大學(xué), 2020.

[15] Suzuki A, Miyake K, Saito Y,. Phenylethylchromones withantitumor promoting activity from[J]., 2017, 83(3/4): 300-305.

[16] Chen D, Xu Z R, Chai X Y,. Nine 2-(2-phenylethyl)chromone derivatives from the resinous wood ofand their inhibition of LPS-induced NO production in RAW264.7 cells [J]., 2012(27): 5389-5397.

[17] Konishi T, Konoshima T, Shimada Y,. Six new 2-(2-phenylethyl)chromones from agarwood [J]., 2002, 50(3): 419-422.

[18] Iwagoe K, Kodama S, Konishi T,. The structures of AH15 and AH18, new bi- and tri-phenylethylchromones from agalwood [J]., 1987, 35: 4680-4682.

[19] Shibata S, Sugiyama T, Uekusa Y,. Five new 2-(2-phenylethyl)chromone derivatives from agarwood [J]., 2020, 74(3): 561-570.

[20] He D, Dong W H, Li W,. LC-MS-guided isolation of 2-(2-phenylethyl)chromone dimers from red soil agarwood of[J]., 2022, 158: 105162.

[21] Liao G, Mei W L, Dong W H,. 2-(2-Phenylethyl) chromone derivatives in artificial agarwood from[J]., 2016, 110: 38-43.

[22] Li T, Zhang X D, Song Y W,. A microplate-based screening method for alpha-glucosidase inhibitors [J]., 2005, 10: 1128-1134.

[23] Jong-Anurakkun N, Bhandari M R, Kawabata J. α-glucosidase inhibitors from devil tree () [J]., 2007, 103(4): 1319-1323.

[24] 康科星, 戴好富, 王佩, 等. 柯拉斯那沉香的倍半萜類化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥, 2017, 48(22): 4601-4607.

Two 2-(2-phenylethyl) chromone dimers with α-glucosidase inhibitory activity from agarwood of

WEI Yuan1, 2, DONG Wen-hua2, LI Wei2, ZENG Jun2, CHEN Hui-qin2, YUAN Jing-zhe2, MEI Wen-li2, DAI Hao-fu2, WANG Hao2, GUO Zhi-yong1

1. Hubei Key Laboratory of Natural Product Research and Development, College of Biological and Pharmaceutical Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443002, China 2. Hainan Engineering Research Center of Agarwood, International Joint Research Center of Agarwood, Hainan Key Laboratory of Natural Products Research and Development of Li Folk Medicine, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China

To investigate the chemical constituents of agarwood offrom Philippines.All compounds were isolated by using various chromatographic techniques, including silica gel, Sephadex LH-20, semi-preparative high performance liquid chromatography. Their structures were elucidated based on modern spectroscopic methods, such as high-resolution mass spectrometry (HRMS) and nuclear magnetic resonance (NMR). The α-glucosidase inhibition assay was performed by modified pNPG (4-nitrophenyl β--glucopyranoside) method.Two 2-(2-phenylethyl) chromone dimers were isolated from agarwood of, and identified as aquifilarone N (1) and diaquilariachrome B (2). Compounds 1 and 2 exhibited α-glucosidase inhibitory activities, with IC50values of (14.33 ± 0.38）μmol/L and (39.53 ± 2.09) μmol/L, respectively.Compound 1 is a new compound, and compound 2 is isolated fromfor the first time.

(Oken) Merr.; agarwood; 2-(2-phenylethyl) chromone dimer; α-glucosidase inhibitory activity; aquifilarone N; diaquilariachrome B

R284.1

A

0253 - 2670(2023)22 - 7336 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.010

2023-07-21

海南省重大科技計劃項目（ZDKJ2021031）；財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-21）；海南省自然科學(xué)基金高層次人才項目（320RC714）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（1630052023006）

韋 媛（1998—），女，壯族，在讀碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail: weiyuannpc@126.com

通信作者：郭志勇（1975—），男，教授，從事藥用植物及其內(nèi)生菌活性次級代謝產(chǎn)物研究。E-mail: zhyguoctgu@foxmail.com

王 昊（1990—），男，助理研究員，從事熱帶藥用植物活性次生代謝產(chǎn)物研究。E-mail: wanghao@itbb.org.cn

[責任編輯 王文倩]