羅潤(rùn)波,吳 丹,黃家旗,蔡重振,李宇鵬,李 霞,郭曉慶,郭欣冉,宋仁德,索朗斯珠*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,西藏 林芝 860000;2.國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系玉樹(shù)綜合試驗(yàn)站,青海 玉樹(shù) 815000)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens),又稱(chēng)魏氏梭菌(C.welchii),為革蘭陽(yáng)性、產(chǎn)芽胞的大桿菌,無(wú)鞭毛、不運(yùn)動(dòng)、兩端鈍圓、有莢膜,常單個(gè)或成雙存在。產(chǎn)氣莢膜梭菌最適生長(zhǎng)溫度為42～45℃,對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高,在普通培養(yǎng)基上可以正常生長(zhǎng),在牛乳培養(yǎng)基上有“爆裂發(fā)酵”現(xiàn)象[1]。在血瓊脂平板上,菌落為半透明且表面光滑,大多數(shù)具有典型的溶血環(huán)。該菌可產(chǎn)生α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ和ν等20余種細(xì)胞毒素,根據(jù)分泌毒素種類(lèi)和致病性的不同,將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為 A～G 7個(gè)毒素型[2]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛存在于泥土、污水、腐殖質(zhì)、飼草、排泄物等自然環(huán)境以及人畜腸道中,是一種人畜共患性條件致病菌[3]。該菌對(duì)健康的腸道黏膜不具有侵襲性和黏附性,由于大量使用抗生素、不合理的飼養(yǎng)管理等干擾因素,打破動(dòng)物腸道內(nèi)正常菌群的平衡[4],從而使產(chǎn)氣莢膜梭菌在動(dòng)物腸道中得以大量繁殖并產(chǎn)生不同組合的致病毒素,從而導(dǎo)致動(dòng)物的胃腸道疾病的發(fā)生,給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。牦牛以放牧為主,消毒防疫措施難以實(shí)施,牦牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病春、秋兩季多發(fā),是常見(jiàn)的牦牛疾病之一[5-8]。然而關(guān)于研究牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行病學(xué)和耐藥情況的報(bào)道很少。因此,中國(guó)作為世界上牦牛的主要養(yǎng)殖國(guó)家,研究牦牛生產(chǎn)中產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行情況和耐藥特性,對(duì)預(yù)防和治療相關(guān)疾病具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源在前期的工作中對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的牦牛猝死和腸毒血癥進(jìn)行了確診。本研究樣品對(duì)病例確診地區(qū)進(jìn)行了樣品的擴(kuò)大采集和對(duì)無(wú)產(chǎn)氣莢膜梭菌病資料的部分地區(qū)進(jìn)行了樣品采集。在2018—2021年從青藏高原地區(qū)的規(guī)?；笈ｐB(yǎng)殖場(chǎng)、散養(yǎng)戶隨機(jī)采集牦牛新鮮糞便樣品1 155份。其中包括那曲市(n=295)、拉薩市(n=121)、日喀則市(n=26)、林芝市(n=104)、山南市(n=158)、海北藏族自治州(n=39)、玉樹(shù)藏族自治州(n=275)和西寧市(n=137)。所有樣品低溫保存,并及時(shí)送西藏農(nóng)牧學(xué)院進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基(TSC)、梭菌增菌培養(yǎng)基(RCM)、羊血瓊脂培養(yǎng)基、Mueller Hinton瓊脂、革蘭染液購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;2.5 L厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧缸購(gòu)自日本Mitsubishi Chemical公司;無(wú)菌脫纖維綿羊血購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;DNA聚合酶、dNTPs、DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;核酸染料、DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司;藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物有限公司。冷凍離心機(jī)、PCR儀,德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn);恒溫培養(yǎng)箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn);凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技有限公司生產(chǎn);電泳儀,北京八一儀器。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)從每份樣品中無(wú)菌稱(chēng)取1 g牦牛糞便稀釋于10 mL的生理鹽水中,振蕩?kù)o置后吸取1 mL上清液接種于FTG培養(yǎng)基,石蠟液封,在43℃條件下培養(yǎng)18～24 h。選取其中有氣泡產(chǎn)生的樣品接種至含5%環(huán)絲氨酸的TSC培養(yǎng)基。隨后挑取黑色扁平圓形的單菌落接種于RCM培養(yǎng)基,待培養(yǎng)液混濁后采用三區(qū)劃線法接種于含5%脫纖維綿羊血的瓊脂培養(yǎng)基。挑取有溶血環(huán)的單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢,并通過(guò)菌落形態(tài)、細(xì)菌形狀和生長(zhǎng)特性初步判定陽(yáng)性樣品。

1.4 分離菌DNA提取挑取純化后的單菌落接種于RCM培養(yǎng)基,43℃培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)液D600 nm=0.6～0.8時(shí),按照全菌水煮裂解法制備分離菌DNA模板,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分離菌16S rDNA PCR鑒定合成細(xì)菌16S rDNA引物[9],27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT,片段大小為1 465 bp。以分離菌DNA為模板,利用PCR技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用50 μL體系:上游引物1 μL,下游引物1 μL,2×Tap Master Mix酶25 μL,模板2 μL,ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,符合目的條帶大小的PCR產(chǎn)物委托北京擎科生物科技有限公司成都分公司進(jìn)行測(cè)序。并將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。

1.6 分離菌毒素基因檢測(cè)及分型合成產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因(cpa、cpb、etx、iap、cpe、netB)的引物(表1)。以分離菌DNA為模板,利用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)分離菌進(jìn)行毒素基因檢測(cè),并根據(jù)其所攜帶的毒素基因按照最新毒素分型方案[4],將其分為A型(cpa)、B型(cpa、cpb、etx)、C型(cpa、cpb)、D型(cpa、etx)、E型(cpa、ia)、F型(cpa、cpe)和G型(cpa、netB) 7個(gè)型。

1.7 分離菌藥敏試驗(yàn)采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌株對(duì)常用的26種抗菌藥物的敏感性,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小,參照CLSI推薦的《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)分離菌的耐藥情況進(jìn)行判定[13]。

1.8 分離菌耐藥基因的檢測(cè)根據(jù)文獻(xiàn)合成8類(lèi)33對(duì)耐藥基因引物(表2),以分離菌DNA為模板,利用PCR技術(shù)對(duì)分離株的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。其中包括抗β-內(nèi)酰胺類(lèi)(blaCTX-M、blaSHV、blaTEM、blaOXA)[14]、抗大環(huán)類(lèi)脂類(lèi)(ermA、ermB、ermC、ermF、ermX)[15]、抗氨基糖苷類(lèi)(aadA、strA、aph(3′)-III-F、aadB、aphA)[16]、抗四環(huán)素類(lèi)(tetM、tetA、tetB、tetC)[17]、抗氯霉素類(lèi)(Catl、Flor、cmlA)[18]、抗多肽類(lèi)(mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5)[19]、抗喹諾酮類(lèi)(qnrA、qnrS、qnrB、aac(6’)-Ib-cr)[20]和抗磺胺類(lèi)(Sul1、Sul2、Sul3)[21]。

表2 青藏高原地區(qū)各地市牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離情況

2 結(jié)果

2.1 分離菌菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性分離菌在各培養(yǎng)基生長(zhǎng)特性及形態(tài)如圖1所示。分離菌在FTG中快速產(chǎn)生大量氣體,并伴有惡臭氣味;在TSC中長(zhǎng)出帶乳白色暈圈的黑色單菌落;在血平皿上長(zhǎng)出具有典型的溶血環(huán)的表面光滑、邊緣整齊、近似透明的菌落。經(jīng)過(guò)革蘭染色鏡檢可見(jiàn)菌體粗短、成單個(gè)或雙個(gè)排列的革蘭陽(yáng)性直桿菌,大小為(0.6～2.4) μm×(1.3～19.0) μm。

2.2 分離菌16S rDNA PCR鑒定經(jīng)分離純化共得到432株疑似產(chǎn)氣莢膜梭菌,且分離菌的16S rDNA PCR產(chǎn)物凝膠電泳后在約1 400 bp處出現(xiàn)條帶(圖2)。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì),432株分離菌與C.perfringens相似性達(dá)99.5%～100.0%,確定其為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.3 青藏高原地區(qū)各地市牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離率青藏高原地區(qū)牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離情況見(jiàn)表2,結(jié)果顯示:青藏高原地區(qū)牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌平均陽(yáng)性率為37.40%(432/1155),青海省陽(yáng)性率為38.14%(172/451)略高于西藏自治區(qū)的36.93%(260/704);陽(yáng)性率最高的地區(qū)為西藏那曲市49.83%(147/295),最低為西藏山南市24.05%(38/158)。

2.4 分離菌毒素型鑒定結(jié)果青藏高原地區(qū)各采樣地市牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌分型結(jié)果顯示:在432株分離菌中檢測(cè)到了A型(85.65%,370/432)、C型(8.10%,35/432)、D型(4.86%,21/432)和F型(1.39%,6/432) 4種毒素型產(chǎn)氣莢膜梭菌,未檢測(cè)出B型、E型和G型產(chǎn)氣莢膜梭菌;A型和C型在青海省和西藏自治區(qū)均有檢出,D型僅在青海省有檢出,F型僅在西藏自治區(qū)有檢出。

2.5 分離菌的耐藥性結(jié)果抗生素藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示:分離菌株對(duì)紅霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、多黏菌素B和磺胺甲惡唑6種藥物具有較高的耐藥性,耐藥率為69.44%～93.75%,主要集中于氨基糖苷類(lèi)抗生素、磺胺類(lèi)抗生素和少部分大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、多肽類(lèi)抗生素;對(duì)頭孢噻肟、頭孢唑啉、氨芐青霉素、頭孢呋辛、頭孢他啶、青霉素、頭孢氨芐、苯唑西林、麥迪霉素、米諾環(huán)素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、萬(wàn)古霉素、環(huán)丙沙星和氧氟沙星18種藥物具有較低的耐藥性(圖3)。

圖3 青藏高原地區(qū)牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

按省份對(duì)分離菌株耐藥性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:西藏和青海兩省份的分離株對(duì)不同種類(lèi)的抗生素藥物耐藥性基本一致,僅在部分藥物的耐藥性呈現(xiàn)多樣性。兩省的分離菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素和磺胺類(lèi)抗生素的耐藥性均超過(guò)了65%,其中西藏自治區(qū)的分離菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)的鏈霉素耐藥率最高,青海省的分離菌對(duì)磺胺類(lèi)抗生素的磺胺甲惡唑耐藥率最高。在多肽類(lèi)抗生素藥物中兩省對(duì)其3種藥物的耐藥率差異性較大,且西藏分離菌耐藥性均高于青海省(圖3折線圖)。

2.6 分離株的多重耐藥性本次藥敏試驗(yàn)所使用的抗生素藥物分為10類(lèi),沒(méi)有只對(duì)1類(lèi)抗生素耐藥的菌株,也沒(méi)有對(duì)10類(lèi)抗生素都耐藥的菌株,其中98.61%的分離菌為多重耐藥菌株(對(duì)3類(lèi)及3類(lèi)以上抗生素具有耐藥性)。多重耐藥性分析結(jié)果顯示,青藏高原地區(qū)牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株對(duì)26種常用抗生素呈現(xiàn)多種耐藥現(xiàn)象,且成正態(tài)分布,最低可對(duì)3種抗生素耐藥,最多可對(duì)16種抗生素耐藥。其中對(duì)7種抗生素耐藥菌株數(shù)量最多占比20.83%,主要表現(xiàn)為耐桿菌肽、慶大霉素、多黏菌素B、紅霉素、卡那霉素、磺胺甲惡唑、鏈霉素;對(duì)14,15和16種抗生素耐藥菌株數(shù)量最少均只占0.69%。另外,對(duì)5～8種抗生素耐藥的菌株數(shù)量超過(guò)1/2,多重耐藥比高達(dá)65.97%。最多的耐藥模式為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)-氨基糖苷類(lèi)-多肽類(lèi)-磺胺類(lèi),占比16.67%。其余各級(jí)耐藥菌株占比見(jiàn)圖4。

圖4 青藏高原地區(qū)牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌多重耐藥情況

2.7 耐藥基因檢測(cè)采用PCR方法對(duì)青藏高原地區(qū)分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行33種耐藥基因檢測(cè)。結(jié)果顯示:分離菌株攜帶14種耐藥基因,檢測(cè)出率為42.42%(14/33),耐藥基因erm(B)檢測(cè)出率最高,檢出率74.01%;耐藥基因erm(B)、mcr-2、sul2的檢出率在50%以上;耐藥基因erm(X)、sul1的檢出率30%～50%;耐藥基因blaSHV、blaTEM、aph(3')-III-F、tetA、tetB、tetM、Flor、qnrS、aac(6’)-Ib-cr的檢出率15%以下;其余19種耐藥基因未檢出(圖5)。表明青藏高原地區(qū)分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌攜帶多種耐藥基因。

圖5 青藏高原牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌各耐藥基因的檢出率

2.8 細(xì)菌的耐藥表型和耐藥基因型相關(guān)性分析對(duì)分離的牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥表型和耐藥基因型進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示,大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氯霉素類(lèi)、磺胺類(lèi)抗生素的耐藥表型和耐藥基因型的符合率為90% 以上;β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、多肽類(lèi)、喹諾酮類(lèi)抗生素的耐藥表型和耐藥基因型的符合率為80%～90%;氨基糖苷類(lèi)抗生素的耐藥表型和耐藥基因型的符合率稍低,為14.81%(表3)。以上表明,在青藏高原地區(qū)分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥表型和耐藥基因之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性。

表3 青藏高原牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥表型和耐藥基因型相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種重要的人獸共患病原菌,其引起的疾病在全球都有發(fā)生,嚴(yán)重危害著各國(guó)畜禽業(yè)的發(fā)展。本研究從青藏高原地區(qū)采集牦牛糞樣1 155份,通過(guò)分離培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢和16S rDNA鑒定,得到432株產(chǎn)氣莢膜梭菌,陽(yáng)性率為37.40%,青海省陽(yáng)性率為38.14%,略高于西藏自治區(qū)的36.93%?？偟膩?lái)說(shuō),腸道通常是產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要棲息地,但其陽(yáng)性率的高低通常受到宿主動(dòng)物生活環(huán)境的影響。另外,青藏高原地區(qū)海拔高、氣溫低、濕度低、紫外線強(qiáng)、空氣顆粒污染物較少,細(xì)菌缺少可依附載體,為細(xì)菌的繁殖和傳播造成了一定阻礙,同樣影響著產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性率的變化[22]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的毒素可引起牦牛壞死性腸炎、下痢、氣性壞疽和猝死。在本研究中,從432株分離菌中檢測(cè)到了A、C、D和F型4種毒素型產(chǎn)氣莢膜梭菌,未檢測(cè)出B、E和G型產(chǎn)氣莢膜梭菌。其中A和C型在青海省和西藏自治區(qū)均有檢出,D型僅在青海省有檢出,F型僅在西藏自治區(qū)有檢出。A型產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量最多,占比85.65%,具有一定的優(yōu)勢(shì)性,與吳丹等[23]、羅潤(rùn)波等[7-8]對(duì)牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究結(jié)果相同;A型產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起人食物中毒,攜帶A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的牦?？赡苁侨祟?lèi)和動(dòng)物的潛在感染源,應(yīng)引起重視;C型產(chǎn)氣莢膜梭菌占比8.10%,其所含的cpb毒素具有細(xì)胞毒性和致死性,當(dāng)宿主生活環(huán)境發(fā)生不適變化或機(jī)體健康狀況下降時(shí)該菌大量增殖并產(chǎn)生毒素,常引起牦牛腹瀉、壞死性腸炎、腸毒血癥以及猝死等疾病[24]。另外,本研究首次報(bào)道從青藏高原牦牛糞樣中檢測(cè)到D和F型產(chǎn)氣莢膜梭菌。D型產(chǎn)氣莢膜梭菌占比4.86%,已知D型可引起牛、綿羊、山羊的腸毒血癥甚至導(dǎo)致突然死亡并可能在犢牛疾病中發(fā)揮作用[25]。F型產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量最少占比1.39%,其所含有的cpe毒素在產(chǎn)氣莢膜梭菌群體中被認(rèn)為是罕見(jiàn)的(0～5%)與人類(lèi)腸道疾病有關(guān),在某些情況下,會(huì)導(dǎo)致食物中毒、抗生素相關(guān)性腹瀉(AAD)和散發(fā)性腹瀉(SD)[26]。本研究對(duì)青藏高原牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因的檢測(cè)結(jié)果豐富了牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素型,表明了牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因型的多樣性。

本研究中,我們對(duì)432株分離菌做了26種藥物的敏感性測(cè)試。藥敏試驗(yàn)所使用的抗生素藥物分為10類(lèi),其中98.61%的分離菌為多重耐藥菌株(對(duì)3類(lèi)及3類(lèi)以上抗生素具有耐藥性),最多可對(duì)16種抗生素耐藥,其中對(duì)7種抗生素耐藥菌株數(shù)量最多占比20.83%,主要表現(xiàn)為耐桿菌肽、慶大霉素、多黏菌素B、紅霉素、卡那霉素、磺胺甲惡唑、鏈霉素。最多的耐藥模式為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)-氨基糖苷類(lèi)-多肽類(lèi)-磺胺類(lèi),占比16.67%。對(duì)紅霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、多黏菌素B和磺胺甲惡唑6種藥物具有較高的耐藥性。在沒(méi)有進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試的情況下,人類(lèi)和獸醫(yī)過(guò)度使用或誤用抗生素,這可能是抗生素多重耐藥性增加的一個(gè)主要因素[27]。提示我們?cè)谂R床實(shí)踐應(yīng)用中,應(yīng)當(dāng)科學(xué)合理地用藥,防止病原菌產(chǎn)生耐藥性。

根據(jù)本研究結(jié)果提示青藏高原地區(qū)牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌具有多樣性和多重耐藥性,并且流行比較廣泛。產(chǎn)氣莢膜梭菌病傳染性強(qiáng),發(fā)病迅速,通常來(lái)不及治療。臨床上抗菌藥物和高免疫血清都沒(méi)有太大的治療價(jià)值,給藥以后往往對(duì)于機(jī)體內(nèi)新繁殖的細(xì)菌具有抑制或者殺滅作用,對(duì)已產(chǎn)生的外毒素作用不大,無(wú)法進(jìn)行有效的治療干預(yù)。良好的飼養(yǎng)管理是預(yù)防該病的最佳方法。