葉 宇，歐春青，王 斐，張艷杰，馬 力，李舒然,2，劉亞龍，姜淑苓

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城 125100）（2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院）

梨（PyrusL.）是世界性的重要落葉果樹，因其果實(shí)香脆多汁、酸甜可口，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健作用，深受人們的喜愛，被譽(yù)為“百果之宗”。傳統(tǒng)梨園在生產(chǎn)上普遍采用稀植大冠或喬砧密植栽培模式，存在樹體過大、樹勢過旺、通風(fēng)透光差、結(jié)果晚、果品質(zhì)量差、管理困難等問題[1-2]。矮砧集約化密植栽培具有樹體矮化、早果豐產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良、管理方便、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)栽培模式的不足，是我國梨栽培發(fā)展的必然趨勢[1,3]。中矮4 號是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所從錦香梨實(shí)生后代中選育而成的梨矮化砧木新品種，具有嫁接親和性好、矮化效果顯著、抗枝干腐爛病和輪紋病、抗寒性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[4]，在梨矮化密植栽培中發(fā)揮著重要作用。由于中矮4 號枝條短、扦插生根困難，在生產(chǎn)上僅用作中間砧，苗木繁育效率低且生產(chǎn)成本高，尚沒有自根砧的應(yīng)用，嚴(yán)重制約了其推廣速度。

采用組織培養(yǎng)的方法繁殖，不僅能夠保存、提純和復(fù)壯母本的優(yōu)良性狀，還能消除季節(jié)因素的限制，從而顯著地提升繁殖效率，滿足短期大規(guī)模生產(chǎn)的需要，創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是果樹無性繁殖常用的方法之一[5]。目前，關(guān)于梨砧木組培快繁技術(shù)研究的報(bào)道較少，僅在杜梨[6-7]、豆梨[8]和個(gè)別矮化砧木[9-10]上有少量報(bào)道。本研究以中矮4 號帶芽莖段為試驗(yàn)材料進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，通過對增殖繼代和生根培養(yǎng)基配方的篩選，為其建立簡便、高效的組培快繁技術(shù)體系，以期為中矮4 號自根苗的工廠化繁育提供技術(shù)支撐，也為其基因工程改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究的試驗(yàn)材料中矮4 號保存在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所梨育種試驗(yàn)園內(nèi)，為嫁接在杜梨基砧上10 年生以上的大樹。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初代組培苗的獲得

春季于中矮4 號新梢萌發(fā)長至10 cm 左右時(shí)，采集其新梢，剪掉新梢上的葉片，保留葉柄，剪成單芽莖段，用自來水沖洗干凈，經(jīng)70%乙醇處理30 s、0.1% HgCl2溶液處理10 min、無菌水清洗5 次后，接種至MS＋0.3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IAA＋1.0 mg/L GA3＋30.0 g/L 蔗糖的初代培養(yǎng)基上，于25 ℃、光照16 h、黑暗8 h 的組培室進(jìn)行培養(yǎng)。待芽萌發(fā)長至2～3 cm 時(shí)，剪下進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.2.2 不同濃度6-BA 對組培苗增殖的影響

以MS 為基本培養(yǎng)基，添加0.3 mg/L IAA、3.0 mg/L GA3和30.0 g/L 蔗糖，然后分別添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 的6-BA，共5 個(gè)處理，每個(gè)處理3 瓶，每瓶接種3 個(gè)外植體，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)，30 d 后測量株高，調(diào)查組培苗增殖系數(shù)，并觀察組培苗生長狀況。

增殖系數(shù)＝培養(yǎng)后外植體數(shù)/初始外植體數(shù)

1.2.3 不同硅源及濃度對組培苗增殖的影響

以MS 為基本培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L 6-BA、0.3 mg/L IAA、3.0 mg/L GA3以及30.0 g/L 蔗糖，然后分別附加50、100、200、400、800 mg/L 的納米二氧化硅（NS）和硅酸鉀（KS），以不添加硅源處理為對照，共11 個(gè)處理，每個(gè)處理3 瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)，30 d后測量株高，調(diào)查組培苗增殖系數(shù)，并觀察組培苗生長狀況。

1.2.4 不同生根方法對組培苗生根的影響

生根培養(yǎng)采用一步生根法和兩步生根法[11]。

（1）一步生根法。選取高度大于2.5 cm 且長出3 片及以上葉片的組培苗，以1/2MS＋15.0 g/L 蔗糖為基本培養(yǎng)基，分別添加0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0 mg/L 的IBA，共6 個(gè)處理，每個(gè)處理5 瓶，每瓶接種3 個(gè)外植體，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)，30 d 后調(diào)查生根指標(biāo)，包括生根率、平均根數(shù)、平均根長、平均根粗。

生根率（%）＝（生根株數(shù)/接種株數(shù)）×100

（2）兩步生根法。選取高度大于2.5 cm 且長出3 片及以上葉片的組培苗，以1/2MS＋15.0 g/L 蔗糖為基本培養(yǎng)基，分別添加2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的IBA，分別暗培養(yǎng)3、5、7 d，然后轉(zhuǎn)移至1/2MS＋1.0 g/L 活性炭（AC）＋15.0 g/L 蔗糖的培養(yǎng)基中，共12 個(gè)處理，每個(gè)處理5 瓶，每瓶接種3 個(gè)外植體，3 次重復(fù)。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d 后調(diào)查生根指標(biāo)。

1.2.5 煉苗與移栽

當(dāng)組培苗生根培養(yǎng)30 d 后，根系長度1～2 cm時(shí)進(jìn)行煉苗。將組培苗從組培室轉(zhuǎn)移到溫室，打開瓶口約1/3 煉苗3 d，然后完全打開瓶蓋煉苗2 d。清洗組培苗根部培養(yǎng)基，移栽至培養(yǎng)基質(zhì)為草炭土∶珍珠巖∶蛭石＝1∶1∶1 的育苗穴盤中，澆透水，噴施50%多菌靈可濕性粉劑800～1 000 倍液，然后扣膜或加蓋保濕。移栽15 d 后，逐漸打開覆膜或蓋子繼續(xù)培養(yǎng)，并及時(shí)補(bǔ)水，移栽30 d 后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2020 軟件處理數(shù)據(jù)及制表，采用SAS 9.4 M5 版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中矮4 號組培苗的初代培養(yǎng)

中矮4 號單芽莖段在初代培養(yǎng)基上，7 d 內(nèi)有15%左右的莖段出現(xiàn)了不同程度的細(xì)菌或真菌污染，未污染的莖段更換新的培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)40 d后，90%以上的未污染莖段上長出了幼嫩新梢，成功獲得了中矮4 號組培苗。

2.2 不同濃度6-BA對中矮4號組培苗增殖的影響

由表1 可以看出，不同濃度6-BA 對中矮4 號的增殖和外植體生長狀態(tài)產(chǎn)生明顯影響。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L 時(shí)，組培苗的株高達(dá)到最高，為3.65 cm，生長健壯，隨著6-BA 濃度的升高（1.5～2.5 mg/L），組培苗的株高呈下降趨勢。組培苗的增殖系數(shù)隨著6-BA 濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，在6-BA 濃度為2.0 mg/L 時(shí)，達(dá)到最大值，為3.71，但組培苗矮小。可見在一定濃度范圍內(nèi)（0.5～2.0 mg/L），較低濃度的6-BA 有利于中矮4 號組培苗長高，而較高濃度的6-BA 則有利于中矮4 號組培苗的增殖。綜合組培苗的生長和增殖狀況可知，1.0 mg/L 為適宜中矮4 號組培苗增殖培養(yǎng)的較好6-BA 濃度。

2.3 不同硅源及濃度對中矮4 號組培苗增殖的影響

由表2 可以看出，不同濃度的NS 和KS 可對中矮4 號組培苗的增殖產(chǎn)生顯著影響。組培苗的株高和增殖系數(shù)均隨NS 濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，株高、增殖系數(shù)最高的NS 濃度分別為100 mg/L 和200 mg/L，均顯著高于對照。KS 對中矮4號組培苗生長的影響與NS 略有不同，株高隨著KS濃度的升高總體呈現(xiàn)下降趨勢，增殖系數(shù)則與之相反，株高、增殖系數(shù)最高的KS 濃度分別為50 mg/L和400 mg/L，也均顯著高于對照，但均顯著低于NS的最佳處理。結(jié)合各處理組培苗的生長狀態(tài)可知，200 mg/L NS 處理，不僅植株生長健壯，且增殖系數(shù)高（5.67），增殖系數(shù)分別比對照和最佳KS 處理（400 mg/L）提高了62.00%和20.38%，最有利于中矮4號組培苗的增殖和生長。

表2 不同硅源及濃度對中矮4 號組培苗增殖的影響

2.4 不同生根方法對中矮4 號組培苗生根和移栽的影響

一步生根法中不同濃度的IBA 對中矮4 號組培苗生根的影響有差異（表3）。組培苗在生根培養(yǎng)7～8 d 后，其莖基部開始有白色物質(zhì)長出，培養(yǎng)15～20 d 后有白色幼根生成。當(dāng)IBA 為0.25、0.50 mg/L 較低濃度時(shí)，組培苗的生根率較高，以0.50 mg/L IBA 處理最高，為83%，這2 個(gè)處理間差異不顯著；隨著IBA 濃度的進(jìn)一步升高，組培苗的生根率呈逐漸下降趨勢。同時(shí)，低濃度的IBA（0.25、0.50 mg/L）也有利于組培苗形成較多、較長和較粗的根系。由此可見，0.50 mg/L 是中矮4 號組培苗一步生根法的最佳IBA 濃度。

表3 一步生根法對中矮4 號組培苗生根的影響

在兩步生根法中，IBA 濃度和暗培養(yǎng)時(shí)間均對中矮4 號組培苗的生根效果有顯著影響（表4），各處理的生根率在29%～92%，平均單株根數(shù)為2.3～11.2 條，平均根長為1.46～3.98 cm，平均根粗為0.33～0.38 mm。其中，IBA 濃度為3.0 mg/L 時(shí)，組培苗的生根效果最好，暗培養(yǎng)3～7 d 處理均能使其生根率在83%以上，以暗培養(yǎng)5 d 效果最好，生根率為92%，平均單株根數(shù)為11.2 條。無論哪個(gè)IBA濃度處理，暗培養(yǎng)5、7 d 的效果均好于暗培養(yǎng)3 d，整體來看，暗培養(yǎng)5 d 的效果最好。因此，對于中矮4 號組培苗兩步生根法，最佳的處理為1/2MS＋3.0 mg/L IBA＋15.0 g/L 蔗糖暗培養(yǎng)5 d。

表4 兩步生根法對中矮4 號組培苗生根的影響

綜上所述，對于中矮4 號組培苗，一步生根法和兩步生根法均能誘導(dǎo)組培苗生根。相比于一步生根法，兩步生根法處理的組培苗生根效果更好，其生根率、平均單株根數(shù)和平均根長均明顯優(yōu)于一步生根法，但是一步生根法誘導(dǎo)的根系平均根粗要大于兩步生根法。通過對生根的組培苗進(jìn)行煉苗移栽（圖版3），其移栽存活率均在90%以上，從生根率上看，兩步生根法優(yōu)于一步生根法。

3 討論

植物生長調(diào)節(jié)劑種類及配比對梨組培苗的誘導(dǎo)分化、增殖和生根起到關(guān)鍵性的作用，主要包括生長素類、細(xì)胞分裂素類以及赤霉素類等[5]。細(xì)胞分裂素通常與生長素一起使用，兩者相輔相成能夠起到更好的培養(yǎng)效果[12-13]。一般來說，細(xì)胞分裂素與生長素的比值較高，則有利于促進(jìn)不定芽形成，擴(kuò)大增殖系數(shù)。另外，GA3對芽的增殖和伸長有一定的促進(jìn)作用，與生長素和細(xì)胞分裂素組合使用能夠取得較好的效果[14]。本試驗(yàn)在IAA 和GA3濃度固定的條件下，組培苗的增殖系數(shù)隨著6-BA 濃度的升高呈先上升后下降的趨勢。過高濃度的6-BA 會導(dǎo)致組培苗生長狀態(tài)變差，在一定濃度范圍內(nèi)，較低濃度的6-BA 有利于組培苗株高的形成，而較高濃度的6-BA 則有利于組培苗的增殖，這與王蘇珂等[15]、楊冠宇等[6]的研究結(jié)果基本一致。

硅是土壤中含量最豐富的礦物元素之一，也是大多數(shù)高等植物生長的有益元素。作為一種宏量元素，硅對植株生長狀況的改善效果極為顯著，能夠促進(jìn)多種植物（包括硅非積累型植物）的生長發(fā)育、改善植株形態(tài)以及提高植株抗逆性等[16-17]。近年來，許多學(xué)者關(guān)注到硅在組織培養(yǎng)中的作用并進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，研究結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中加入硅可以促進(jìn)愈傷組織生長、器官發(fā)生，并改善植株的形態(tài)、解剖、生理特征，從而促進(jìn)組培苗的生長發(fā)育[18]。目前，硅已應(yīng)用于蘋果[19]、香蕉[20]、草莓[21]、藍(lán)莓[22]等果樹組織培養(yǎng)中，但尚未有在梨中應(yīng)用的報(bào)道。本試驗(yàn)在篩出最佳的中矮4 號組培苗增殖培養(yǎng)配方基礎(chǔ)之上，研究不同濃度的納米二氧化硅（NS）和硅酸鉀（KS）對組培苗增殖的影響，證明了硅能夠提高梨組培苗的增殖效果，NS 的效果好于KS，可能是NS 更有利于組培苗的吸收利用，關(guān)于硅對梨組培苗生理代謝以及生根誘導(dǎo)方面的影響還有待進(jìn)一步研究。

梨屬植物組培苗生根困難，生長素類物質(zhì)是不定根誘導(dǎo)所必需的，其種類和濃度都會對組培苗的生根效果產(chǎn)生影響[5]，目前生產(chǎn)上應(yīng)用最多的生根誘導(dǎo)劑主要是IBA。本試驗(yàn)中，中矮4 號組培苗一步生根法使用0.50 mg/L IBA 的生根效果較好，濃度過高反而不利于組培苗生根，這與羅嘉亮等[23]的研究結(jié)果一致。另外，光照條件和培養(yǎng)方法對組培苗不定根誘導(dǎo)也有影響，前期的暗培養(yǎng)對組培苗的生根誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用[24]，而活性炭（AC）可吸附植株分泌的有害物質(zhì)，同時(shí)提供生根的暗環(huán)境有利于根的誘導(dǎo)和根系生長[25]。本研究采用兩步生根法暗培養(yǎng)5 d 后，轉(zhuǎn)入1.0 g/L AC 的培養(yǎng)基中，組培苗的生根率可達(dá)92%，而暗培養(yǎng)時(shí)間過短則不利于組培苗生根[7]。

利用矮化砧木是實(shí)現(xiàn)梨矮化密植集約栽培的主要途徑，而組織培養(yǎng)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)梨自根砧無性繁殖的有效技術(shù)之一，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量再生植株并保留其優(yōu)良性狀，同時(shí)可通過組培苗脫毒技術(shù)獲得無毒苗木，為梨產(chǎn)業(yè)提供大量優(yōu)質(zhì)苗木。本研究通過對中矮4 號的組織培養(yǎng)，獲得了增殖系數(shù)最大為5.67 的增殖培養(yǎng)基配方和生根率最高為92%的生根培養(yǎng)基配方，建立了簡便、高效的梨矮化砧木組培快繁技術(shù)體系，為其自根苗工廠化繁育提供了技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

以帶芽莖段為試材，獲取梨矮化砧木中矮4 號的組培苗較為容易；組培苗在MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IAA＋3.0 mg/L GA3＋30.0 g/L 蔗糖上增殖生長較好，增殖系數(shù)為3.29，在該培養(yǎng)基上再添加200 mg/L NS，增殖效率可提高72.34%，增殖系數(shù)達(dá)5.67；最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS＋3.0 mg/L IBA＋15.0 g/L 蔗糖暗培養(yǎng)5 d 后，轉(zhuǎn)移至1/2MS＋1.0 g/L AC＋15.0 g/L 蔗糖的培養(yǎng)基中，生根率達(dá)92%，平均單株根數(shù)為11.2 條。