張 哲,王 蓓,唐根云,饒利兵,林 玲*

1廣州醫(yī)科大學(xué)研究生院,廣州 510000;2三亞中心醫(yī)院(海南省第三人民醫(yī)院),三亞 572000;3湖南醫(yī)藥學(xué)院,懷化 418000

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種以大、中動(dòng)脈血管內(nèi)膜形成粥樣斑塊或纖維斑塊為特征的常見(jiàn)慢性心血管疾病[1]。動(dòng)脈內(nèi)膜中的脂質(zhì)滲入現(xiàn)已成為AS的主要發(fā)病機(jī)制[2]。聚集在內(nèi)膜與中膜的巨噬細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜上的清道夫受體吞噬大量的低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)后形成泡沫細(xì)胞,驅(qū)動(dòng)細(xì)胞釋放大量的促炎因子、基質(zhì)金屬蛋白酶于細(xì)胞間隙,促使動(dòng)脈管壁中的斑塊蓄積增加,進(jìn)而轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定斑塊,最終進(jìn)展為心肌梗死[2]。然而有效延緩AS的進(jìn)展一直是困擾學(xué)術(shù)界的難題之一。近年來(lái)備受歡迎的新興藥食同源之品海巴戟被證明其有良好地調(diào)節(jié)血脂,改善AS的作用[3]。

海巴戟(Morindacitrifolia),又稱諾麗(Noni)為茜草科巴戟天屬植物,具有抗炎、抗氧化、降脂等藥理作用[4]。根據(jù)中醫(yī)理論,海巴戟藥味酸、甘,藥性平和,有補(bǔ)益腎精、平補(bǔ)陰陽(yáng)及延緩衰老之功效,可有效預(yù)防心腦血管疾病[5]。然而,海巴戟治療AS的具體機(jī)制尚不清楚。鑒于海巴戟的化學(xué)成分復(fù)雜,其主要由蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、苯丙素類(lèi)、酚酸類(lèi)等成分組成[7],符合傳統(tǒng)中藥的多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),因此使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可較清楚地闡述海巴戟發(fā)揮藥理作用的分子機(jī)制。近年來(lái)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門(mén)以計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物信息學(xué)及數(shù)據(jù)挖掘?yàn)橐惑w的新興學(xué)科,它通過(guò)構(gòu)建“藥物-有效成分-疾病靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò),并對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行生物學(xué)功能解釋,使人們更加清楚地認(rèn)識(shí)到藥物治療疾病的機(jī)制機(jī)理[6]。本研究基于海巴戟有效成分多樣,作用靶點(diǎn)豐富的特點(diǎn),擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對(duì)海巴戟治療AS的靶點(diǎn)、生物學(xué)過(guò)程、信號(hào)通路預(yù)測(cè)和分析,同時(shí)采用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,以期為治療AS的藥物開(kāi)發(fā)和治療提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

THP-1細(xì)胞(貨號(hào):CL-0233,武漢普諾賽生命科技有限公司);海巴戟萃取粉(貨號(hào):0003S,海南西沙諾麗生物科技有限公司);胎牛血清(貨號(hào):10270-106,美國(guó)Gibco公司);RPMI1640培養(yǎng)基(貨號(hào):C11875500BT,美國(guó)Gibco公司);佛波酯(PMA)(貨號(hào):P1585,批號(hào):SLCD3659,美國(guó)Sigma);油紅O染色試劑盒(貨號(hào):01391,美國(guó)Sigma);人源性氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(貨號(hào):YB-002,廣州奕元生物科技有限公司);CCK-8試劑盒(貨號(hào):GK10001;GlpBio公司);22-NBD-Cholesterol(貨號(hào):GC46527,美國(guó)GlpBio公司);TRIzol(貨號(hào):ER501-01-01,北京全式金生物技術(shù)股份有限公司);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):AT311-03,北京全式金生物技術(shù)股份有限公司);PPARγ、ABCA1引物(貨號(hào):007P20220307,北京擎科生物科技有限公司);抗PPARγ抗體(貨號(hào):ab178860,英國(guó)Abcam公司);抗ABCA1抗體(貨號(hào):A-7228,武漢ABclonal公司);PPARγ抑制劑GW9662(貨號(hào):A4300,美國(guó)APExBio公司)。

1.2 主要儀器

多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BIOTeK公司);倒置相差顯微鏡(美國(guó)Olympus公司);倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司);低溫高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司);化學(xué)熒光凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 海巴戟有效成分靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)收集

在CMAUP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.bidd.group/CMAUP)中利用關(guān)鍵詞“Morindacitrifolia”檢索其有效成分[7]?；钚猿煞值暮Y選:在CMAUP數(shù)據(jù)庫(kù)的“Ingredient of the Plant”功能區(qū)中選擇實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證的有效成分,其他未經(jīng)驗(yàn)證的成分以化合物名稱或者SMILES格式分別在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)和SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swissadme.ch/)中篩選。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,且類(lèi)藥性(drug-likeness,DL)≥0.18;SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)需滿足“藥代動(dòng)力學(xué)”與“類(lèi)藥性”兩個(gè)特征。通過(guò)文獻(xiàn)檢索又補(bǔ)充了部分活性成分[7]。

疾病靶點(diǎn)的獲取借助“GeneCards”(https://www.genecards.org/)、“OMIM”(https://omim.org/)、“TTD”(http://db.idrblab.net/)、“PharmGKB”(https://www.pharmgkb.org/)、“DrugBank”(https://go.drugbank.com/)五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù),以“atherosclerosis”為關(guān)鍵詞在各數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索,其中“GeneCards”中設(shè)置篩選條件,即“score”>1。刪除或合并各數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到的重復(fù)基因。將獲取的海巴戟有效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集,導(dǎo)入R語(yǔ)言4.2.1中,使用“venn”包作圖。

1.4 海巴戟治療AS疾病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及核心網(wǎng)絡(luò)篩選

將得到的交集基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI,下載同時(shí)生成的“.tsv”格式文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的自由度并對(duì)其可視化操作,然后利用軟件中“CytoNCA”插件[6]根據(jù)“介數(shù)”“接近中心性”“自由度”“特征向量”“基于局部平均連接度方法”“網(wǎng)絡(luò)中心性”6個(gè)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)對(duì)各個(gè)節(jié)點(diǎn)評(píng)分,經(jīng)過(guò)篩選后得到靶點(diǎn)的核心網(wǎng)絡(luò),篩選條件為核心基因均須大于6個(gè)拓?fù)鋮?shù)的中位數(shù)分值。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

使用R語(yǔ)言4.2.1中“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”及“enrichplot”包計(jì)算交集基因的GO富集與KEGG富集條目,再使用“ggplot2包”分別作圖,其中GO富集中的細(xì)胞成分(cellular component,CC)、生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)和分子功能(molecular function,MF)顯示排名前10的條目;KEGG通路富集顯示排名前20的條目。

1.6 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.6.1 分組與造模

先使用100 ng/mL PMA預(yù)處理THP-1細(xì)胞48 h,然后將THP-1源性巨噬細(xì)胞分為6組:正常對(duì)照組、模型組、海巴戟低濃度組、海巴戟中濃度組、海巴戟高濃度組、海巴戟高濃度組+PPARγ抑制劑GW9662組。除正常對(duì)照組外,其余各組均需與50 μg/mL ox-LDL共孵育48 h;而海巴戟低、中、高濃度組需加入各濃度的海巴戟萃取液(海巴戟萃取粉溶于RPMI1640培養(yǎng)基中配成海巴戟萃取液)并與ox-LDL共孵育48 h;海巴戟高濃度組+PPARγ抑制劑GW9662組在共孵育前2 h加入10 μmol/L GW9662預(yù)處理;正常對(duì)照組使用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.6.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度每孔2×104個(gè),使用100 μL含100 ng/mL PMA工作液將細(xì)胞接種于96孔板中,組別設(shè)置空白組和海巴戟8個(gè)不同濃度組(0、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL),其中0濃度組為對(duì)照組,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h后,檢測(cè)前每孔加入10 μL CCK-8試劑后繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。然后使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)的吸光值(OD值),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率 =

(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組) / (A對(duì)照組-A空白組) × 100%

(1)

1.6.3 油紅O染色

取滅菌的細(xì)胞爬片分別放置于12孔板中,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于各孔,每孔細(xì)胞的數(shù)量調(diào)整為3×105個(gè),每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。待PMA誘導(dǎo)48 h后,分別向各組中加入ox-LDL及不同濃度的海巴戟共孵育48 h,棄上清,PBS溶液洗3次。4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗3次,向每孔中加入1 mL的油紅O工作液并于37℃烘箱避光孵育30 min,60%異丙醇分色10 s,PBS清洗3次,待自然晾干后滴加甘油封片,使用倒置熒光顯微鏡拍照保存。

1.6.4 22-NBD-Cholesterol細(xì)胞熒光

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞接種于96孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為1×104個(gè),每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。待各組給藥處理完成后,棄去上清,每孔加入100 μL濃度為1 μg/mL 22-NBD-Cholesterol工作液共孵育24 h,PBS洗3次,避光條件下迅速于多功能酶標(biāo)儀測(cè)量熒光值和倒置熒光顯微鏡下拍照保存。

1.6.5 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中PPARγ、ABCA1 mRNA的表達(dá)

消化各組加藥處理后的細(xì)胞,收集于離心管中,離心后取上清,PBS清洗1次,各組加入0.5～1 mL的TRIzol冰上裂解3 min,分別加入氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇離心分離提取總RNA,使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)中模板定量為1 μg,2×Fine Taq Mix 25 μL,上游引物、下游引物各1 μL,其中引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)經(jīng)歷94 ℃預(yù)變性、94 ℃變性、56 ℃退火、72 ℃延伸、72 ℃再延伸,得到擴(kuò)增后產(chǎn)物。配置2%瓊脂糖凝膠,上樣后進(jìn)行DNA電泳,于凝膠成像顯影儀拍照,計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.6.6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中PPARγ、ABCA1蛋白的表達(dá)

向各組加藥處理后的60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入裂解液100 μL并在冰上裂解30 min,收集細(xì)胞懸液后離心,取上清用BCA法檢測(cè)各組蛋白的濃度后調(diào)整各組蛋白濃度一致,加入上樣緩沖液后100 ℃煮沸10 min配制成樣品。配置8%、10%的SDS-PAGE凝膠,電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉1.5 h,一抗孵育過(guò)夜(抗PPARγ抗體:1∶1 000;抗ABCA1抗體:1∶1 000),次日TBS-T洗膜3次,二抗孵育1 h,均勻滴加高敏化學(xué)發(fā)光液后顯影,利用Image J軟件分析目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值,計(jì)算目的條帶/內(nèi)參蛋白的比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 海巴戟有效成分靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)

在CAMUP數(shù)據(jù)庫(kù)中得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的有效成分有17個(gè)及73個(gè)疾病靶點(diǎn),TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)及檢索文獻(xiàn)去重后共獲得有效成分42個(gè),相關(guān)疾病靶點(diǎn)259個(gè)。因此海巴戟中共檢索到59個(gè)有效成分(見(jiàn)表2),332個(gè)相關(guān)疾病靶點(diǎn)。分別從“GeneCards”“OMIM”“TTD”“PharmGKB”“DrugBank”數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到AS相關(guān)靶點(diǎn)為1 428個(gè)、2個(gè)、35個(gè)、4個(gè)和45個(gè),去重后得到的靶點(diǎn)1 461個(gè)靶點(diǎn)。與海巴戟有效成分靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)為154個(gè)(見(jiàn)圖1)。使用Cytoscape軟件繪制海巴戟有效成分與交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)各節(jié)點(diǎn)的“degree”設(shè)置節(jié)點(diǎn)的顏色,“degree”越高顏色越趨于藍(lán)色(見(jiàn)圖2)。

圖1 有效成分與疾病交集靶點(diǎn)Fig.1 Intersection targets of active ingredients and disease

圖2 海巴戟有效成分與交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of active ingredients of M.citrifolia and intersection targets

表2 海巴戟的有效成分

2.2 PPI構(gòu)建及核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中在線生成PPI圖,在Cytoscape軟件中對(duì)其可視化,交集靶點(diǎn)鄰接節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)越多,顏色愈趨于藍(lán)色(見(jiàn)圖3)。使用軟件的插件“CytoNCA”對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)的核心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行篩選,納入同時(shí)大于各項(xiàng)拓?fù)鋮?shù)中位數(shù)分值的靶點(diǎn)進(jìn)行下一級(jí)分析,共完成兩級(jí)核心網(wǎng)絡(luò)創(chuàng)建,最后得到的核心網(wǎng)絡(luò)中包含核心節(jié)點(diǎn)為28個(gè),716條邊(見(jiàn)表3)。篩選得到的核心靶點(diǎn)相鄰節(jié)點(diǎn)越多,圓形面積越大且顏色越藍(lán)(見(jiàn)圖4)。值得注意的是,核心網(wǎng)絡(luò)中含有大量與脂代謝及炎癥相關(guān)的基因,如PPARG、MMP9、IL-6、CCL2等,這些均是促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展的直接關(guān)聯(lián)基因。

圖3 海巴戟治療AS的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)Fig.3 PPI network of M.citrifolia in the treatment of AS

圖4 核心網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱DFig.4 Network topograph for the core network

表3 核心網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)

2.3 GO富集分析與KEGG富集分析

GO功能富集分析得到2 844個(gè)條目,KEGG通路富集分析得到182個(gè)條目。以P<0.05為條目的篩選條件,富集得到GO的功能主要包括細(xì)胞膜受體、核受體等生物學(xué)功能(見(jiàn)圖5A)。KEGG富集通路主要包括脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、PPAR信號(hào)通路等,這些生物學(xué)過(guò)程均與海巴戟調(diào)節(jié)脂質(zhì)異常密切相關(guān),其中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome transcriptional proliferator-activated receptors,PPAR)信號(hào)通路可能在其中發(fā)揮著重要作用(見(jiàn)圖5B)。

圖5 海巴戟調(diào)節(jié)AS靶點(diǎn)的GO分析(A)和KEGG富集分析(B)Fig.5 GO function enrichment analysis (A) and KEGG pathway analysis (B) for AS by M.citrifolia

2.4 體外實(shí)驗(yàn)

2.4.1 不同濃度的海巴戟對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞活性的影響

CCK-8結(jié)果顯示,不同濃度(0～640 μg/mL)的海巴戟在24 h及48 h對(duì)細(xì)胞活性的影響,在濃度為320、640 μg/mL時(shí),相比于對(duì)照組,海巴戟對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞的毒性作用顯著增加(P<0.05)(見(jiàn)圖6)。海巴戟濃度在0～160 μg/mL對(duì)細(xì)胞毒性的作用較小,因此本研究分別選擇10、20、40 μg/mL作為海巴戟低、中、高濃度組。

圖6 不同濃度的海巴戟對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞活性的影響Fig.6 Effect of different concentrations of M.citrifolia on the activity of THP-1-derived macrophages注:在24 h組中,與對(duì)照組比較,##P<0.01;在48 h組中,與對(duì)照組比較,**P<0.01。Note:In the 24 h group,compared with control group,##P<0.01;In the 48 h group,compared with control group,**P<0.01.

2.4.2 海巴戟促進(jìn)THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出

結(jié)果如圖7、表4所示,與對(duì)照組比較,模型組的脂滴含量與熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.05);與模型組比較,海巴戟各濃度組的脂滴含量明顯降低,而熒光強(qiáng)度在中、高濃度組顯著降低(P<0.05)。

圖7 海巴戟干預(yù)后對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出的影響Fig.7 The effect of M.citrifolia on cholesterol efflux from THP-1-derived macrophages注:A.正常對(duì)照組;B.模型組;C.海巴戟低濃度組;D.海巴戟中濃度組;E.海巴戟高濃度組(下同)。I:油紅O實(shí)驗(yàn)(×200);II:22-NBD-Cholesterol細(xì)胞熒光(×200)。Note:A.Control group;B.Model group;C.M.citrifolia low dose group;D.M.citrifolia medium dose group;E.M.citrifolia high dose group (the same below);I:Oil red O staining (×200);II:22-NBD-Cholesterol fluorescence (×200).

表4 海巴戟干預(yù)后對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出量的影響

2.4.3 海巴戟對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞中PPARγ、ABCA1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖8所示,與對(duì)照組比較,模型組PPARγ、ABCA1 mRNA表達(dá)顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,各濃度海巴戟組的PPARγ、ABCA1 mRNA的表達(dá)呈劑量依賴性增加(均P<0.05)。如圖9所示,與對(duì)照組比較,模型組PPARγ、ABCA1蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,各濃度海巴戟組的PPARγ、ABCA1 蛋白表達(dá)呈劑量依賴性增加(均P<0.05)。

圖8 海巴戟對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞PPARγ、ABCA1 mRNA表達(dá)的影響Fig.8 Effect of M.citrifolia on the mRNA expression of PPARγ and ABCA1 in THP-1-derived macrophages注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與對(duì)照組比較,#P<0.05(下同)。Note:Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with the control group,#P<0.05(the same below).

圖9 海巴戟對(duì)THP-1源性巨噬細(xì)胞中PPARγ、ABCA1 蛋白的表達(dá)的影響Fig.9 Effect of M.citrifolia on the expression of PPARγ and ABCA1 proteins in THP-1-derived macrophages

2.4.4 海巴戟對(duì)GW9662預(yù)處理THP-1源性巨噬細(xì)胞后膽固醇流出的影響

結(jié)果如圖10所示,與海巴戟高濃度組比較,海巴戟高濃度組+GW9662可顯著增加細(xì)胞內(nèi)脂滴含量與熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖11和圖12所示,與海巴戟高濃度組比較,海巴戟高濃度組+GW9662可顯著降低THP-1源性巨噬細(xì)胞PPARγ、ABCA1 mRNA的表達(dá)(均P<0.05);與海巴戟高濃度組比較,海巴戟高濃度組+GW9662可顯著降低THP-1源性巨噬細(xì)胞PPARγ、ABCA1蛋白的表達(dá)(均P<0.05)。

圖10 海巴戟對(duì)GW9662預(yù)處理THP-1源性巨噬細(xì)胞后膽固醇流出的影響Fig.10 The effect of M.citrifolia on cholesterol efflux from THP-1-derived macrophages pretreated with GW9662注:A.正常對(duì)照組;B.模型組;C.海巴戟高濃度組;D.海巴戟高濃度+GW9662(下同)。I:油紅O實(shí)驗(yàn)(×200);II:22-NBD-Cholesterol細(xì)胞熒光(×200)。Note:A.Control group;B.Model group;C.M.citrifolia high dose group;D.M.citrifolia high dose + GW9662 group(the same below).I:Oil red O staining (× 200);II:22-NBD-Cholesterol fluorescence (× 200).

圖11 海巴戟對(duì)GW9662預(yù)處理THP-1源性巨噬細(xì)胞后PPARγ、ABCA1 mRNA表達(dá)的影響Fig.11 Effect of M.citrifolia on the expression of PPARγ and ABCA1 mRNA in THP-1-derived macrophages pretreated with GW9662注:與海巴戟高濃度組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05(下同)。Note:Compared with M.citrifolia high dose group,*P<0.05;Compared with the model group,#P<0.05(the same below).

圖12 海巴戟對(duì)GW9662預(yù)處理THP-1源性巨噬細(xì)胞后PPARγ、ABCA1蛋白表達(dá)的影響Fig.12 The effect of M.citrifolia on the expression of PPARγ and ABCA1 proteins in THP-1-derived macrophages pretreated with GW9662

3 討論與結(jié)論

AS是一種常見(jiàn)的心血管疾病,其快速進(jìn)展可直接促使患者發(fā)生惡性心血管事件,如心肌梗死等[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為脂質(zhì)學(xué)說(shuō)仍是AS發(fā)生的主要機(jī)制[2]。臨床上常使用他汀類(lèi)、PCSK9抑制劑等降脂藥物來(lái)延緩AS的進(jìn)展,但因這些藥物在治療劑量下仍出現(xiàn)如肌肉酸痛、肝功能損害等不良反應(yīng),使得許多患者不能耐受[8]。因此尋找新型、更安全、低毒的藥物治療AS具有積極意義。海巴戟作為新興藥食同源之品,具有廣泛的活性成分與藥理作用,符合傳統(tǒng)中藥多靶點(diǎn)、多途徑治療疾病的典型特點(diǎn)。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)海巴戟治療AS的有效成分及作用靶點(diǎn),并構(gòu)建了THP-1源性巨噬細(xì)胞模型驗(yàn)證海巴戟通過(guò)PPARγ信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出。

通過(guò)多種數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)海巴戟的有效成分進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)、苯丙素類(lèi)及酚酸類(lèi)等59個(gè)化合物主要發(fā)揮著治療AS的作用。近年來(lái)多項(xiàng)研究報(bào)道[9],黃酮類(lèi)化合物在治療AS中扮演著關(guān)鍵角色,是植物藥的主要活性部位。Sahib等[10]研究發(fā)現(xiàn)海巴戟果實(shí)中兒茶酸、槲皮素與山柰酚的含量分別為53.68 mg/g、7.4 mg/g、6.4 mg/g,在已知有活性的黃酮類(lèi)化合物中排名前三位,而這三種成分在調(diào)節(jié)血脂異常與延緩AS中作用顯著。研究發(fā)現(xiàn)[11],益心通脈顆粒主要成分兒茶酸通過(guò)分子對(duì)接和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其能直接激活PPARγ通路從而改善AS。槲皮素廣泛存在于多種植物中,而在海巴戟中含量占比顯著,Jia等[12]和Li等[13]均報(bào)道槲皮素可明顯減少高脂飲食誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠AS模型胸主動(dòng)脈斑塊含量,其機(jī)制與ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)表達(dá)增加有關(guān)。研究證實(shí)[14],山柰酚具有較強(qiáng)抗炎活性,能通過(guò)激活PI3K/AKT/Nrf2通路延緩AS進(jìn)展。

隨后在GO富集分析中發(fā)現(xiàn),海巴戟主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的膜受體以及核受體等生物學(xué)功能;KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)海巴戟治療AS與脂代謝相關(guān)信號(hào)通路有關(guān),而PPAR信號(hào)通路位列其中。研究表明[15],脂代謝相關(guān)信號(hào)通路尤其是PPAR信號(hào)通路與細(xì)胞膜的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體及細(xì)胞核內(nèi)受體關(guān)系密切。眾所周知,PPARs是位于細(xì)胞核內(nèi)一類(lèi)經(jīng)典的核受體,在接受到第二信使的信號(hào)后,通過(guò)激活下游轉(zhuǎn)錄因子,增加細(xì)胞膜上膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá),進(jìn)而減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的聚集,阻礙巨噬細(xì)胞演變?yōu)榕菽?xì)胞[16]。因此PPAR信號(hào)通路在減少脂核中泡沫細(xì)胞的形成及延緩AS扮演著重要的角色。此外,在本研究中PPARG基因亦是成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中核心網(wǎng)絡(luò)的重要節(jié)點(diǎn)。

基于上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,本研究在體外實(shí)驗(yàn)構(gòu)建THP-1源性巨噬細(xì)胞模擬粥樣斑塊中泡沫細(xì)胞[12],海巴戟干預(yù)THP-1源性巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯減少,并且細(xì)胞內(nèi)PPARγ的表達(dá)顯著上調(diào)。Inada等[17]、Nerurkar等[18]分別通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確海巴戟的降脂作用。在一項(xiàng)臨床研究中發(fā)現(xiàn)[19],海巴戟可顯著降低重度吸煙受試者血清中LDL含量,并升高其高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)的水平。最近Chong等[3]證實(shí)海巴戟可使熱氧化棕櫚油飲食誘導(dǎo)的AS大鼠模型主動(dòng)脈中脂質(zhì)斑塊明顯減少,但具體機(jī)制尚未闡明。早前,Lee等[20]使用70%甲醇萃取海巴戟果實(shí)干粉,發(fā)現(xiàn)其在C2C12骨骼肌細(xì)胞中能激動(dòng)PPARγ受體,該實(shí)驗(yàn)報(bào)道與我們結(jié)果一致。本研究首次發(fā)現(xiàn)海巴戟能促進(jìn)THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出,并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)其通過(guò)激活PPARγ信號(hào)通路發(fā)揮膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport,RCT)作用。RCT系體內(nèi)調(diào)節(jié)脂質(zhì)異常和改善AS重要機(jī)制之一,可將細(xì)胞中的膽固醇經(jīng)細(xì)胞膜上的清道夫受體轉(zhuǎn)出細(xì)胞,隨后與血漿中的載脂蛋白apoA、apoE等結(jié)合后運(yùn)輸至肝臟代謝,并轉(zhuǎn)化為膽汁酸排出體外,從而改善脂代謝異常[21]。而ABCA1作為巨噬細(xì)胞膜上重要的清道夫受體,受上游核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的精細(xì)調(diào)控,通過(guò)RCT過(guò)程負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外[16]。本研究中ABCA1的表達(dá)水平隨PPARγ的激活而上調(diào),當(dāng)使用PPARγ抑制劑GW9662時(shí),THP-1源性巨噬細(xì)胞中ABCA1受體表達(dá)升高趨勢(shì)受到抑制,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量無(wú)明顯下降,表明PPARγ介導(dǎo)的ABCA1是細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體。類(lèi)似地,槲皮素[12]、黃芩苷[22]和二氫楊梅素[23]均可通過(guò)激活PPARγ/ABCA1信號(hào)通路,促進(jìn)RCT,發(fā)揮抗AS的作用。因此,海巴戟能通過(guò)激活PPARγ信號(hào)通路促進(jìn)THP-1源性巨噬細(xì)胞的膽固醇流出。

綜上,海巴戟藥味甘、酸,藥性平和,可補(bǔ)益腎精、平補(bǔ)陰陽(yáng),預(yù)防心腦血管疾病。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)揭示了海巴戟治療AS的機(jī)制,首次證明海巴戟能促進(jìn)THP-1源性巨噬細(xì)胞膽固醇流出,并通過(guò)激活PPARγ信號(hào)通路促進(jìn)RCT。因此本研究為海巴戟有效防治AS提供新的藥理作用機(jī)制。然而本研究仍存在一些局限:(1)由于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)未納入植物藥海巴戟,因此借助CAMUP數(shù)據(jù)庫(kù)和SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)輔助篩選其活性成分。雖然有研究[24]亦借助多種數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合篩選中藥成分,但不同數(shù)據(jù)庫(kù)活性成分的篩選標(biāo)準(zhǔn)不同,所以在篩選可靠性方面有待進(jìn)一步驗(yàn)證;(2)本研究篩選了5種疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù),結(jié)果顯示各數(shù)據(jù)庫(kù)中AS靶點(diǎn)數(shù)目差異較大,可能與每種數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的病種存在差異有關(guān);(3)本課題組將在體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,進(jìn)一步構(gòu)建AS動(dòng)物模型,從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)角度為海巴戟促進(jìn)RCT延緩AS提供更加完整的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。