裴忠霞，孫晶

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001）

骨肉瘤常見于兒童、青少年以及60歲以上人群，具有預(yù)后差、致殘率高的特點(diǎn)［1］。骨肉瘤具有較高的局部侵襲和早期轉(zhuǎn)移傾向［2］。目前，有關(guān)骨肉瘤患者的治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療和新輔助化療等，很大程度上改善了骨肉瘤患者的預(yù)后［3］，但轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性骨肉瘤的預(yù)后仍不理想，5年生存率僅為50%［4］。因此，探索骨肉瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)制，尋找相關(guān)預(yù)后指標(biāo)，有助于為轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的治療提供新的靶點(diǎn)。

近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于生物信息學(xué)方法進(jìn)行的大數(shù)據(jù)挖掘分析被廣泛用于探索腫瘤的診斷和預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物［5］。本研究使用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫 （Gene Expression Omnibus，GEO）和TARGET等公共數(shù)據(jù)庫篩選和分析骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因 （differentially expressed genes，DEGs），探討其對(duì)骨肉瘤患者預(yù)后的影響，為骨肉瘤轉(zhuǎn)移的分子診斷研究和臨床治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

從GEO （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 中篩選骨肉瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的數(shù)據(jù)集，獲取符合研究的基因芯片數(shù)據(jù)集GSE21257，芯片平臺(tái)為GPL10295。該數(shù)據(jù)集包含5年內(nèi)未發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者樣本19例和5年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者樣本34例，根據(jù)轉(zhuǎn)移情況將樣本分為未轉(zhuǎn)移組和轉(zhuǎn)移組。

1.2 篩選2組樣本之間的DEGs

采用GEO2R （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/） 在線分析工具檢測(cè)未轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組樣本之間的DEGs。具體篩選標(biāo)準(zhǔn)為調(diào)整后P< 0.05且log2|FC| > 1。DEGs結(jié)果通過火山圖和熱圖分別表示。

1.3 DEGs的相關(guān)功能富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫 （https：//david.ncifcrf.gov/） 對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體 （Gene Ontology，GO） 功能注釋和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 分析。其中 GO 分析包括生物過程 （biological process，BP）、細(xì)胞成分 （cellular component，CC） 和分子功能 （molecular function，MF）。以調(diào)整后P< 0.05為條件，篩選有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白質(zhì)功能和相關(guān)信號(hào)通路。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 （protein-protein interation，PPI） 網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因的篩選

為了明確DEGs的蛋白質(zhì)之間相互作用關(guān)系，采用STRING （https：//string-db.org） 數(shù)據(jù)庫建立DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)。篩選最低交互分?jǐn)?shù)> 0.4的相互作用蛋白，隨后將得到的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape軟件（v3.9.1），按照Betweenness Centrality （BC） 數(shù)值的大小繪制PPI同心圓，隨后使用cytoHubba插件按照度值算法選取 PPI 圖中排名前5的關(guān)鍵基因用于骨肉瘤的生存等相關(guān)研究。

1.5 采用TARGET數(shù)據(jù)庫分析骨肉瘤患者的生存差異

TARGET （https：//ocg.cancer.gov/programs/target/） 是目前最大的兒童腫瘤數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫納入了87例骨肉瘤患者完整的生存數(shù)據(jù) （其中1例數(shù)據(jù)不完整，下載時(shí)間為2022年11月10日）。從TARGET數(shù)據(jù)庫中獲得了骨肉瘤患者的基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)矩陣。多基因相關(guān)性圖通過R軟件包pheatmap進(jìn)行展示，基因的單因素Cox分析通過R軟件包forestplot進(jìn)行實(shí)現(xiàn)。將關(guān)鍵基因的表達(dá)按照高低進(jìn)行分組，通過R軟件包survival分析關(guān)鍵基因?qū)侨饬龌颊哳A(yù)后的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 9.4.1 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，采用單因素Cox回歸分析關(guān)鍵基因?qū)颊哳A(yù)后的影響，采用Spearman相關(guān)性分析檢驗(yàn)關(guān)鍵基因之間的相關(guān)性，log-rank用于檢驗(yàn)Kaplan-Meier （K-M） 曲線生存分析，比較2組之間的生存差異。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的分析和篩選

GEO2R在線分析共得到55個(gè)DEGs。其中下調(diào)基因22個(gè)，上調(diào)基因33個(gè)。分別繪制DEGs的火山圖（圖1A） 和前10個(gè)上調(diào)差異基因與前10個(gè)下調(diào)差異基因的熱圖 （圖1B）。

圖1 GSE21257芯片數(shù)據(jù)中DEGs的火山圖和熱圖Fig.1 Volcano plot and heat map of DEGs in the GSE21257 gene microarray

2.2 GO功能富集和KEGG通路富集分析

通過DAVID在線數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)DEGs進(jìn)行GO和KEGG分析，按照調(diào)整后P值大小排序，分別選取排名前3位BP、CC、MF和KEGG通路，見表1。功能注釋結(jié)果顯示，BP方面，差異基因主要參與抗原加工和外源肽抗原通過MHC Ⅱ類呈遞，肽抗原與MHCⅡ類蛋白復(fù)合體組裝，免疫球蛋白的產(chǎn)生參與免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)；CC方面，差異基因主要參與MHC Ⅱ類蛋白復(fù)合體，膜泡運(yùn)輸，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的整體成分；MF方面，差異基因主要參與MHC Ⅱ類蛋白復(fù)合體結(jié)合，MHC Ⅱ類受體活性，肽抗原結(jié)合。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要參與黃色金葡萄球菌感染、哮喘和Ⅰ型糖尿病。

表1 差異表達(dá)基因的 GO功能富集和KEGG通路富集分析Tab.1 GO functional and KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 PPI分析與關(guān)鍵基因篩選

將GSE21257數(shù)據(jù)集的55個(gè)DEGs導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)定篩選閾值為0.4，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共得到53個(gè)節(jié)點(diǎn)和178條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為6.72，見圖2A。隨后，將STRING數(shù)據(jù)庫分析的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系文件結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析，并以BC值大小繪制同心圓。隨后用cytoHubba 插件，根據(jù)度值得出排名前5位的關(guān)鍵基因?yàn)門YROBP、ITGB2、C1QB、C1QC、CD74，5個(gè)關(guān)鍵基因在骨肉瘤轉(zhuǎn)移樣本中均下調(diào)，見圖2B。

圖2 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)圖和5個(gè)關(guān)鍵基因Fig.2 PPI network diagram of differentially expressed genes and five key genes

2.4 關(guān)鍵基因在骨肉瘤樣本中的相關(guān)性分析和生存分析

將TARGET數(shù)據(jù)庫骨肉瘤樣本基因表達(dá)矩陣和臨床信息數(shù)據(jù)下載后，通過R軟件包pheatmap分析關(guān)鍵基因在骨肉瘤樣本中的相關(guān)性，結(jié)果顯示，5個(gè)關(guān)鍵基因TYROBP、ITGB2、C1QB、C1QC、CD74在骨肉瘤樣本中均呈正相關(guān) （圖3A）。通過分析TARGET數(shù)據(jù)庫骨肉瘤患者的生存模型，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因TYROBP、C1QB和CD74的表達(dá)與骨肉瘤患者的預(yù)后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖3B （P< 0.05），此外，CD74與骨肉瘤患者的無病生存期 （disease free survival，DFS）相關(guān)，見圖3C （P< 0.05）。進(jìn)一步進(jìn)行K-M生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)TYROBP、C1QB和CD74組總生存期（overall survival，OS） 較長(zhǎng) （P< 0.05），CD74基因的上調(diào)使骨肉瘤患者有良好的DFS （P< 0.05），預(yù)后較好，見圖4。

圖3 關(guān)鍵基因在骨肉瘤樣本中的相關(guān)性和基因單因素Cox分析Fig.3 Correlation and gene univariate Cox analysis of key genes in osteosarcoma samples

圖4 與預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因的生存曲線分析Fig.4 Survival curve analysis of key genes associated with prognosis

3 討論

骨肉瘤起源于骨髓中的一個(gè)單細(xì)胞，最終會(huì)產(chǎn)生一個(gè)多克隆的、異質(zhì)性的腫瘤塊，被認(rèn)為是分子畸變方面最復(fù)雜的癌癥之一［6］。如果不及時(shí)治療，90%的骨肉瘤患者將死于肺轉(zhuǎn)移［7］。骨肉瘤最常見于股骨遠(yuǎn)端，其次為脛骨近端和肱骨近端［8］。最初針對(duì)骨肉瘤的治療主要是外科手術(shù)，但致殘率較高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量且早期極易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移［9］。20世紀(jì)初，隨著化療技術(shù)的不斷更新，手術(shù)聯(lián)合化療使骨肉瘤患者的5年生存率提高至52%［9］。然而，由于骨肉瘤的惡性程度高易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，患者的OS仍遠(yuǎn)不能令人滿意，尤其是晚期骨肉瘤患者。因此，一些針對(duì)骨肉瘤發(fā)展過程的新療法，如抗血管生成藥物和免疫療法已被應(yīng)用于骨肉瘤的臨床治療，但其效性和潛在機(jī)制仍不清楚［4］。深入了解骨肉瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子病理機(jī)制，有助于篩選骨肉瘤早期診斷、靶向及免疫治療和預(yù)后分析的關(guān)鍵分子或生物標(biāo)志物。

本研究基于生物信息學(xué)分析方法，首先將GSE21257芯片數(shù)據(jù)集［10］5年內(nèi)未發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者與5年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者的全基因組基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，篩選出55個(gè)DEGs。通過GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與MHC Ⅱ類蛋白復(fù)合體組裝，免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，MHC Ⅱ類受體活性，肽抗原結(jié)合等。這一結(jié)果提示參與抗原呈遞基因的失調(diào)可能是骨肉瘤發(fā)生的早期事件，MHC Ⅱ只在抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞［11］?？乖蔬f細(xì)胞通過將MHC Ⅱ與多肽結(jié)合，向輔助T細(xì)胞呈現(xiàn)外源性多肽或內(nèi)源性多肽，從而告知機(jī)體正在被入侵［12］。信號(hào)通路方面主要參與金黃色葡萄球菌感染、哮喘和Ⅰ型糖尿病等。與本研究結(jié)果一致，TUOHY等［13］發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌感染會(huì)上調(diào)骨肉瘤患者炎癥免疫反應(yīng)，從而抵消骨肉瘤引起的免疫抑制，為優(yōu)化炎癥刺激以觸發(fā)抗骨肉瘤巨噬細(xì)胞反應(yīng)提供了一種潛在的治療策略。

利用PPI分析對(duì)差異基因進(jìn)一步篩選得到5個(gè)骨肉瘤轉(zhuǎn)移關(guān)鍵基因：TYROBP、ITGB2、C1QB、C1QC和CD74。研究［14-15］發(fā)現(xiàn)TYROBP和ITGB2的高表達(dá)與骨肉瘤患者更好的OS相關(guān)，是預(yù)測(cè)骨肉瘤的獨(dú)立預(yù)后因素。另有研究［16-17］表明關(guān)鍵基因C1QB、C1QC和CD74可能是骨肉瘤免疫微環(huán)境重構(gòu)的潛在指標(biāo)，有助于預(yù)測(cè)骨肉瘤患者的預(yù)后。通過分析TARGET數(shù)據(jù)庫中骨肉瘤患者的臨床數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因在骨肉瘤樣本中均呈正相關(guān)，其中TYROBP、C1QB和CD74的高表達(dá)與骨肉瘤患者良好的OS相關(guān)，此外，CD74的高表達(dá)提示骨肉瘤患者的DFS較長(zhǎng)。

綜上所述，本研究通過生物信息方法篩選出骨肉瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因TYROBP、C1QB和CD74，在5年內(nèi)發(fā)生骨肉瘤轉(zhuǎn)移的樣本中均呈現(xiàn)低表達(dá)，可能與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。這些結(jié)果表明TYROBP、C1QB和CD74在骨肉瘤患者良好的預(yù)后中起到關(guān)鍵作用。但考慮到上述研究為數(shù)據(jù)挖掘形式，具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。