陳瑛，曹愛麗

（上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院腎內科，上海 200062）

糖尿病的患病率逐年攀升，糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是其最常見的并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計，約1/3 的1 型糖尿病患者和1/2 的2 型糖尿病患者進展為DKD［1］，DKD 患病率將隨著全球糖尿病患病率的上升而增加，預計在2045 年將增加近50%［2］?？刂蒲恰⒀獕汉驼{整生活方式是DKD的基本治療策略。近年來，新型降糖藥物不斷涌現(xiàn)，如鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2（sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2）抑制劑、胰高血糖素樣肽1 受體（glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R）激動劑和二肽基肽酶4 抑制劑以及新一代鹽皮質激素受體拮抗劑，這些藥物在控制血糖的同時具有良好的腎保護作用。非糖尿病患者中使用SGLT2 和GLP-1R激動劑也能獲得心腎保護作用［3-5］。提示除高血糖外還存在其他推動DKD發(fā)展的關鍵因素。

有研究表明，脂代謝紊亂與腎功能障礙及其他與DKD 相關的病理改變有關［6］。當人體能量攝入逐漸超過身體在脂肪組織中儲存脂肪的能力時，非脂肪組織如肌肉、肝和腎等部位發(fā)生脂質沉積。值得注意的是，腎細胞對DKD的脂質沉積表現(xiàn)出不同程度的敏感性，其中足細胞對脂質沉積尤為敏感［7］。足細胞是腎小囊臟層上皮細胞，附著于腎小球基底膜外，其損傷被認為是DKD病理機制中的一個重要事件［8］。代謝紊亂、血流動力學異常、炎癥和氧化應激等因素均可引起足細胞肥大，上皮間充質轉化，并隨著DKD的進展出現(xiàn)足細胞脫落或凋亡，導致腎小球濾過屏障破壞，引起大量尿蛋白產生，繼而導致炎癥級聯(lián)反應，腎纖維化發(fā)生，最后發(fā)展為終末期腎臟疾?。?］。表明足細胞的完整性和生理功能對于延緩DKD 至關重要。高脂環(huán)境引起的足細胞脂質沉積可通過激活炎癥、氧化應激和細胞凋亡等途徑造成足細胞損傷［10］。故尋找改善DKD 足細胞脂質沉積的有效藥物和靶點具有重要臨床意義。

利拉魯肽（liraglutide）是一種GLP-1R 激動劑，臨床主要用于治療2 型糖尿病，同時也可減輕2 型糖尿病患者的腎功能惡化和發(fā)展為終末期腎病的風險［11-12］。據(jù)2021 年美國糖尿病協(xié)會指南和中國糖尿病腎病防治指南，GLP-1R 激動劑可作為治療2 型糖尿病和DKD 患者的首選藥［13］。同時，利拉魯肽對脂質代謝具有一定作用，可減輕2 型糖尿病患者內臟脂肪和異位脂質沉積，降低2 型糖尿病患者和肥胖青少年體重［14-16］。有研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽通過上調2 型糖尿病大鼠腎中AMP 活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）磷酸化抑制大鼠腎脂質沉積，并在一定程度上改善糖尿病大鼠腎功能［17］。然而利拉魯肽調控足細胞脂質沉積的具體作用機制尚不明確。

CXC趨化因子配體16（CXC chemokine ligand 16，CXCL16）是一種趨化因子，可通過激活炎癥通路、上調細胞表面清道夫受體、誘導參與脂肪酸合成和儲存的酶的表達等方式促進細胞中的脂質沉積。腎其他細胞脂質的攝取往往依賴于CD36，而足細胞中的脂質攝取卻有賴于CXCL16 的功能［18］。臨床研究表明，血清或尿液中CXCL16 的表達水平可作為2型糖尿病患者腎損傷及預測蛋白尿的新型標志物［19-21］。沉默CXCL16 表達可減輕氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）對小鼠足細胞的損傷［22-23］。說明CXCL16 攝取脂質進入細胞是造成足細胞脂質沉積并引起損傷的關鍵因子。他汀類藥物具有顯著的降脂作用，多項脂代謝異常的研究常將辛伐他?。╯imvastatin）作為陽性對照藥，這已在科學界得到廣泛的認可［24-27］。此外，辛伐他汀表現(xiàn)出顯著的足細胞保護作用，可通過抑制足細胞CXCL16 的表達減少足細胞對ox-LDL 的攝取進而發(fā)揮腎保護作用［22，28］。本研究首先通過高糖和棕櫚酸模擬DKD 糖脂代謝紊亂環(huán)境，觀察足細胞CXCL16 的表達水平。并通過外源性給予重組CXCL16 觀察其對足細胞標志蛋白表達、細胞骨架、脂質沉積及炎癥因子表達的影響，探討利拉魯肽對CXCL16 誘導的足細胞損傷和脂質沉積的作用及機制，進一步為利拉魯肽在DKD的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

重組CXCL16（美國Pepro Tech 公司，批號300-55），預先用純水配制成100 mg·L-1的儲備液，使用時1∶1000 稀釋；利拉魯肽（美國MedChem Express 公司，批號HY-P0014），預先用二甲亞砜（DMSO）配制成10，50 和100 μmol·L-1儲存液，使用時1∶1000稀釋；辛伐他?。绹鳰edChem Express公司，批號HY-17502），預先用DMSO 配置成100 μmol·L-1的儲存液，使用時1∶1000 稀釋。棕櫚酸和D-（+）-葡萄糖（美國Sigma 公司，批號P050，G8270）。澳洲胎牛血清（美國Hyclone 公司，批號SH30084.03）；RPMI-1640 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素（雙抗）混合液、胰島素-轉鐵蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium Supplement，ITS-G）（美國Gibco公司，批號C11875500BT，15070063，41400045）；增強型RIPA 裂解液（武漢博士德生物工程有限公司，批號AR0102）；BCA 蛋白定量試劑盒和SDSPAGE 膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號P0011，P0012）；彩色預染蛋白Marker（美國ThermoFisher 公司，批號26616）；PVDF 膜（美國Millipore 公司，批號IPVH00010）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的ELISA 檢測試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號EHC103aQT，EHC107b，EHC002bQT）；PCR 引物〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕；兔抗人裂隙素單克隆抗體、鼠抗人β-肌動蛋白抗體、CytoPainter Phalloidin-iFluor 594 試劑和油紅O 染色試劑盒〔艾博抗（上海）貿易有限公司，批號ab216341，ab6276，ab176757，ab150678〕；兔抗人CXCL16 多克隆抗體（Affinity Biosciences 公司，批號DF3312）；兔抗人膽固醇調節(jié)元件結合蛋白1（sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1）、SREBP 2 和脂肪分化相關蛋白（adipose differentiation-related protein，ADRP）多克隆抗體（一抗）（美國Protein Tech公司，批號14088-1-AP，28212-1-AP，15294-1-AP）；HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體（二抗）（美國CST 公司，批號7074P2）；PCR 提取試劑盒、反轉錄試劑盒和PCR試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

永生化人足細胞由美國西奈山醫(yī)學院何慈江教授惠贈。人足細胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%澳洲胎牛血清、1%雙抗、1% ITS-G）于33 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合度達70%時轉入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)分化7 d 用于實驗，分化時所用RPMI-1640完全培養(yǎng)基不含ITS-G。

細胞分組：分組①細胞對照組、棕櫚酸組（250 μmol·L-1）、正常糖組（葡萄糖5 mmol·L-1）、甘露醇組（葡萄糖5 mmol·L-1+甘露醇35 mmol·L-1）和高糖組（葡萄糖40 mmol·L-1），其中棕櫚酸作用6 h，高糖作用24 h；分組②CXCL16 100 μg·L-1分別處理細胞6，12 和24 h 組；分組③細胞對照組、CXCL16 100 μg·L-1組、CXCL 16+利拉魯肽10，50和100 nmol·L-1組及CXCL 16+辛伐他汀100 nmol·L-1組；分組④細胞對照組、CXCL16 100 μg·L-1組、CXCL 16+利拉魯肽100 nmol·L-1組及CXCL 16+辛伐他汀100 nmol·L-1組。在分組③和④中，除細胞對照組外，各組預先給藥2 h 后再給予CXCL16 100 μg·L-1繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 油紅O染色檢測人足細胞內脂滴面積比

取1.2 分組③處理的細胞，吸棄培養(yǎng)液并用PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛固定后以PBS 清洗3 次，丙二醇室溫孵育5 min，再以油紅染料60 ℃孵育10 min。吸盡丙二醇后再以85%丙二醇溶液室溫孵育1 min，蒸餾水沖洗2次后蘇木素染色1 min，流水沖洗返藍，甘油封片后倒置顯微鏡觀察染色結果，脂滴呈橘紅色至鮮紅色。采集照片后使用Image J 軟件分析，以油紅染色陽性區(qū)域面積與照片總面積比值表示脂滴面積比。

1.4 鬼筆環(huán)肽染色檢測人足細胞F-肌動蛋白應力纖維百分比

取1.2 分組④細胞，嚴格按照CytoPainter Phalloidin-iFluor 594 試劑說明書操作進行鬼筆環(huán)肽染色，染色完成后于激光共聚焦顯微鏡觀察染色結果，細胞內絲狀F-肌動蛋白呈紅色，細胞核呈藍色。采集照片后使用Image J軟件分析，以單個細胞F-肌動蛋白染色陽性區(qū)域熒光強度總和占該細胞面積的百分比表示F-肌動蛋白應力纖維百分比。

1.5 ELlSA 檢測人足細胞培養(yǎng)液中TNF-α，TGF-β和lL-1β濃度

取1.2 分組④處理后的細胞嚴格按照試劑盒說明書操作檢測足細胞培養(yǎng)液中TNF-α，TGF-β和IL-1β的濃度。

1.6 實時熒光定量PCR 檢測人足細胞中TNF-α，TGF-β和IL-1β mRNA 水平

取1.2 分組④處理的細胞，吸棄培養(yǎng)液并用預冰的PBS清洗2次后，嚴格按照RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒提取RNA 和合成cDNA。按照說明書配制反應體系，在qPCR 儀器上進行PCR 擴增。反應條件：95 ℃預變性15 min，PCR 反應40 個循環(huán)，95 ℃變性10，60 ℃退火/延伸30 s。最終計算結果用β-肌動蛋白標準化目的基因的相對表達，2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達水平。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequences for real time quantitative PCR

1.7 Western 印跡法檢測人足細胞中CXCL16、裂隙素、SREBP1、SREBP2和ADRP蛋白水平

取1.2①②④分組處理的細胞，棄去培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)基，用預冷的PBS 清洗2 次，吸盡PBS后加入RIPA 裂解液（含PMSF、蛋白酶/磷酸酶抑制劑）冰上裂解20 min，收集樣品于1.5 mL EP 管，13 800×g，4 ℃離心15 min，取上清；BCA 法蛋白定量變性后取15 μg 樣品上樣。8% SDS-PAGE 電泳分離蛋白后轉至PVDF膜，5% BSA室溫封閉1 h；按照說明書稀釋一抗4 ℃過夜孵育（CXCL16、裂隙素、SREBP1、SREBP2、ADRP 和β-肌動蛋白稀釋比為1∶10 000，脂肪分化相關蛋白（一抗）稀釋比1∶500），次日TBST 洗膜3 次后加二抗（稀釋比1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST 再次洗膜3 次后顯影。運用Image J 軟件分析，以目的蛋白與內參蛋白積分吸光度值比值表示蛋白的相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據(jù)用±s，使用GraphPad Prism 9軟件進行統(tǒng)計分析，通過單因素方差分析（Oneway ANOVA）進行多組間檢驗比較組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高糖和棕櫚酸對人足細胞CXCL16 蛋白表達的影響

Western 印跡結果（圖1）顯示，與細胞對照組相比，棕櫚酸組足細胞的CXCL16 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與正常糖相比，高糖組足細胞CXCL16 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），甘露醇組無顯著差異。

Fig.1 Effects of high glucose（HG）and palmitic acid（PA）on expression of CXC-chemokine ligand 16（CXCL16）in human podocytes by Western blotting.Cells were treated with PA 250 μmol·L-1 for 6 h or glucose 40 mmol·L-1（HG）for 24 h.Cells in the normal glucose（NG）group were treated with glucose 5 mmol·L-1 for 24 h.Cells in the mannitol（Mn）group were treated with a mixture of glucose 5 mmol·L-1+mannitol 35 mmol·L-1 for 24 h to exclude the effect of osmolarity on podocytes.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with NG group.

2.2 CXCL16對人足細胞裂隙素表達的影響

Western 印跡結果（圖2）顯示，與細胞對照組相比，CXCL16 100 μg·L-1作用6，12 和24 h 組足細胞裂隙素蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.01）。提示外源性給予CXCL16可引起足細胞損傷。

Fig.2 Effect of CXCL16 on nephrin expression in human podocytes by Western blotting.The cells were treated with CXCL16 100 μg·L-1 for 0（cell control）6，12 and 24 h，respectively.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with 0 h group.

2.3 利拉魯肽對CXCL16 誘導的人足細胞脂質沉積的影響

油紅O 染色結果顯示（圖3），與細胞對照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細胞脂滴面積比顯著升高（P＜0.01），表明CXCL16 可以誘導足細胞脂質沉積。與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽10，50 和100 nmol·L-1組及CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細胞油脂滴面積比顯著降低（P＜0.01），表明利拉魯肽可以改善CXCL16 誘導的人足細胞脂質沉積。

Fig.3 Effect of liraglutide on CXCL16-induced lipid deposition in human podocytes.After two hours of treatment with liraglutide 10，50 and 100 nmol·L-1 or simvastatin 100 nmol·L-1，the podocytes were stimulated with CXCL16 100 μg·L-1 for 24 h.Oil red O staining was used to detect the level of lipid droplets in human podocytes.B was the quantification of A.The number of observation positions for each treatment was chosen from a minimum of three fields.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with CXCL16 100 μg·L-1 group.

2.4 利拉魯肽對CXCL16 誘導的人足細胞F-肌動蛋白應力纖維百分比的影響

鬼筆環(huán)肽染色結果（圖4）顯示，與細胞對照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細胞應力纖維百分比顯著下降（P＜0.01），與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽100 nmol·L-1組和CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細胞應力纖維百分比顯著升高（P＜0.01），表明CXCL16 干預可引起人足細胞F-肌動蛋白受損，而利拉魯肽可以改善該損傷。

Fig.4 Effect of liraglutide on the cytoskeleton of CXCL16-stimulated human podocytes.See Fig.3 for the cell treatment.Red fluorescence represents Phalloidin and blue fluorescence indicates a DAPI-stained nucleus.B was the quantification of A.Percentage of F-actin stress fibers（%）=Sum of fluorescencenintensity in regions of F-actin staining positive for individuat cell/area of the cell×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with CXCL16 100 μg·L-1 group.

2.5 利拉魯肽對CXCL16 刺激下人足細胞培養(yǎng)液中TNF-α，TGF-β和lL-1β蛋白濃度的影響

ELISA 實驗結果（表2）顯示，與細胞對照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細胞培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α，TGF-β 和IL-1β 蛋白濃度顯著升高（P＜0.01）。與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽100 nmol·L-1組和CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細胞培養(yǎng)液TNF-α，TGF-β 和IL-1β 濃度顯著降低（P＜0.01）；表明利拉魯肽可以抑制CXCL16引起的足細胞炎癥水平升高。

Tab.2 Effect of liraglutide on secretion of TNF-α，TGF-β and lL-1β in CXCL16-stimulated human podocytes

2.6 利拉魯肽對CXCL16 刺激下人足細胞TNF-α，TGF-β和IL-1β mRNA表達的影響

實時熒光定量PCR 結果（表3）顯示，與細胞對照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細胞中炎癥因子TNF-α，TGF-β和IL-1βmRNA 水平顯著增多（P＜0.05，P＜0.01）；與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽100 nmol·L-1組和CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細胞中炎癥因子TNF-α，TGF-β和IL-1βmRNA 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。表明利拉魯肽可以抑制CXCL16 引起的炎癥水平升高。

Tab.3 Effect of liraglutide on mRNA levels of TNF-α，TGF-β and IL-1β in CXCL16-stimulated human podocytes

2.7 利拉魯肽對CXCL16 刺激下人足細胞裂隙素表達的影響

Western 印跡結果（圖5）顯示，與細胞對照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細胞裂隙素的表達水平顯著降低（P＜0.01）；與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽100 nmol·L-1組和CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細胞裂隙素的表達水平顯著升高（P＜0.01）；表明CXCL16 可以引起足細胞損傷，利拉魯肽可逆轉該損傷。

Fig.5 Effect of liraglutide on nephrin expression in CXCL16-induced human podocytes by Western blotting.See Fig.3 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with CXCL16 100 μg·L-1 group.

2.8 利拉魯肽對CXCL16 刺激下足細胞SREBP1，SREBP2和ADRP蛋白表達的影響

Western 印跡結果（圖6）顯示，與細胞對照組相比，CXCL16 100 μg·L-1組足細胞中SREBP1，SREBP2 和ADRP 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與CXCL16 100 μg·L-1組相比，CXCL16+利拉魯肽100 nmol·L-1組和CXCL16+辛伐他汀100 nmol·L-1組足細胞中SREBP1，SREBP2 和ADRP表達水平顯著降低（P＜0.01）。

Fig.6 Effect of liraglutide on cholesterol regulatory element binding protein 1（SREBP1），SREBP2 and adipose differentiation-related protein（ADRP）expressions in CXCL16-induced human podocytes by Western blotting.See Fig.3 for the cell treatment.B，C and D were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01 compared with CXCL16 100 μg·L-1 group.

3 討論

本研究結果顯示，通過高糖或棕櫚酸模擬DKD糖脂代謝異常刺激足細胞，均可引起足細胞CXCL16 表達水平的顯著升高。表明CXCL16 在DKD 足細胞損傷中發(fā)揮重要作用。CXCL16 是足細胞攝取ox-LDL 的主要受體，ox-LDL 損害小鼠足細胞裂隙素的表達與CXCL16 有關［28］。裂隙素是一種特殊的腎小球黏附蛋白，在腎小球足細胞表面表達，參與腎小球裂隙膜的構成，對維持腎小球濾過及預防蛋白尿至關重要［29］。本研究結果顯示，外源性給予重組CXCL16 刺激人足細胞，可引起人足細胞裂隙素的表達下調，說明CXCL16在DKD足細胞損傷中的重要作用。

有研究表明，DKD 與脂質代謝異常和脂質沉積有關［30］。除降糖作用外，利拉魯肽可以有效降低甘油三酯、低密度脂蛋白等的水平，在調節(jié)脂代謝紊亂方面具有一定潛能［31］。本研究的結果表明，外源性給予CXCL16 可引起足細胞脂質沉積明顯增多，利拉魯肽可改善CXCL16 誘導的足細胞脂質沉積，與辛伐他汀效果相當，表明利拉魯肽具有抗足細胞脂質沉積的作用。同時，本研究結果還顯示，利拉魯肽和辛伐他汀均可恢復CXCL16 引起的足細胞裂隙素表達下調和足細胞骨架受損，說明利拉魯肽抗脂代謝可減輕足細胞損傷程度。

過多的脂質在細胞中積累時會通過各種機制導致炎癥信號的激活，引起IL-1β，IL-18，TNF-α 和IL-6 等各種促炎癥細胞因子的產生和釋放［32］。在本研究中，CXCL16引起足細胞脂質沉積的同時，炎癥因子TNF-α，TGF-β 和IL-1β 的分泌和mRNA 表達水平也顯著升高，利拉魯肽或辛伐他汀干預可顯著改善這一變化，說明利拉魯肽改善足細胞脂質沉積也進一步改善了脂質沉積激活的炎癥反應。

SREBP 和ADRP 是介導脂肪酸的攝取、合成和氧化失衡以及脂代謝紊亂的重要分子［7］。SREBP是一類轉錄因子，包括SREBP1 和SREBP2 亞型，SREBP1 主要負責調控參與脂肪酸和甘油三酯合成的靶基因，而SREBP2 則負責參與膽固醇代謝基因的異常激活［33］。ADRP 主要參與細胞內脂質代謝和運輸，可以結合游離脂肪酸和脂質滴泡，從而促進脂質合成和儲存［34］。DKD 中發(fā)現(xiàn)脂質沉積引起腎小球ADRP 表達顯著上調伴隨足細胞標志蛋白足細胞素、裂隙素表達下調［35］。此外，在脂代謝異常引起的足細胞損傷中發(fā)現(xiàn)細胞骨架受損，可能與SREBP 表達異常相關［17］。本研究結果顯示，CXCL16可引起足細胞SREBP1，SREBP2和ADRP的表達顯著升高，利拉魯肽和辛伐他汀均可降低其表達水平，表明利拉魯肽可通過抑制SREBP 和ADRP 的表達抑制足細胞脂質沉積的發(fā)生，減輕足細胞損傷。

綜上所述，CXCL16 在DKD 足細胞損傷中發(fā)揮重要作用，可誘導DKD足細胞脂質沉積的發(fā)生。利拉魯肽可通過抑制CXCL16 誘導的脂質沉積減輕足細胞損傷程度，并緩解脂質沉積引起的炎癥激活，這可能與利拉魯肽能夠抑制SREBP 和ADRP的表達有關。