吳會會,吳強盛

(長江大學園藝園林學院/長江大學根系生物研究所,湖北荊州,434025)

近年來由于工業(yè)污染加劇、化肥過量施用和灌溉不當等原因[1]造成地表鹽分不斷沉積,土壤鹽漬化日趨嚴重,極大地限制了作物生長發(fā)育和農林經濟持續(xù)發(fā)展,已成為全球性的土壤生態(tài)問題。鹽脅迫造成植物滲透調節(jié)失衡、離子毒害和氧化脅迫等損害,從而導致植物生長受限,生物量減少[2]。叢枝菌根真菌(AMF)能與大多數植物根系建立良好的互利共生關系,在植物根際形成龐大的菌絲網絡,擴大根系的吸收面積,促進宿主植物對礦質元素和水分的吸收,增強植物的抗性[1]。鹽漬化根際土壤中存在豐富的AMF,說明AMF對鹽漬化土壤的適應性好[1-2]。

AMF增強宿主植物耐鹽性,與以下幾種機制有關。(1)調節(jié)滲透平衡。菌根化植物根際周圍形成龐大的菌絲網,能夠延伸到植物根系無法到達的區(qū)域,擴大了根系吸收范圍,增強了水分和礦質元素吸收能力,以維持滲透平衡。研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下接種AMF有效提高了沙棗[3]和羊草[4]中K+含量和K+/Na+比值,抑制了Na+積累,從而緩解了Na+對植物的毒害[3-4]。鹽脅迫下接種AMF,還促進了羊草對N和P的吸收[4],增強了柑桔對P、K、Fe、Cu、Mg的吸收[5],增加了蒲公英中Mg、Cu、Zn、Fe的含量[6],促進了可溶性糖、脯氨酸等小分子可溶性有機物質的積累[7-8],從而有利于降低滲透勢,調節(jié)滲透平衡。(2)提高植物的抗氧化能力。接種AMF的番茄隨著鹽脅迫處理時間的延長,超氧化物歧化酶(SOD)活性先升后降,而過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性一直呈上升趨勢[9]。接種AMF提高了鹽脅迫下芹菜的SOD、POD和CAT活性[10],而抗氧化酶活性增強能有效清除活性氧,抑制植物細胞膜脂過氧化水平,從而提高植物的耐鹽性。(3)調節(jié)激素水平。崔令軍等[11]的研究發(fā)現(xiàn),接種AMF顯著提高了鹽脅迫下楨楠GA3、IAA、ZR含量,降低了ABA含量,從而促進根系生長。(4)其他。例如調控脅迫響應相關的基因和蛋白質。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn),接種AMF影響番茄水孔蛋白和抗氧化基因的表達,增加番茄對鹽脅迫的耐受性。

柑桔是世界第一大果樹,中國柑桔的栽培面積和產量位于全球首位[13]。在中國柑桔的主產區(qū),鹽害現(xiàn)象時有發(fā)生,其原因是多方面的。浙江、福建、廣東和海南等沿海地區(qū)桔園由于處于濱海鹽堿地而產生鹽毒害[14]。四川、重慶和秦嶺南麓產區(qū)桔園土壤大多屬于石灰性土壤,鹽堿化程度高[13]。另外一些柑桔主產區(qū)處于干旱和半干旱地區(qū),且位于丘陵山地,干旱迫使水分蒸發(fā)將土壤深處的鹽離子帶到土壤表層,不利于柑桔生長[14]。此外,工業(yè)污染、灌溉不當和化肥過量使用等人為原因也造成了土壤次生鹽漬化程度加劇[1,14]。柑桔是嫁接類果樹,其砧木的耐鹽性對柑桔植株的生長起關鍵作用。枳(PoncirustrifoliataL. Raf)是柑桔嫁接廣泛使用的砧木,其根毛少,對鹽漬化土壤敏感。目前關于接種AMF對枳耐鹽性的研究報道較少。本試驗在盆栽鹽脅迫(NaCl溶液處理)條件下,研究接種AMF對枳實生苗植株生長、根系發(fā)育、光合色素含量、糖含量、活性氧含量和抗氧化酶活性的影響,探討AMF在提高枳實生苗耐鹽性方面的作用,以期為鹽漬土柑桔促生長技術的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和處理供試菌種為摩西管柄囊霉Funneliformismosseae(Nicol. &Gerd.),由中國叢枝菌根真菌種質資源庫(BGC)提供,經白三葉擴繁3個月后備用。

頭年10月采摘成熟枳果實,保存在4 ℃冰箱備用,翌年2月剝取種子,選飽滿種子用75%酒精消毒10 min,蒸餾水潤洗之后,播在高壓滅菌的河砂(≤2 mm)中,于晝/夜溫度為28 ℃/20 ℃、相對濕度為80%的光照培養(yǎng)箱中催芽,待4葉齡時移栽(上盆)。

在長江大學園藝園林學院玻璃溫室內進行盆栽。溫室基本環(huán)境條件:光合作用的光子通量密度為338～982 μmol/(m2·s),晝/夜溫度為(20～35) ℃/(15～26) ℃(16 h/8 h),相對濕度為70%～95%。盆栽基質為土和砂(4∶1,V/V)的混合物,經過高壓蒸汽滅菌(0.11 MPa,121 ℃,2 h)使土和砂中的土著菌根真菌孢子失活。土采自長江大學落葉果樹基地。砂采自于長江邊,為直徑<4 mm的河砂。塑料盆規(guī)格為上口徑19.5 cm,下口徑11.5 cm,高15.5 cm。選取長勢一致的4葉齡枳苗移栽到裝有2.5 kg基質的塑料盆中,每盆4株。移栽時,用“分層接種”法施入120 g菌劑(內含1 800個孢子)/盆作為接種處理(+AMF),不接種處理(-AMF)為施入等量滅菌菌劑。移栽后,所有植株均放置在玻璃溫室中,在正常水分(土壤最大持水量的75%,WW)條件下生長,以促進菌根侵染。10周后,一半仍進行正常水分管理;另一半進行鹽脅迫(SS,采用100 mmol /L的NaCl溶液進行澆灌),為避免植物對鹽脅迫造成的短期不適應,前4 d每天NaCl濃度增加25 mmol/L,當NaCl濃度達到100 mmol/L后,每隔3 d澆1次,每次每盆澆100 mL,連續(xù)處理9次后收獲植株。試驗共為4個處理:正常水分未接種AMF處理(WW-AMF)、正常水分接種AMF處理(WW+AMF)、鹽脅迫未接種AMF處理(SS-AMF)、鹽脅迫接種AMF處理(SS+AMF)。單盆為1個重復,每個處理重復4次,共16盆。

1.2 測定方法植株收獲當天,采用常規(guī)方法測定株高、莖粗和葉片數;然后將植株分成地上部分和地下部分,根系清洗干凈,擦干水分后,用電子天平分別測鮮質量,獲得生物量。用于測定各種酶和過氧化物等生理指標的材料放入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?用于測定果糖、葡萄糖和蔗糖含量的材料,用烘箱烘至恒重,磨成粉末過篩備用。人工計數法測量記錄根系的主根長以及各級側根數。用根系掃描儀(J221A,Epson,Indonesia)對根系進行掃描,然后用WinRHIZO根系分析軟件分析,獲得其根系構型參數(根系總長度、投影面積、表面積、平均直徑和體積)。選取1～2 cm新鮮根段,采用曲利苯藍染色法[15]測定菌根侵染率。菌根侵染率(%)=(侵染根段長度/總觀察根段長度)×100。葉綠素、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子自由基(O2·-)、果糖、葡萄糖和蔗糖含量測定,以及POD和CAT活性測定均依照吳強盛[16]的方法進行。Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD采用雙抗體夾心法測定,試劑盒購于上海酶聯(lián)生物技術有限公司。

1.3 數據分析在SAS 8.1軟件中,采用ANOVA進行處理間差異性顯著性測驗,以鄧肯新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 AMF對鹽脅迫下枳生長和側根數的影響未接種AMF的枳根系未觀察到菌根侵染,鹽脅迫顯著降低了菌根侵染率。無論是否接種AMF,與正常水分相比,鹽脅迫明顯抑制了枳實生苗的生長,主要表現(xiàn)為顯著降低了株高、葉片數、總鮮質量和二級側根數。與SS-AMF相比,SS+AMF枳實生苗的株高、葉片數、總鮮質量、二級側根和三級側根數分別提高了27.49%、16.67%、26.34%、15.73%和71.43%(見表1)。

表1 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對枳實生苗根系菌根侵染率、植株生長和側根數的影響

2.2 AMF對鹽脅迫下枳根系構型的影響與WW-AMF相比,SS-AMF顯著降低了枳根系總長、投影面積、表面積和體積,分別降低了8.40%、6.08%、4.25%和16.39%。與SS-AMF相比,SS+AMF顯著提高了枳實生苗根系總長、投影面積、表面積和體積,分別提高了10.46%、7.04%、6.72%和21.57%,但對主根長和平均直徑無顯著影響(見表2)。

表2 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對枳實生苗根系構型的影響

2.3 AMF對鹽脅迫下枳實生苗葉片光合色素的影響與WW-AMF相比,SS-AMF顯著降低了枳實生苗葉片葉綠素a和總葉綠素的含量。與SS-AMF相比,SS+AMF顯著提高了葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量,分別提高了13.66%、13.21%和14.08%,但對類胡蘿卜含量無顯著影響(見表3)。

表3 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對枳實生苗葉片光合色素含量的影響

2.4 AMF對鹽脅迫下枳實生苗糖含量的影響無論是否接種AMF,與正常水分相比,鹽脅迫均顯著降低了枳根系的果糖、葡萄糖、蔗糖含量以及葉片的葡萄糖含量,顯著提高了枳葉片的果糖和蔗糖含量。與SS-AMF相比,SS+AMF顯著提高了枳根系和葉片的蔗糖含量,分別提高了14.30%和15.57%(見圖1a-c)。

注:柱狀圖中不同小寫字母表示相同部位不同處理間差異顯著(p<0.05),圖2同。圖1 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對枳實生苗果糖、葡萄糖和蔗糖含量的影響

2.5 AMF對鹽脅迫下枳實生苗丙二醛和活性氧含量的影響無論是否接種AMF,與正常水分相比,鹽脅迫顯著誘發(fā)了MDA、H2O2和O2·-在枳實生苗根系和葉片中的積累。接種AMF對鹽脅迫下MDA、H2O2和O2·-的積累具有一定緩解作用,與SS-AMF相比,SS+AMF枳根系H2O2和O2·-含量分別顯著降低了41.23%和16.10%,枳葉片MDA和H2O2含量分別顯著降低了10.43%和12.15%(見圖2a-c)。

圖2 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對枳實生苗MDA、H2O2和O2·-的影響

2.6 AMF對鹽脅迫下枳實生苗抗氧化酶活性的影響無論是否接種AMF,與正常水分相比,鹽脅迫顯著增強了枳實生苗根系和葉片的POD和CAT活性,顯著降低了枳根系的Fe-SOD、Mn-SOD以及枳葉片的Cu/Zn-SOD和Fe-SOD活性。與SS-AMF相比,SS+AMF顯著增強了枳根系的Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD、POD和CAT活性,分別增強了17.00%、17.77%、15.94%、16.44%和39.12%;SS+AMF還顯著增強了枳葉片的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、POD和CAT活性,分別增強了16.29%、30.29%、9.51%和26.21%(見表4)。

表4 正常水分和鹽脅迫下摩西管柄囊霉對枳實生苗根系和葉片抗氧化酶活性的影響

3 討論

菌根侵染率表明了AMF與植物的親和程度,在一定程度上反映了AMF的促生效果[9]。本研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫顯著降低了菌根侵染率,這與前人在羊草[17]和大葉女貞[18]上的結果是一致的。其原因是鹽脅迫對AMF的孢子萌發(fā)和菌絲正常生長有抑制作用[9,17-18]。

土壤鹽漬化會對植物生長發(fā)育造成一系列傷害,嚴重限制植物生長,甚至會導致植物死亡。本研究顯示,在鹽脅迫下枳實生苗的生長受到顯著抑制,接種AMF則可明顯緩解土壤鹽害的抑制作用。鹽脅迫下,與未接種AMF相比,接種AMF顯著促進了枳實生苗的生長。其原因是:一方面接種AMF促進植株根系的生長,根系總長、投影面積、表面積和體積顯著提高,擴大了根系的吸收面積,促進了根系對水分和養(yǎng)分的吸收[17-18];另一方面接種AMF提高了光合色素的積累,葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量顯著提高,促進了光合作用,從而有利于植物干物質的積累[17]。

在未接種AMF的植株中,與正常水分相比,鹽脅迫顯著降低了葉綠素a和總葉綠素的含量。其原因是鹽脅迫抑制了植物對礦質營養(yǎng)的吸收,而植物合成葉綠素需要礦質元素,尤其是Mg[19]。徐嘉美等[6]發(fā)現(xiàn),接種F.mosseae后蒲公英地上部的Mg含量在NaCl濃度為100 mmol/L和400 mmol/L的鹽脅迫條件下顯著提高。Wu等[20]也發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下接種兩種AMF均顯著提高了柑桔葉片Mg含量。因此,鹽脅迫下接種AMF提高了植物對Mg的吸收,進而促進了葉綠素的合成,有利于提高植物的光合作用[19]。本試驗也證實了在鹽脅迫下接種AMF顯著提高了枳實生苗葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量。

AMF與植物建立共生關系時,在促進宿主植物水分和養(yǎng)分吸收的同時,需利用宿主植物的碳水化合物維持自身的代謝活動,而真菌生長最重要的碳源來自于蔗糖裂解產生的己糖(果糖和/或葡萄糖)[20]。可溶性糖在植物體內可作為滲透調節(jié)劑降低滲透勢。本試驗顯示,鹽脅迫顯著降低了枳根系的蔗糖、果糖、葡萄糖含量以及葉片的葡萄糖含量,且相關性分析表明植株的總鮮質量與根系蔗糖(r=0.61,p<0.05)、根系果糖(r=0.71,p<0.01)、根系葡萄糖(r=0.73,p<0.01)以及葉片葡萄糖(r=0.69,p<0.01)呈顯著正相關關系。這說明了鹽脅迫抑制了枳植株中糖分的積累,提高其滲透勢,引起了滲透脅迫,從而影響了植株的生長,導致枳總鮮質量的降低。鹽脅迫下,與未接種AMF相比,接種AMF顯著提高了根系和葉片的蔗糖含量,這表明AMF通過積累蔗糖應對鹽脅迫。

脅迫條件會導致植物體內活性氧的爆發(fā),而脂質過氧化產物丙二醛的含量反應了細胞膜脂質過氧化程度[16]。本試驗結果顯示,鹽脅迫顯著誘發(fā)了枳實生苗MDA、H2O2和O2·-的積累,而鹽脅迫下接種AMF顯著降低了枳葉片和根系H2O2含量、根系O2·-含量,且相關性分析表明菌根侵染率與葉片H2O2(r= -0.53,p<0.05)、根系H2O2(r=-0.73,p<0.01)和根系O2·-(r=-0.80,p<0.01)含量呈顯著負相關,表明了AMF的侵染能抑制枳活性氧的積累。宿主植物根系的H2O2增多與AMF中叢枝的衰老相關[21],說明AMF叢枝對清除植物H2O2有重要作用[22]。這些結果表明了AMF特殊的結構和功能與鹽脅迫下菌根化植物中活性氧含量的降低有關。

本研究中,鹽脅迫下,與未接種AMF相比,接種AMF顯著提高了枳根系和葉片的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、POD和CAT活性以及根系的Fe-SOD活性。這與鹽脅迫下接種AMF增強羊草[17]和大葉女貞[18]抗氧化酶活性的研究結果一致。SOD、POD和CAT活性在一定程度上與所利用的金屬元素含量有關[22],而鹽脅迫下接種AMF可以有效促進宿主植物對礦質元素Fe、Cu、Mg、Zn等吸收[5-6]。此外,菌根化植物抗氧化酶活性提高可能與宿主植物和菌根真菌自身相關基因的表達量增加有關。He等[23]的研究表明,接種AMF的枳PtMn-SOD、PtPOD和PtCAT1基因表達量上調。接種AMF的番茄在鹽脅迫下SlSOS1和SlSOS2的表達量顯著提高[12]。Lanfranco 等[24]從AMF萌發(fā)的孢子中克隆到SOD基因,這表明AMF也可以通過調控自身SOD基因的表達來降低氧化損傷。本研究表明了鹽脅迫下接種AMF通過增強抗氧化酶活性,降低活性氧含量,從而減少氧化損傷,提高枳的耐鹽性。