杜 倩,李昌穎,宋貞富,鐘思玲,周 奎,文曉鵬

(1 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽,550025;2 安順市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,貴州安順,562100)

無籽刺梨(RosasterilisS.D. Shi)別名搭鉤刺梨、光枝無籽刺梨和安順金刺梨等,是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)植物,在貴州喀斯特地區(qū)瘠薄的土壤條件下能很好地生長,是貴州喀斯特地區(qū)植被恢復(fù)的重要樹種[1-2]。果實(shí)含有豐富的維生素C,皮刺較少且稀疏,果實(shí)成熟時(shí)呈橙黃色[3],由于無籽刺梨的果實(shí)沒有種子,偶爾個別果實(shí)中含有1～2粒飽滿種子,通常會受到生產(chǎn)者和消費(fèi)者的喜愛。無籽刺梨主要分布于我國西南地區(qū),在貴州安順、興仁等地居多[4]。已有一些學(xué)者對無籽刺梨果實(shí)品質(zhì)開展過研究,發(fā)現(xiàn)無籽刺梨果實(shí)品質(zhì)與種植地區(qū)土壤條件有密切關(guān)系,為喀斯特地區(qū)無籽刺梨生產(chǎn)和無籽刺梨品質(zhì)生態(tài)區(qū)劃提供了依據(jù)[5]。目前為止,關(guān)于無籽刺梨果實(shí)加工及栽培方面的研究有許多報(bào)道[6-7],但對無籽刺梨果實(shí)解剖結(jié)構(gòu)方面的研究較少,且主要集中在果實(shí)表皮毛形態(tài)結(jié)構(gòu)[8]。本試驗(yàn)通過對無籽刺梨果實(shí)生長發(fā)育過程中的形態(tài)及組織解剖進(jìn)行系統(tǒng)研究,明確無籽刺梨不同發(fā)育時(shí)期的解剖結(jié)構(gòu)的變化特征,以期為無籽刺梨果實(shí)發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料2021年4月至2021年10月,在貴州省安順市普定縣農(nóng)科所(26°30′68″ N,105°84′24″ E,海拔1 368.2 m)觀察和收獲無籽刺梨花蕾、花和果實(shí)。試驗(yàn)材料為10年生無籽刺梨,從顯蕾開始觀察直到果實(shí)成熟。待花謝后,每間隔15 d采集一次果實(shí)。采集的花蕾、花和果實(shí)一部分帶回實(shí)驗(yàn)室用于形態(tài)特征觀察;另一部分立刻置于FAA固定液(V無水乙醇∶V冰乙酸∶V甲醛=18∶1∶1)中固定24 h后,取出沖洗2～3次,之后轉(zhuǎn)入70%乙醇中,于4 ℃冰箱長期保存。

1.2 果實(shí)形態(tài)學(xué)觀察選取5株無籽刺梨樹,每隔一定時(shí)期進(jìn)行采樣觀測,每次每株樹在樹冠外圍東、西、南、北、中5個方位各摘取2個果實(shí)。使用電子游標(biāo)卡尺(MNT-150T,美耐特)測量果實(shí)縱徑和橫徑。使用電子天平(JJ200,雙杰)測定果實(shí)鮮質(zhì)量。

1.3 果實(shí)石蠟切片制作取材、固定:取新鮮果實(shí)于70% FAA中固定24 h以上,用真空氣筒抽氣,使果實(shí)沉底。

脫水、透明、浸蠟:將材料放入脫水機(jī)(YD-12P,益迪)中進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟,具體步驟為70%酒精2 h→85%酒精2 h→95%酒精2 h→95%酒精2 h→無水乙醇50 min→無水乙醇40 min→無水乙醇+二甲苯2 h→二甲苯1 h→二甲苯1 h→蠟4 h→蠟3 h→蠟3 h。

包埋:將材料從脫水機(jī)中取出來,在包埋機(jī)(YD-6L,益迪)內(nèi)進(jìn)行包埋,包埋好的組織塊放在冷凍臺(YD,益迪)上進(jìn)行凝固。

切片、烤片:修整蠟塊、調(diào)整好切片機(jī)(YD-315,益迪)后進(jìn)行切片,切片厚度8 μm。用毛筆把切好的蠟片輕放在42 ℃的水槽中,用載玻片中央位置去撈取展開后的蠟片,放在烤片機(jī)(YD-AB2,益迪)上進(jìn)行烤片。

脫蠟、染色、脫水:將材料放入染色機(jī)(YD-700,益迪)中進(jìn)行脫蠟、染色脫水,具體步驟為二甲苯30 min →二甲苯30 min →二甲苯+無水乙醇3 min →無水乙醇3 min →無水乙醇3 min →95%酒精3 min → 85%酒精3 min →70%酒精3 min →50%酒精3 min →1%番紅12 h →清水30 s →50%酒精15 s →70%酒精5 min →85%酒精5 min →95%酒精5 min →1%固綠15 s → 95%酒精5 min →無水乙醇5 min →無水乙醇5 min →二甲苯5 min →二甲苯5 min。

封片、鏡檢:滴1～2滴中性樹膠于載玻片的樣品上,將潔凈的蓋玻片傾斜放下,封片,置于顯微鏡(ECLIPSE SI)下觀察。

1.4 指標(biāo)測定用ECLIPSE SI顯微鏡拍照后,十字交叉法測量細(xì)胞縱橫徑。

1.5 數(shù)據(jù)分析使用Graphpad prim 9軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)形態(tài)變化無籽刺梨一般4月初開始現(xiàn)蕾,花為完全花,多朵花聚集組成不規(guī)則的傘房花序或復(fù)傘房花序。花的發(fā)育始于花冠管的伸長和花蕾的膨脹(見圖1A)?；ɡ俪掷m(xù)時(shí)間較長,1個月左右花蕾開始含苞欲放(見圖1B),1～2 d后出現(xiàn)5個粉白色花瓣平展的花朵(見圖1C),花期長達(dá)1個月左右,暴露的雄蕊變成褐色并枯萎(見圖1D),隨后出現(xiàn)小果(見圖1E)。

注:(A)花蕾;(B)含苞欲放的花;(C)完全開放的花;(D)凋落后的萎縮雄蕊;(E)花后小果。圖1 無籽刺梨從花蕾至小果各發(fā)育階段的狀況

果實(shí)是假果,是由瓶狀花托和子房共同發(fā)育而來?；ê?周(2 Weeks After Anthesis,2 WAA)至花后5周的果實(shí)形狀為卵球形,顏色為青綠色,果實(shí)上布滿小刺(見圖2A和圖2B);花后11周的果實(shí)為淡黃綠色(見圖2C);花后18周的果實(shí)形狀為卵球形且已經(jīng)趨于成熟,大部分小刺已經(jīng)脫落,果實(shí)顏色為橙黃色(見圖2D)。無籽刺梨敗育種子為干癟狀(見圖2A-D)。無籽刺梨的果實(shí)從開花到完全成熟大約需要23周(161 d)。

注:A為2 WAA的果實(shí);B為5 WAA的果實(shí);C為11 WAA的果實(shí);D為18 WAA的果實(shí)。圖2 無籽刺梨不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)

2.2 果實(shí)生長模式無籽刺梨果實(shí)縱徑、橫徑和鮮質(zhì)量隨著果實(shí)的生長發(fā)育而增加。根據(jù)變化趨勢將其分為4個階段,即階段1(S1)、階段2(S2)、階段3(S3)和階段4(S4)(見圖3)。在無籽刺梨果實(shí)生長發(fā)育過程中,縱橫徑變化趨勢基本一致,縱徑始終大于橫徑。果實(shí)迅速生長時(shí)期為花后2周至花后4周(即S1階段)和花后8周至花后14周(即S3階段),果實(shí)生長緩慢時(shí)期為花后4周至花后8周(即S2階段)和花后14周至花后18周(即S4階段)。果實(shí)橫徑從S1階段的11.12 mm增加到S4階段的25.54 mm,縱徑從S1階段的14.03 mm增加到S4階段的26.91 mm(見圖3),質(zhì)量從S1階段的0.72 g增加到S4階段的5.20 g(見圖3)。無籽刺梨的單果果實(shí)發(fā)育總體呈現(xiàn)“快-慢-快-慢”的變化趨勢,呈現(xiàn)雙S型生長模式。

圖3 無籽刺梨果實(shí)縱橫徑和質(zhì)量增長曲線

2.3 果實(shí)解剖結(jié)構(gòu)變化從橫切面來看,無籽刺梨果實(shí)的果皮已特化為3個細(xì)胞層,即外果皮、中果皮和內(nèi)果皮。外果皮是由子房外壁細(xì)胞發(fā)育而來,S1階段外果皮由6～7層細(xì)胞組成;表皮由1層細(xì)胞組成,細(xì)胞呈長矩形、較小且排列緊密,是果實(shí)表面的覆蓋層(見圖4A);幼果外表皮基部有多細(xì)胞組成的表皮毛,未觀察到角質(zhì)膜(見圖4B)。中果皮由薄壁細(xì)胞和分布其中的維管束組成,中果皮細(xì)胞比鄰近的外果皮和內(nèi)果皮細(xì)胞大,中果皮細(xì)胞呈長圓形,細(xì)胞排列緊密,大小不規(guī)則,含有豐富的維管組織,且部分薄壁細(xì)胞含有內(nèi)含物淀粉。內(nèi)果皮由2～3層細(xì)胞組成,最內(nèi)層表皮細(xì)胞由1層細(xì)胞組成,細(xì)胞呈長矩形,且排列緊密,比鄰近果肉細(xì)胞小(見圖4C)。

注:EX:外果皮,SG:淀粉粒,EH:表皮毛,EN:內(nèi)果皮,ME:中果皮。圖5至圖6同。圖4 S1階段果實(shí)的橫切面

與S1階段的細(xì)胞相比,S2階段的細(xì)胞隨著果實(shí)的生長和發(fā)育,經(jīng)歷了分裂和膨大,因此,S2階段的細(xì)胞比S1階段大。S2階段,表皮細(xì)胞由2層長圓形細(xì)胞組成,排列緊密且細(xì)胞較大,表皮外是由蠟質(zhì)和角質(zhì)組成的薄薄角質(zhì)膜(見圖5A);中果皮細(xì)胞大小不規(guī)則,呈長圓形(見圖5C),此階段,果實(shí)的外果皮區(qū)域和內(nèi)果皮區(qū)域與中果皮區(qū)域可以明顯區(qū)分,中果皮區(qū)域的細(xì)胞比內(nèi)、外果皮區(qū)域的細(xì)胞要大,細(xì)胞中存在內(nèi)含物淀粉;內(nèi)果皮由2～3層細(xì)胞組成,最內(nèi)層表皮細(xì)胞形狀為大小一致的長方形且排列緊密(圖5C)。

注:c:角質(zhì)層,紅色箭頭表示分裂細(xì)胞。圖5 S2階段果實(shí)的橫切面

與S2階段的細(xì)胞相比,S3階段的細(xì)胞進(jìn)一步膨大,細(xì)胞體積增大,且細(xì)胞的縱徑顯著大于橫徑。S3階段,表皮由4～5層長圓形細(xì)胞組成,排列緊密且細(xì)胞較大,表皮外有一層厚厚的角質(zhì)膜(見圖6A),表皮細(xì)胞層數(shù)基本不再變化,外果皮壁加厚;中果皮細(xì)胞大小不規(guī)則,呈長形,細(xì)胞間有空隙,觀察到螺紋導(dǎo)管(見圖6B),淀粉粒逐漸變少,直至淀粉消失;內(nèi)果皮由3～4層細(xì)胞組成,最內(nèi)層表皮細(xì)胞形狀為大小一致的長方形,且排列緊密(見圖6C)。

注:SV:螺紋導(dǎo)管。圖6 S3階段果實(shí)的橫切面

與S3階段的細(xì)胞相比,S4階段的細(xì)胞停止了膨大。S4階段,表皮細(xì)胞由4～5層不規(guī)則細(xì)胞組成,排列緊密且細(xì)胞較大,表皮細(xì)胞外層有一層厚厚的角質(zhì)膜(見圖7A),隨著果實(shí)的成熟,表皮毛脫落;中果皮中的薄壁細(xì)胞不規(guī)則且松散堆積,細(xì)胞間的間隙變大,觀察到螺紋導(dǎo)管(見圖7B);內(nèi)果皮由3～4層細(xì)胞組成,最內(nèi)層表皮細(xì)胞形狀為大小不一致的長方形,且排列緊密(見圖7C)。果肉完全發(fā)育成熟時(shí),細(xì)胞中的淀粉粒完全消失。

注:EX:外果皮,EN:內(nèi)果皮,ME:中果皮,SV:螺紋導(dǎo)管,比例尺是50 μm。圖7 S4階段果實(shí)的橫切面

不同發(fā)育階段果皮組織層細(xì)胞大小(縱徑和橫徑)差異的情況見圖8?？傮w趨勢為隨果實(shí)發(fā)育,各果皮組織層細(xì)胞均呈增大。

注:S1:2 WAA;S2:5 WAA;S3:11 WAA;S4:16 WAA。圖8 無籽刺梨果實(shí)細(xì)胞縱橫徑

2.4 石細(xì)胞和維管束變化維管束主要分布在中果皮中,根據(jù)維管束在中果皮的分布位置與結(jié)構(gòu)不同,有兩種維管束,即分散維管束和外周維管束,分散維管束分布于中果皮中,而外周維管束環(huán)繞于中果皮外側(cè)區(qū)域。

在S1階段,果實(shí)嫩綠色,在初生韌皮部及初生木質(zhì)部之間存在束中維管束,具有一定的分生能力,形成次生組織,增大它們在中果皮中的空間,此時(shí)期果皮中的分散維管束木質(zhì)部導(dǎo)管或管胞木質(zhì)化程度較低,韌皮部比較發(fā)達(dá),分散維管束截面近扇形(見圖9A),外周維管束繞中果皮外側(cè)排列成一圈(見圖9B)。在S2階段,木質(zhì)部導(dǎo)管排列規(guī)則,且導(dǎo)管壁清晰,中果皮中的分散維管束的橫截面積增加,木質(zhì)部導(dǎo)管明顯增加,此時(shí)期的維管束截面近扇形(圖9C),外周維管束中薄壁細(xì)胞部分細(xì)胞的細(xì)胞壁均勻加厚,形成厚壁細(xì)胞,細(xì)胞壁繼續(xù)加厚特化為石細(xì)胞,石細(xì)胞原基細(xì)胞出現(xiàn)在該時(shí)期(見圖9D)。在S3階段,隨著細(xì)胞快速生長,木質(zhì)部薄壁細(xì)胞膨大,此時(shí)期維管束的橫截面積最大(見圖10),木質(zhì)部導(dǎo)管清晰可見,木質(zhì)素沉積速度明顯加快(見圖9E),石細(xì)胞團(tuán)次生壁木質(zhì)化明顯加厚,石細(xì)胞團(tuán)達(dá)到高峰(見圖9F)。在S4階段,隨著果實(shí)成熟,中果皮中的維管束的可見度降低,大部分維管束木質(zhì)化,維管束橫截面積最小(見圖10),維管束截面近圓形(見圖9G),石細(xì)胞高度木質(zhì)化且含量降低。

圖10 無籽刺梨中果皮維管束縱橫徑

中果皮維管束大小(縱橫徑)表現(xiàn)為隨發(fā)育先增后降,以S3階段最大(見圖10)。

2.5 種子形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)

無籽刺梨果實(shí)在10月份左右成熟,少數(shù)果實(shí)有1～2粒種子。種子的形成是由胚珠經(jīng)過傳粉受精形成,而無籽刺梨花粉敗育,導(dǎo)致胚珠受精失敗,形成敗育種子。無籽刺梨敗育種子的解剖結(jié)構(gòu)變化由花后3周、花后5周及花后17周采集的敗育種子表示。利用體視鏡顯微鏡和石蠟切片對不同發(fā)育時(shí)期的種子進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)和解剖觀察發(fā)現(xiàn),花后3周的敗育種子呈細(xì)長形,灰綠色,外種皮由兩層細(xì)胞垂直于內(nèi)種皮細(xì)胞組成,內(nèi)種皮由零散細(xì)胞組成,外種皮細(xì)胞木質(zhì)化,種皮發(fā)育完整,種皮內(nèi)部可以清晰地觀察到子葉,未觀察到胚乳和胚,胚柄系統(tǒng)斷裂,導(dǎo)致種皮內(nèi)部系統(tǒng)無法吸收養(yǎng)分(見圖11A、D):花后5周的敗育種子呈細(xì)長形,黑綠色,解剖觀察到種皮發(fā)育完整,內(nèi)種皮細(xì)胞部分木質(zhì)化,種皮內(nèi)部系統(tǒng)皺縮且胚柄系統(tǒng)斷裂(見圖11B和E);花后17周的敗育種子呈細(xì)長形,黑色,解剖觀察到種皮發(fā)育完整,內(nèi)、外種皮細(xì)胞木質(zhì)化程度加強(qiáng),種皮內(nèi)部系統(tǒng)皺縮且胚柄系統(tǒng)斷裂(見圖11C和F)。

注:(A、D)3 WAA種子;(B、E)5 WAA種子;(C、F)17 WAA種子;Ext:內(nèi)種皮,Ent:外種皮,Cy:子葉,Su:胚柄。圖11 無籽刺梨種子的形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)

3 討論

3.1 無籽刺梨果實(shí)生長發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特征

無籽刺梨在貴州省主要分布于安順、興仁等地,從開花到果實(shí)成熟約需要161 d,是貴州省特有品種,這可能歸因于貴州的氣候、光照強(qiáng)度、降雨量和濕度等生長環(huán)境。無籽刺梨果實(shí)生長發(fā)育呈雙S型生長曲線,其中橫徑、縱徑、鮮質(zhì)量隨著果實(shí)生長發(fā)育主要分為4個階段,即S1快速生長階段、S2緩慢生長階段、S3快速生長階段和S4緩慢生長階段。在桃[9]、草莓[10]和靈武長棗[11]中也發(fā)現(xiàn)了類似的生長模式,在快速生長階段加強(qiáng)肥水管理有助于果實(shí)膨大,提高果實(shí)品質(zhì)。

無籽刺梨果實(shí)形態(tài)特征與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化一致。無籽刺梨的子房壁直接發(fā)育的果皮已特化為3個細(xì)胞層,即外果皮、中果皮和內(nèi)果皮,在刺黃果[12]和杧果[13]中也發(fā)現(xiàn)了果實(shí)的外果皮、中果皮和內(nèi)果皮,即特化的果皮組織。在S1階段,果實(shí)細(xì)胞排列緊密,無細(xì)胞間隙,果實(shí)的外果皮和內(nèi)果皮細(xì)胞小于中果皮細(xì)胞;在外果皮最外層生長有不同大小的表皮毛,可以防止水分的散失和病毒的侵染;中果皮內(nèi)含有豐富的維管束,運(yùn)輸水分、無機(jī)鹽和有機(jī)養(yǎng)料等,此階段的維管束呈扇形,在薄壁細(xì)胞中積累了部分的淀粉粒。一般認(rèn)為果實(shí)大小是果實(shí)細(xì)胞數(shù)量和大小共同決定,細(xì)胞數(shù)量是基礎(chǔ),細(xì)胞大小是關(guān)鍵[14]。在S2階段,果實(shí)細(xì)胞進(jìn)一步分裂和膨大,細(xì)胞間隙極小,維管束發(fā)育良好,在表皮細(xì)胞外有一層薄薄的角質(zhì)膜,角質(zhì)膜也是抵抗病菌和害蟲咬食的保護(hù)層[15];外周維管束中的薄壁細(xì)胞特化為石細(xì)胞,據(jù)在香梨中的報(bào)道[16],維管束與石細(xì)胞存在一定的連接,維管束的營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸或者生理代謝引起果實(shí)石細(xì)胞的變化;此階段的薄壁細(xì)胞中積累大量的淀粉粒,果實(shí)質(zhì)量從0.72 g增加到1.64 g,細(xì)胞生長緩慢。在S3階段,果實(shí)細(xì)胞進(jìn)一步膨大,石細(xì)胞在果皮兩端多、中間少,在果皮中的內(nèi)含物淀粉逐漸減少,細(xì)胞快速生長。在S4階段,果實(shí)細(xì)胞停止了膨大,細(xì)胞間的間隙變大,在分散維管束中,維管束可見度降低。在獼猴桃中[17]由于快速生長過程中拉伸的細(xì)胞導(dǎo)致了木質(zhì)部血管破壞,因此,木質(zhì)部血管的破壞可能是導(dǎo)致無籽刺梨果實(shí)中維管束可見度降低。果實(shí)淀粉含量呈現(xiàn)S1/S2階段升高、S3/S4階段下降的變化趨勢。果肉的淀粉粒完全消失,這可能是淀粉粒逐漸被水解的緣故[18]。在S4階段,石細(xì)胞團(tuán)密度和體積大小基本穩(wěn)定。在梨果實(shí)中[19]研究得出,果肉中石細(xì)胞團(tuán)密度和大小是決定果實(shí)口感的主要因素,因此可以通過控制石細(xì)胞的含量和大小來改善無籽刺梨果實(shí)的口感。在S4階段中細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化表明S4果實(shí)處于成熟階段。

3.2 無籽刺梨種子敗育的細(xì)胞學(xué)特征

雄性不育,如花藥退化、花粉敗育和絨氈層發(fā)育不正常,都會導(dǎo)致種子敗育[20]。無籽刺梨花粉敗育[21],導(dǎo)致授粉失敗,敗育種子外形呈干癟狀且隨著果實(shí)的生長發(fā)育顏色變黑,未授粉的胚珠發(fā)育中止,種子敗育。理論上,種子由種皮、胚和胚乳三部分結(jié)構(gòu)組成。解剖觀察發(fā)現(xiàn),無籽刺梨的種皮發(fā)育完整,但種皮以內(nèi)的內(nèi)部系統(tǒng)皺縮且胚柄系統(tǒng)斷裂,導(dǎo)致種子敗育。在百山祖冷杉種子中也發(fā)現(xiàn)了未授粉的胚珠幾乎全部發(fā)育中止,導(dǎo)致發(fā)育異常種子的數(shù)量劇增[22]。除此之外,雌蕊原基形成后至雌配子體形成的任何時(shí)期均可能發(fā)生雌蕊敗育[23],從而導(dǎo)致種子敗育。本試驗(yàn)中,無籽刺梨種子敗育的細(xì)胞學(xué)特征僅以花后15 d后不同發(fā)育時(shí)期的種子解剖結(jié)構(gòu)作為敗育依據(jù),今后應(yīng)繼續(xù)觀察無籽刺梨胚珠中的孢原細(xì)胞、胚囊原始細(xì)胞以及不同發(fā)育程度的胚囊,完善無籽刺梨種子敗育的原因。

4 結(jié)論

無籽刺梨果實(shí)從開花到成熟約需要161 d。果實(shí)生長發(fā)育為雙S型生長曲線,包括4個明顯的階段,即S1快速生長階段、S2緩慢生長階段、S3快速生長階段和S4緩慢生長階段。在細(xì)胞水平上,揭示了無籽刺梨發(fā)生細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨大以增加細(xì)胞數(shù)量和果實(shí)大小。通過形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)觀察揭示了無籽刺梨果實(shí)的生長模式及解剖學(xué)結(jié)構(gòu)特征,可為果實(shí)的生長發(fā)育調(diào)控研究提供參考,同時(shí),可為科學(xué)制定無籽刺梨栽培管理措施提供依據(jù)。