聶洪辛，李毓敏，龐凱悅，柴沙駝，4，申迪，曾子銘，廖揚(yáng)，王迅，薛斌，劉書杰，王書祥，4*，楊英魁，4*

（1. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；3. 青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，青海 西寧 810016；4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部青藏高原放牧牦牛藏羊動物營養(yǎng)與飼草料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

牦牛被稱作“高原之舟”，是青藏高原特有牛種［1］。我國現(xiàn)有牦牛1400 萬頭左右，約占世界牦?？倲?shù)的95%以上，主要分布在青海、西藏、甘肅等高海拔地區(qū)，其中青海490 萬頭左右，約占全國牦?？倲?shù)的40%，居全國首位［2-4］。目前牦牛的飼養(yǎng)方式仍以長年放牧為主，致使牦牛對營養(yǎng)物質(zhì)攝入不足，而通過調(diào)整飼糧中精粗比可以滿足牦牛的營養(yǎng)需要［5］。在飼糧精粗比正常情況下，腸道內(nèi)的菌群可以和宿主及外部環(huán)境建立動態(tài)的生態(tài)平衡，但當(dāng)飼糧中精料過高或過低時［6-7］，則可能導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生紊亂［8-9］。腸道菌群能夠抵抗外源致病因子的入侵，協(xié)助宿主免疫系統(tǒng)消滅外病原微生物，在維持腸道健康方面發(fā)揮著重要作用。健康的反芻動物腸道菌群中多以厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門為優(yōu)勢菌門，而優(yōu)勢菌屬的差異較大［10］。反芻動物的腸道菌群大多集中在結(jié)腸，對糞便菌群和結(jié)腸內(nèi)容物菌群的結(jié)構(gòu)比較后發(fā)現(xiàn)，糞便菌群與腸道菌群有許多相似之處［11-13］，所以糞便菌群狀況可以間接地反映出腸道菌群的基本情況。因此，本試驗(yàn)擬采用16S rDNA 高通量測序，研究不同精粗比飼糧對牦牛糞便中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，旨在為牦牛的合理飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2019 年9-12 月在青海省貴南縣老扎西養(yǎng)殖基地進(jìn)行。選取24 頭體重相近、健康的3 歲公牦牛隨機(jī)分成2 組，分別飼喂低精粗比飼糧（35∶65， C35組）和高精粗比飼糧（65∶35， C65組），每組3 個重復(fù)。預(yù)試期15 d，正試期90 d，共計(jì)105 d。參考我國肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T815-2004）進(jìn)行試驗(yàn)飼糧設(shè)計(jì)［14］，8：00 和17：00 進(jìn)行飼喂，試驗(yàn)期間所有牦牛自由飲水。試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)成分占比見表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets

1.2 樣品采集

在飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后從兩組中各隨機(jī)抽取6 頭牦牛收集糞便。用直腸糞便提取法收集糞便樣品置于2 mL 凍存管并暫存于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存待測。

1.3 DNA 提取、測序及分析

由北京奧維森基因科技有限公司對提取的樣品進(jìn)行16S rDNA 高通量測序。采用十六烷基三甲基溴化銨法（cetyl trimethyl ammonium bromide， CTAB）［15］，又稱西曲溴銨法，從糞便樣本中提取DNA。使用條形碼特異引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和806R（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）來擴(kuò)增16S rRNA 基因的不同區(qū)域（16S V3-V4）。使用TruSeq DNA PCR-Free Libraray Preparation Kit 建庫試劑盒（美國Illumina 公司）進(jìn)行文庫構(gòu)建，并經(jīng)過Qubit 和PCR（qPCR）定量和檢驗(yàn)合格后，使用Illumina NovaSeq 6000 進(jìn)行上機(jī)測序。測序平臺得到的原始數(shù)據(jù)利用Trimmomatic v0.36 軟件、Pear v0.9.6 軟件進(jìn)行質(zhì)控和過濾，把相似性大于97%的優(yōu)質(zhì)序列篩選出來，計(jì)算操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），最后對OTU 聚類、物種分類、多樣性指數(shù)和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 27.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA），同時用LSD 法進(jìn)行差異顯著性比較，P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著，結(jié)果均以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤差（standard error of mean，SEM）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群豐富度與多樣性的影響

2 組共產(chǎn)生1702 個OTU，其中C35組產(chǎn)生254 個OTU，C65組產(chǎn)生175 個OTU，兩組共有的OTU 數(shù)目為1273 個，占總OTU 數(shù)目的74.79%（圖1）。隨著測序深度的增加，C35與C65組的糞便細(xì)菌稀釋曲線呈逐漸平緩的趨勢（圖2），這表明測序程度可以覆蓋樣品中大多數(shù)微生物菌群。通過Alpha 多樣性分析可知（表2），C35組的物種數(shù)、Chao1 指數(shù)與Shannon 指數(shù)顯著高于C65組（P＜0.05）。通過主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis， PCoA）可知（圖3），C35組與C65組牦牛糞便菌群結(jié)構(gòu)具有明顯差異。

圖1 OTU 韋恩圖Fig.1 OTU venn diagram

圖2 糞便細(xì)菌稀釋曲線Fig.2 Fecal bacterial dilution curve

圖3 細(xì)菌區(qū)系主坐標(biāo)分析Fig.3 PCoA of bacterial flora

2.2 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群組成門水平的影響

在門水平（表3）上，牦牛糞便中主要的細(xì)菌門有厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門。其中，C35組牦牛糞便中髕細(xì)菌門和藍(lán)藻菌門極顯著高于C65組（P＜0.01），放線菌門顯著高于C65組（P＜0.05）；C65組牦牛糞便中擬桿菌門、螺旋體門顯著高于C35組（P＜0.05）；其他菌門組間無顯著差異。

表3 不同精粗比對牦牛糞便菌群組成的影響Table 3 Effects of different concentrate to forage ratio on microflora composition of yak feces

2.3 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群組成屬水平的影響

在屬水平上，牦牛糞便中主要的細(xì)菌屬是UCG-005（表4）。其中，C35組牦牛糞便中毛螺菌科_NK3A20群顯著高于C65組（P＜0.05）；C35組牦牛糞便中未培養(yǎng)的屬、瘤胃球菌屬極顯著高于C65組（P＜0.01），C65組未培養(yǎng)細(xì)菌屬、擬普雷沃氏菌屬、密螺旋體屬顯著高于C35組（P＜0.05）；其他菌屬組間無顯著差異。

表4 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群組成的影響Table 4 Effects of different concentrate to forage ratio on bacterial community composition of yak feces

2.4 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群代謝途徑及功能的影響

在KEGG2 水平上，糞便樣本中有20 個相對豐度值高的基因家族（相對豐度＞0.10%）。在這20 個基因家族中，C65組復(fù)制和修復(fù)、翻譯、核苷酸代謝、其他次生代謝物的合成、細(xì)胞生長和死亡的基因家族相對豐度極顯著高于C35組（P＜0.01）（表5）。

表5 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群KEGG 二級代謝通路的影響Table 5 Effects of diets with different concentrate to forage ratios on KEGG secondary metabolic pathway of fecal bacteria in yaks

3 討論

3.1 不同精粗比飼糧對牦牛糞便細(xì)菌豐富度與多樣性的影響

16S rDNA 高通量測序技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地對牦牛糞便菌群結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析，其中Alpha 多樣性分析可以測定微生物群落的豐富度與多樣性，需要測定的指標(biāo)包括Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)。Chao1 指數(shù)越大則說明菌群豐富度越高，Shannon 指數(shù)越大則說明菌群多樣性越高［16］。劉飛鴻［17］研究了不同精粗比對肥胖空懷母牛腸道菌群多樣性的影響，結(jié)果表明：低精料組母牛腸道菌群多樣性顯著高于高精料組。Pang 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼糧精粗比的提高，牦牛糞便微生物菌群的豐富度和多樣性呈顯著性降低。在本試驗(yàn)中，Chao1 指數(shù)與Shannon 指數(shù)隨精料的增加而顯著降低，與上述研究結(jié)果一致，說明飼喂高精粗比飼糧（65∶35）會降低牦牛糞便菌群的豐富度與多樣性。

3.2 不同精粗比飼糧對牦牛糞便細(xì)菌結(jié)構(gòu)的影響

對于反芻動物微生物細(xì)菌多樣性及結(jié)構(gòu)特性，已有研究證明厚壁菌門及擬桿菌門在反芻動物瘤胃和糞便微生物中處于優(yōu)勢菌門［19-21］，其原因是在反芻動物飼糧中，粗飼料占比通常達(dá)70%及以上，是瘤胃微生物的主要營養(yǎng)來源，而擬桿菌門與厚壁菌門在反芻動物胃腸道粗纖維的消化過程中發(fā)揮著重要作用。放線菌門或變形菌門的豐度值次于擬桿菌門與厚壁菌門［22-23］。本研究發(fā)現(xiàn)，C35組與C65組牦牛糞便微生物菌群中厚壁菌門的相對豐度占整個菌門的72.08%，擬桿菌門的相對豐度占整個菌門的21.44%，而放線菌門的相對豐度占整個菌門的1.97%，結(jié)果與上述一致。厚壁菌門主要參與結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解，而擬桿菌門是非纖維物質(zhì)降解過程中最重要的菌門，這兩種菌在反芻動物營養(yǎng)代謝中起著至關(guān)重要的作用［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)，C65組牦牛糞便中擬桿菌門顯著高于C35組，表明飼喂高精粗比飼糧促進(jìn)了牦牛糞便中非纖維降解菌的增殖。本研究結(jié)果表明，C65組牦牛糞便中螺旋體門豐度顯著高于C35組，其原因?yàn)槁菪w門是產(chǎn)酸菌，主要以碳水化合物為營養(yǎng)來源，能將碳水化合物轉(zhuǎn)化為簡單的揮發(fā)性脂肪酸［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，C35組牦牛糞便中髕細(xì)菌門極顯著高于C65組。但目前對該菌的作用還不了解［27］，有待進(jìn)一步研究。藍(lán)藻菌門為化能自養(yǎng)菌，其以二氧化碳為碳源，通過氧化氮、磷等營養(yǎng)元素為自身提供能量，來合成有機(jī)物質(zhì)［28-29］。本研究發(fā)現(xiàn)，C35組牦牛糞便中藍(lán)藻菌門極顯著高于C65組。而反芻動物主要以粗飼料為食，糞便富集藍(lán)藻菌門可能與飼糧組成有關(guān)。放線菌門隸屬于革蘭氏陽性菌，大多是腐生菌，可引起腸道疾?。?0］。在本研究中，C35組牦牛糞便中放線菌門的相對豐度顯著高于C65組，表明飼喂高精粗比飼糧（65∶35）可能會影響腸道健康。

反芻動物糞便中發(fā)現(xiàn)數(shù)量最多的細(xì)菌屬是瘤胃球菌科［31-32］。但在本試驗(yàn)中，牦牛糞便中的細(xì)菌是以UCG-005 屬為主，這與Caporaso 等［31］和Meale 等［32］的結(jié)果有差異，可能是由于牦牛品種的特殊性、飼糧精粗比、飼養(yǎng)環(huán)境不同導(dǎo)致。本研究發(fā)現(xiàn)，C35組牦牛糞便中瘤胃球菌屬的豐度極顯著高于C65組。而反芻動物胃腸道中的瘤胃球菌屬通過分解宿主消化系統(tǒng)的纖維素來獲取營養(yǎng)，瘤胃球菌屬與纖維素酶和半纖維素酶［33-34］通過協(xié)同作用將飼糧中的纖維轉(zhuǎn)化為宿主所需的營養(yǎng)素。結(jié)果表明，飼喂低精粗比飼糧可提高牦牛糞便中瘤胃球菌屬豐度值。毛螺菌科能夠降解飼料中的纖維素和半纖維素，并參與機(jī)體能量代謝［35-36］。本研究中，C35組牦牛糞便中毛螺菌科_NK3A20 群菌屬的豐度顯著高于C65組，表明飼糧中精飼料的提高會降低牦牛糞便中毛螺菌科的豐度值。在本試驗(yàn)中，C65組牦牛糞便中密螺旋體屬顯著高于C35組。但目前對密螺旋體屬的作用尚不清楚。擬普雷沃氏菌屬會產(chǎn)生大量的琥珀酸及乙酸，有利于維持腸道穩(wěn)態(tài)［37］。在本試驗(yàn)中，C65組牦牛糞便中擬普雷沃氏菌屬顯著高于C35組，這表明飼喂高精粗比飼糧更有利于牦牛的腸道健康。

3.3 不同精粗比飼糧對牦牛糞便菌群代謝途徑及功能的影響

通過PICRUSt 軟件可以預(yù)測微生物菌群的代謝通路，對牦牛糞便微生物菌群進(jìn)行KEGG 通路的功能性注釋后可以得出，功能通路主要富集于碳水化合物代謝、輔助因子和維生素代謝、氨基酸代謝、萜類和多酮類代謝、復(fù)制和修復(fù)、能量代謝，這些通路對反芻動物胃腸道微生物群落的生長繁殖起到了重要作用［38］。能量是飼料的重要組成部分，碳水化合物是牦牛的主要能量來源［39］，氨基酸對牦牛體內(nèi)的生理生化功能起調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)其生長，改善生產(chǎn)性能［40］，并且氨基酸代謝與飼糧組成緊密相關(guān)［41］。由此可以看出，在牦牛的生長過程中，碳水化合物代謝與氨基酸代謝尤為重要。核苷酸代謝多數(shù)以輔酶或輔助因子形式存在，可以參與動植物的能量代謝［42］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C65組核苷酸代謝、復(fù)制和修復(fù)、翻譯、其他次生代謝物的合成、細(xì)胞生長和死亡的基因家族相對豐度極顯著高于C35組。本研究推測，飼糧中精粗比為65∶35 有助于牦牛能量代謝通路的上調(diào)。

4 結(jié)論

通過研究不同精粗比飼糧對牦牛糞便微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響得出，飼糧中精粗比會影響牦牛糞便菌群的多樣性與豐富度。且飼喂精粗比為65∶35 的飼糧可以促進(jìn)牦牛糞便中非纖維降解菌的增殖，提高擬普雷沃氏菌屬的豐度值，但抑制毛螺菌科的生長。