盧煒，劉超，盧勁曄，陸江*

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

肥胖是一種全球流行的代謝病，可降低人類生活質(zhì)量，縮短平均壽命[1]。肥胖的特征主要包括皮下脂肪組織和內(nèi)臟器官中過量的脂肪積累以及高血脂，而且肥胖還可增加許多慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，特別是2型糖尿病、心血管疾病和肝臟疾病等[2]。目前，我國成年居民的超重和肥胖率超過50%，呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢[3]。肥胖的預(yù)防和治療已經(jīng)成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題。相似地，肥胖也成為犬最常見的代謝性疾病之一，近年來發(fā)病率不斷升高，成為寵物行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)問題。然而，現(xiàn)有減肥藥的療效有限，并可能出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用[4]，預(yù)防治療肥胖的新策略仍然是當(dāng)前領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

近年來，中草藥由于具有療效確切、毒副作用少等優(yōu)勢已被廣泛用于肥胖的防治[5]。國家市場監(jiān)督管理總局規(guī)定了50多種藥食同源的中藥可作為具減肥功能保健品的原料藥。荷葉是一種藥食同源的中藥，除了具有清心解暑、活血化瘀、涼血止血、升發(fā)清陽、消風(fēng)祛濕等功效，還具有減肥降脂作用[6]。荷葉堿(nuciferine，NUC)是從荷葉中獲得的一種含芳香環(huán)的生物堿，是荷葉發(fā)揮減肥降脂作用的主要活性成分[7]。然而，NUC水溶解性小，口服生物利用度低，現(xiàn)有大量研究中常使用助溶劑來提高其生物利用度，相關(guān)直接口服NUC的試驗(yàn)研究較少，不方便NUC相關(guān)飲食產(chǎn)品的開發(fā)。本試驗(yàn)以比格犬為動(dòng)物模型，研究了飼料中直接添加不同劑量NUC對(duì)高脂飲食犬的影響，以評(píng)估NUC的安全性和抗肥胖效果，從而為NUC的相關(guān)抗肥胖產(chǎn)品開發(fā)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只比格犬，雄性，3歲，體重10 kg左右購于江蘇泰斯特生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(蘇)2021-0010。

1.2 主要試劑

荷葉堿(純度>98%)，購于Med Chem Express公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

36只比格犬以正常飼糧進(jìn)行適應(yīng)性飼喂2周后，隨機(jī)等分為6組：正常飼糧組(NCD組)、含0.1% NUC正常飼糧組(ND+NUC組)、高脂飼糧組(HFD組)、含0.05% NUC高脂飼糧組(HFD+0.05% NUC組)、0.1% NUC高脂飼糧組(HFD+0.1% NUC組)和0.15% NUC高脂飼糧組(HFD+0.15% NUC組)。然后，各組分別飼喂各自飼糧，試驗(yàn)期為8周。整個(gè)試驗(yàn)過程中，所有犬均單籠飼養(yǎng)于環(huán)境溫度為(25±2)℃、室內(nèi)濕度為60%左右的動(dòng)物房中，每天8：30和16：30各飼喂1次，每次進(jìn)食15 min，自由飲水。正常飼糧參考《犬營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NRC—2016)配制，各組飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧的組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %

1.4 體重與采食量測定

試驗(yàn)前與試驗(yàn)后分別稱量體重。每天觀察記錄采食情況，計(jì)算每天采食量，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)計(jì)算平均日采食量。

1.5 皮下脂肪厚度測定

參考郭世洪[8]的方法，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使用超聲診斷儀(型號(hào)：MyLab 9，意大利Esaote公司)，采用7.5 MHZ線陣探頭，對(duì)犬腹部臍孔后方進(jìn)行扇形移動(dòng)掃描，根據(jù)B超影像測量皮下脂肪厚度，連續(xù)測量3次取平均值。

1.6 血液樣本采集與指標(biāo)測定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空腹采集各組犬的頭靜脈血液，一部分直接放于-80 ℃保存，另一部分在4 ℃下3 000 r·min-1離心15 min得到血清，-80 ℃保存。使用動(dòng)物血球分析儀(IDEXX Laboratories，Inc.美國)測定血常規(guī)，使用動(dòng)物生化分析儀(IDEXX Laboratories，Inc.美國)測定血液生化指標(biāo)，使用動(dòng)物血?dú)夥治鰞x(南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司)測定血中電解質(zhì)含量，所有檢測均用儀器自帶試劑盒并按操作說明進(jìn)行。

1.7 皮下脂肪組織HE染色

使用舒泰麻醉后，立即切取腹股溝脂肪組織，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。蘇木精-伊紅(HE)染色主要操作如下：將收集的部分腹股溝脂肪組織樣本迅速解凍后用4%多聚甲醛在4 ℃下過夜固定，石蠟包埋，制成4 μm厚切片，然后用HE染色，在顯微鏡(奧林巴斯，日本)下觀察并獲取圖像。用Image J軟件測量脂肪細(xì)胞大小，并以每2 000 μm2脂肪細(xì)胞面積為間隔點(diǎn)，計(jì)算各面積區(qū)域內(nèi)的脂肪細(xì)胞比例。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 23.0軟件單因素方差分析，然后用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析。P<0.05，表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P<0.01，表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 荷葉堿對(duì)高脂飲食犬體重體脂和采食量的影響

從表2可知，各組間的平均采食量無顯著差異；與NCD組比較，NCD+0.1% NUC組的初始體重、終末體重、體重增量及皮下脂肪厚度均無顯著變化，而HFD組終末體重、體重增量及皮下脂肪厚度均顯著升高(P<0.05)；與HFD組比較，HFD+0.1% NUC組和HFD+0.15% NUC組的終末體重、體重增量及皮下脂肪厚度均顯著降低(P<0.05)，HFD+0.05% NUC組體重增量顯著降低(P<0.05)。

表2 各組間體重、采食量和皮下脂肪厚度的比較

2.2 荷葉堿對(duì)高脂飲食犬血球指標(biāo)的影響

從表3可知，各組間的血常規(guī)參數(shù)無顯著差異，且均在正常參考范圍內(nèi)，這表明添加荷葉堿對(duì)犬血常規(guī)無影響。

表3 各組間血常規(guī)參數(shù)的比較

2.3 荷葉堿對(duì)高脂飲食犬血清生化指標(biāo)的影響

從表4可知，與NCD組比較，HFD組血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等血脂指標(biāo)升高(P<0.05)，總膽紅素(TBIL)和堿性磷酸酶(ALT)等指標(biāo)顯著升高(P<0.05)。與HFD組比較，HFD+0.1% NUC組的TG、LDL-C、TBIL和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平顯著降低(P<0.05)，HFD+0.15% NUC組的TG和LDL-C顯著降低(P<0.05)，HFD+0.05% NUC組的血液生化指標(biāo)無顯著變化(P>0.05)。

表4 各組間血液生化指標(biāo)的比較

2.4 荷葉堿對(duì)高脂飲食犬血中電解質(zhì)的影響

從表5可知，各組間的血液中氯、鈉、鉀、鈣和磷等電解質(zhì)水平無顯著差異。

表5 各組間血液電解質(zhì)指標(biāo)的比較 mmol/L

2.5 荷葉堿對(duì)高脂飲食犬脂肪組織的影響

各組脂肪細(xì)胞大小和分布比較結(jié)果見圖1。

腹股溝脂肪組織的HE染色結(jié)果顯示，在相同視野內(nèi)，與NCD組比較，HFD組脂肪細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞擴(kuò)張，添加不同劑量NUC可使脂肪細(xì)胞面積變小及數(shù)量增加(圖1A)。HFD組脂肪細(xì)胞面積分別高于NCD組和NCD+0.1% NUC組，HFD+0.1% NUC組、HFD+0.15% NUC組脂肪細(xì)胞面積低于HFD組和NCD+0.05% NUC組(圖1B)。NCD組和NCD+0.1% NUC組中，面積小于2 000 μm2脂肪細(xì)胞的比例達(dá)80%，HFD組中的脂肪細(xì)胞(S>2 000 μm2)的比例約為75%，HFD+0.1% NUC組和HFD+0.15% NUC組中脂肪細(xì)胞(S>2 000 μm2)的比例約為40%(圖1C)。

A.脂肪組織HE染色代；B.脂肪細(xì)胞大小比較；C.不同面積區(qū)間的脂肪細(xì)胞分布情況。##P<0.01。

3 討論

肥胖是由于機(jī)體長期能量攝入大于消耗，導(dǎo)致過剩的能量以甘油三酯形式堆積與脂肪組織的一種慢性代謝性疾病[9]。飲食結(jié)構(gòu)的改變與肥胖關(guān)系密切，高能高脂飲食是肥胖的主要病因[10]。因此，高脂飲食已經(jīng)成功廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物肥胖模型的制備[11-13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，HFD組比格犬的體重、皮下脂肪厚度及血脂水平均高于NCD組，提示肥胖模型建立成功。而NUC能夠有效改善這些病理癥狀，表明直接補(bǔ)充NUC對(duì)肥胖防治具有積極作用。

脂肪組織具有能量維持能力和儲(chǔ)存能力，脂肪組織中脂肪含量的平衡與脂肪形成和脂解這兩個(gè)相反的過程有關(guān)[14]。在多種因素(如過多能量攝入)引起正能量平衡時(shí)，脂肪細(xì)胞可通過增加細(xì)胞數(shù)量(脂肪形成)和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量(肥大)促進(jìn)脂肪組織病理性擴(kuò)增，最終導(dǎo)致肥胖[15-16]。脂肪形成主要受過氧化物酶體增殖激活受體(PPARγ)和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族(C/EBP)調(diào)節(jié)[17]；脂解主要由脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感脂肪酶(HSL)參與的將甘油三酯水解為脂肪酸和甘油，以滿足身體能量需求的一種脂肪代謝途徑，脂解激活可減少脂肪組織中存儲(chǔ)的脂肪含量[18]。因此，一種能夠調(diào)節(jié)這兩個(gè)過程的天然化合物可能會(huì)極大改善肥胖患者脂肪組織中的脂肪積累。劉曉琴等[19]研究表明荷葉生物堿能夠抑制前脂肪細(xì)胞3T3-L1生長，提示荷葉生物堿能夠抑制脂肪形成。張麗靜等[20]研究表明荷葉堿能夠通過增加脂肪酶活性促進(jìn)脂解代謝改善C57小鼠高脂血癥。藥動(dòng)學(xué)研究表明，荷葉堿藥物動(dòng)力學(xué)體內(nèi)過程具有顯著的種屬差異性，在比格犬體內(nèi)吸收少且代謝快，這可能影響NUC生物利用度和藥效[21]。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食可引起犬皮下脂肪組織擴(kuò)張和脂肪細(xì)胞肥大，補(bǔ)充0.1% NUC和0.15% NUC均可減輕高脂飲食引起犬脂肪細(xì)胞肥大，提示在0.1%和0.15%劑量下NUC的抗肥胖作用不受其藥動(dòng)學(xué)影響。

長期攝入高脂食物容易引起機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝的紊亂，從而引起肝細(xì)胞損傷[22]。血中TBIL和ALT是臨床上常用的肝功能生化指標(biāo)，兩者含量升高往往提示肝功能受損。本研究中，HFD組的TBIL和ALT水平高于NCD組，補(bǔ)充0.1% NUC可降低TBIL和ALT水平，這提示0.1% NUC能夠改善高脂飲食引起的肝酶變化。然而補(bǔ)充0.15% NUC沒有這一作用，其具體原因還需進(jìn)一步研究。此外，補(bǔ)充NUC對(duì)比格犬血球參數(shù)和電解質(zhì)無影響。

對(duì)于人類而言，臨床上常用減肥藥物及手術(shù)等方法治療肥胖，但是對(duì)于肥胖犬貓而言，由于各種因素的限制，獸醫(yī)臨床上很少采用減肥藥物或手術(shù)減肥。美國曾推出過兩種通過抑制食欲來達(dá)到減肥效果的針對(duì)寵物犬貓減肥的處方藥，但寵物市場中并未受到廣泛接受，目前已撤出寵物市場。 寵物減肥處方糧經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，操作方便，效果優(yōu)良，可能會(huì)成為寵物減肥的新方向。本研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中直接添加荷葉堿可以有效減輕高脂飲食誘導(dǎo)肥胖犬的體重和皮下脂肪堆積，這表明荷葉堿可直接作為功能性飼料添加劑用于防治犬的肥胖癥，綠色安全有效，為寵物犬抗肥胖處方糧的研制提供新思路。

綜上，補(bǔ)充NUC對(duì)高脂飲食犬具有抗肥胖作用，無安全問題，其中0.1% NUC效果最佳。