劉育含，李 琦，張 娜，楊裕坤

1.臨江市畜牧總站，吉林臨江 134600；2.臨江市花山鎮(zhèn)綜合服務(wù)中心，吉林臨江 134600；3.臨江市動物疫病預(yù)防控制中心，吉林臨江 134600

牛病毒性腹瀉（BVD）可引起牛黏膜感染，腹瀉，及母牛流產(chǎn)等癥狀，是一種高度接觸性、自限性的傳染病。牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）是一種主要感染牛、羊、豬等哺乳動物的重要傳染性病原體，由于BVDV 在全球廣泛流行，給全球養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。因此，BVDV 的準確診斷對于該病的防治意義重大。近年來，BVDV 診斷方法也在不斷發(fā)展和完善，本文對目前應(yīng)用較廣泛的BVDV 診斷方法進行了概述，為牛病毒性腹瀉的診斷和防治提供了理論依據(jù)。

1 BVDV 病原學(xué)特征及流行病學(xué)

BVDV 于1946 年在紐約首次被發(fā)現(xiàn)和分離，自此，BVDV 開始在世界各地被發(fā)現(xiàn)。目前，許多國家的感染情況十分嚴重，BVDV 血清陽性率已達到50%以上。BVDV 血清陽性率在北美國家為75%～84%，在中東國家為14% ～15%， 在南美國家為22.2%～90%，在歐洲國家為53.27%～18.19%，在亞洲國家為7%～20.21%，在澳大利亞超過89%。BTM BVDV Ab 的檢測還可以確定奶牛群的整體抗體狀態(tài)，可以替代血清學(xué)樣本的檢測方法，降低流行病學(xué)調(diào)查的成本。例如，愛爾蘭BTM BVDV 抗體的陽性率高達73%。近年來的分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也證實了BVDV 在多基因型中的廣泛流行，這給當前BVDV 的防控帶來了困難。亞型的患病率因地區(qū)而異。在美國，已經(jīng)確定了三種主要亞型（BVDV-1a、1b 和BVDV-2a）。PI 動物主要持續(xù)感染BVDV-1b。在波蘭流行的基因型主要有BVDV-1b 和1d 兩種。土耳其和阿根廷具有相同的流行亞型，主要是BVDV-1a，1b 和BVDV-2。在中國，基因型BVDV-1b、BVDV-1m 和BVDV-1q 最為普遍。然而，以前的大多數(shù)研究都涉及中國西部的肉牛和牦牛。目前尚無關(guān)于中國西部大型奶牛場BVDV 患病率的系統(tǒng)報告。

BVDV-1 和BVDV-2 這兩個毒株屬于黃病毒科中的瘟病毒屬，與人類丙型肝炎病毒（HCV）基因組同源。目前，國際病毒分類委員會（ICTV）認可了4 種已知的瘟病毒物種：豬瘟病毒（CSFV）、邊境病毒（BDV）、BVDV-1 和BVDV-2，是有囊膜的單股正鏈RNA 分子,全長約12.3 kb，基因組兩端為非編碼區(qū)，僅有一個開放閱讀框，編碼一個大多聚蛋白，在酶的作用下形成4 種結(jié)構(gòu)蛋白和8 種非結(jié)構(gòu)蛋白。目前對于BVDV 的研究多集中在非結(jié)構(gòu)蛋白的E2 蛋白編碼區(qū)，因為E2 蛋白編碼區(qū)是BVDV 基因組內(nèi)變異性最高的區(qū)域之一，編碼區(qū)的變異會直接影響到病毒的診斷結(jié)果以及對應(yīng)編碼區(qū)疫苗的效用，所以要對其進行持續(xù)性研究。

牛病毒性腹瀉是危害養(yǎng)牛業(yè)嚴重疾病之一，它被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定報告動物疾病，在中國被列為三類動物疾病。自1980 年BVDV 首次從中國分離出來以來，大量流行病學(xué)調(diào)查顯示中國大部分地區(qū)都出現(xiàn)過BVDV 感染。

持續(xù)感染的牛是病毒傳播的主要來源，急性感染的牛以及其它反芻動物，無論是急性感染還是持續(xù)感染，都可能傳播病毒。直接接觸的傳播效率最高。不同地區(qū)牛病毒性腹瀉患病率的差異或在以前沒有BVDV 的畜群中引入病毒通常與特定的流行病學(xué)因素有關(guān)，例如牛群密度，動物交易及放牧。根據(jù)感染病毒株的牛群免疫狀態(tài)和致病性，感染BVDV引起的經(jīng)濟損失程度不同。將感染引入完全易感的牛群會造成嚴重的損失，感染高毒力BVDV 毒株會導(dǎo)致嚴重的臨床癥狀和急性感染后的死亡，也造成重大的經(jīng)濟損失。因此，控制計劃的成本效益分析高度依賴于不同情況下新感染的風險以及所涉及的病毒株。

2 診斷方法

2.1 臨床診斷

牛病毒性腹瀉潛伏期為7 ～14 d，牛病毒性腹瀉按臨床表現(xiàn)可分為兩種類型：急性型和慢性型。慢性型病牛會出現(xiàn)明顯的急性高熱，以及不同程度的黏膜病變，例如：鼻鏡糜爛、口腔糜爛、齒齦發(fā)紅、眼角產(chǎn)生漿液性分泌物。慢性病牛由于蹄葉炎和趾間皮膚糜爛壞死常導(dǎo)致跛行?；疾『? ～6個月死亡，也存在少數(shù)病例病程超過一年。妊娠母牛感染BVDV 后，會導(dǎo)致流產(chǎn)，同時幼牛犢發(fā)生先天免疫缺陷、小腦發(fā)育不全等，在妊娠后期感染BVDV，還會導(dǎo)致母牛產(chǎn)下免疫耐受的持續(xù)性感染（Persistently infected，PI）小牛，臨床無明顯癥狀，但免疫水平低下，且持續(xù)向牛群釋放病毒，成為重要的傳染源，因為它們持續(xù)、大量地排出BVDV。病毒又可感染多個器官系統(tǒng)，BVDV 感染也會影響動物的免疫力，使動物更容易感染其他疾病，所以牛病毒性腹瀉往往發(fā)生在大型牛群中。由于BVDV 引起的臨床癥狀區(qū)別很大，癥狀范圍可從亞臨床癥狀到高死亡率的急性感染。所以想確診患病牛所感染的病毒種類，還需繼續(xù)進行實驗室診斷。

2.2 病毒分離

病毒分離培養(yǎng)多用于新病毒出現(xiàn)無法界定種屬時以及多病毒共同感染時，整個操作過程對于實驗室硬件設(shè)施要求較高，實驗周期較長，病毒分離率較低，一般不用大規(guī)模檢測?？蓪颖具M行抗生素處理后，接種至細胞、雞胚或動物體中，若實驗條件合理，病毒將發(fā)生增殖，增殖后可進行病毒的鑒定及病毒感染性的定量測定。BVDV 在不同的毒株之間有著明顯的遺傳和抗原異質(zhì)性特征，根據(jù)BVDV是否使細胞病變將其分為致細胞病變型和非致細胞病變型。通常情況下，分離牛病毒性腹瀉病毒最常用到的細胞為MDBK 細胞，阿根廷學(xué)者A C Odeón 分別 用MDBK、BoTur、BHK-21、RD-420、NCL-1、PKZ等細胞系進行BVDV 病毒的體外擴增，評估細胞系、收獲時間和感染方案的效果。發(fā)現(xiàn)MDBK 和BoTur細胞系易受感染，而BHK-21 和PKZ 則不然，但病毒感染后期會在MDBK 和NCL-1 中發(fā)生更穩(wěn)定的增殖。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗抗體檢測（ELISA）

ELISA 方法是當下較常用的一種血清學(xué)診斷方法，操作簡單、特異性好，但是制備相應(yīng)的特異性抗原一直是技術(shù)難點，韓美婧[1]以BVDV 全病毒基因為免疫原，成功篩選出抗BVDV 結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體，建立ELISA 診斷方法，經(jīng)條件優(yōu)化和驗證，該方法可信度高。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）

LAMP 是一種對設(shè)備要求不高，具有簡單高效、靈敏度強、特異性強、經(jīng)濟適用等優(yōu)點，在發(fā)展中國家基層測試試驗中具有良好應(yīng)用前景，更適合實驗條件有限的實驗室使用的核酸擴增技術(shù)。趙洋等針對BVDV 保守區(qū)域BVDV5′UTR 設(shè)計RT-LAMP 特異性引物，優(yōu)化條件后成功建立BVDV RT-LAMP 檢測方法，靈敏度為1×102copies/μL。

2.5 實時熒光定量PCR

PCR檢測方法是牛病毒性腹瀉檢測的“金標準”，多種PCR 方法包括巢式PCR、多重診斷PCR、實時PCR 等，都具有良好的穩(wěn)定性以及時效性，其中實時熒光定量PCR 近些年發(fā)展迅速，該診斷方法自動化程度高，操作簡單，靈敏度高，特異性強，結(jié)果也更加直觀易分析。徐曉琪[2]建立了可區(qū)分牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、赤羽病病毒的多重熒光定量PCR 檢測方法，其中牛病毒性腹瀉病毒的最低檢出限為3.5 copies/μL，可用于快速診斷牛繁殖障礙等癥狀的感染病原種類。麻寶藝[3]等建立了可以快速檢測牛病毒性腹瀉病毒1型和2 型的雙重熒光定量PCR 檢測方法。

2.6 微滴氏數(shù)字PCR

數(shù)字PCR 是一種新型核酸定量檢測方法，通過制備微滴，將核酸模板包裹至微滴中，每個微滴內(nèi)核酸模板數(shù)少于或者等于1 個，再次擴增后，每個包含核算模板的微滴都可以檢測出熒光信號，可以做到絕對定量。王旭東[4]等根據(jù)NCBI 已發(fā)表的BVDV 序列，設(shè)計擴增引物，連接至pUC-T 載體上，制備陽性標準品，再次設(shè)計引物探針，優(yōu)化條件，最終建立BVDV 檢測數(shù)字PCR，最低檢出限為1.9 copies/μL。

3 預(yù)防與控制

牛病毒性腹瀉病毒很難在體外環(huán)境長時間生存，但在低溫條件下可保持一定的穩(wěn)定性，凍干后真空保存于-60 ～-70 ℃可以存活數(shù)年，在26 ～37 ℃溫度條件下可生存24 h，但基本喪失活性，在56 ℃下數(shù)分鐘內(nèi)就將完全喪失活性[5]。

BVDV 的防控主要取決于幾個因素，包括對病毒株和變異株的嚴格和持續(xù)監(jiān)測，開發(fā)具有高通量檢測能力的最新診斷方法以及開發(fā)同源疫苗。雖然我國自主研發(fā)的BVDV 疫苗已經(jīng)上市，但都屬于BVDV-1 基因型，因此建議在我國開展BVDV-2 基因型聯(lián)合免疫或開發(fā)BVDV-1 和BVDV-2 基因型聯(lián)合疫苗,且病毒性腹瀉的反復(fù)流行說明該疾病的受重視程度仍有待提高，若可以聯(lián)動政府、行業(yè)、企業(yè)及養(yǎng)殖戶，多方共同努力，加強對牛病毒性腹瀉的認知，制定牛病毒性腹瀉控制計劃或出臺行業(yè)規(guī)范，嚴格的把控預(yù)防、養(yǎng)殖、流通以及患病后處理等多個環(huán)節(jié)，努力實現(xiàn)牛病毒性腹瀉的基本控制。