慕曉泉，尹 悅，李 博，楊 楊，王 坤

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室，河北 保定 071000）

近年來，土壤重金屬污染已造成嚴(yán)重的環(huán)境問題。根據(jù)中國生態(tài)環(huán)境狀況公報和全國土壤污染調(diào)查公報顯示，Cd 已成為影響土壤環(huán)境質(zhì)量的首要污染物［1］，且Cu 和Pb 點位超標(biāo)率分別達到了2.1%和1.5%［2］。河北省部分地區(qū)農(nóng)田土壤重金屬超標(biāo)問題也相對嚴(yán)重［3］。在自然土壤環(huán)境下，重金屬多以復(fù)合污染為主［4］。與單一重金屬脅迫相比，自然環(huán)境下復(fù)合污染更為普遍，對生物造成劇烈的毒性作用［5］。

蚯蚓作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的指示生物，對重金屬污染土壤有一定凈化能力。目前針對蚯蚓對重金屬污染的適應(yīng)性已有大量研究［6-7］，但有關(guān)蚯蚓對土壤重金屬復(fù)合污染響應(yīng)的研究鮮有報道［8］。探究蚯蚓響應(yīng)復(fù)合重金屬污染的敏感性，更能體現(xiàn)污染對蚯蚓種群、個體水平上的影響。有關(guān)蚯蚓在生化水平上對重金屬的響應(yīng)情況（如SOD、GSH、GPx、AChE 等生物標(biāo)志物的響應(yīng)）已有很多報道［6］，例如Wang 等［7］在高、低Cd 污染下白頸腔蚓（Metephere californica）的互換暴露試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原位高Cd 污染下該蚯蚓體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、還原型谷胱甘肽（GSH）被誘導(dǎo)，具有較強的解毒能力；原位低Cd 污染下的蚯蚓體內(nèi)丙二醛（MDA）含量上升，其機體產(chǎn)生氧化損傷、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。Wu 等［9］發(fā)現(xiàn)單Pb、Cd 脅迫可導(dǎo)致蚯蚓體腔細胞纖維素酶活性和DNA 損傷，但在Cd-Pb復(fù)合污染下蚯蚓纖維素酶的活性被顯著抑制。

綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)（IBR）于2002 年由Benoit beliaeff和Thierry burgeot［10］創(chuàng) 立，又由Wilfried sanchez 等［11］在2013 年進一步改進并推出了新的指標(biāo)計算方法——IBRv2。該方法根據(jù)整合多個生物標(biāo)志物的響應(yīng)來評估蚯蚓暴露于污染物的狀態(tài)，用來監(jiān)測蚯蚓在復(fù)合污染土壤下的響應(yīng)情況。Liang 等［12］利用IBRv2 分析發(fā)現(xiàn)，微塑料（MPs）和Cd 復(fù)合污染增強了蚯蚓體內(nèi)各項抗氧化酶（SOD、GPx 和GST）的活性，其在蚯蚓抵抗污染物脅迫中發(fā)揮著重要作用。Zhang 等［13］計算IBRv2 指數(shù)發(fā)現(xiàn)，阻燃劑磷酸三苯酯（TPHP）脅迫顯著影響了蚯蚓體內(nèi)生物標(biāo)志物的響應(yīng)情況，這與TPHP 濃度和暴露時間密切相關(guān)，其中MDA 是最敏感響應(yīng)指標(biāo)。

針對蚯蚓種群來說，土壤重金屬污染可造成其種群結(jié)構(gòu)單一、降低多樣性、敏感種逐漸消失等問題，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與生態(tài)環(huán)境健康。在河北省原位重金屬污染土壤環(huán)境下，蚯蚓對重金屬污染響應(yīng)的相關(guān)研究較少。因此，研究原位復(fù)合重金屬（Cd、Cu 和Pb）污染土壤下，蚯蚓對重金屬的富集及其體內(nèi)主要生物標(biāo)志物的響應(yīng)，旨為明確土壤重金屬復(fù)合污染下蚯蚓的生態(tài)毒理效應(yīng)和進行土壤生態(tài)風(fēng)險評價與修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蚯蚓 供試蚯蚓為天錫杜拉蚓（Drawida gisti），取自河北省保定市農(nóng)田土壤，屬當(dāng)?shù)貎?yōu)勢野生種［14］。試驗前將蚯蚓放于清潔土（S0）中預(yù)培養(yǎng)7 d，選擇有環(huán)帶且生物量在1.09±0.2 g 的成蚓，進行暴露試驗。

1.1.2 供試土壤 供試土壤為河北省保定市原位重金屬污染土壤（3 種），類型為中壤質(zhì)潮土。清潔土壤（S0）取自安新縣大利銅廠附近農(nóng)田（E115°45′18″，N38°48′24″）；重金屬污染土壤（S1 和S2）取自安新縣大利銅廠附近（S1：E115°44′23″，N38°48′10″；S2：E115°43′56″，N38°48′4″），其污染源主要來自冶煉廠廢水、廢渣等。各樣點土壤樣品使用塑料鏟采集，采集深度為0～20 cm，采集方式為五點混合法，土壤樣品采集后經(jīng)室內(nèi)自然風(fēng)干，分別過1 mm 和0.15 mm 尼龍篩備用。供試土壤化學(xué)性質(zhì)如表1 所示。土壤重金屬含量如表2 和表3 所示，其中S0 土壤重金屬含量均未超過標(biāo)準(zhǔn)（GB15618—2018）［15］且內(nèi)梅羅指數(shù)為0.71，屬警戒級土壤；經(jīng)測定與分析后，S1 樣點下土壤Cd 和Cu 含量超標(biāo)，為Cd、Cu 復(fù)合污染土壤，其內(nèi)梅羅指數(shù)為3.8，屬重污染級土壤；S2 樣點下土壤Cd、Cu 和Pb 含量超標(biāo)，為Cd、Cu 和Pb 復(fù)合污染土壤，內(nèi)梅羅指數(shù)為11.34，屬重污染級土壤。

表1 各處理下土壤化學(xué)性質(zhì)（n=3,±SD）Table 1 Soil chemical properties in each treatment (n=3,±SD)

表2 土壤重金屬（Cd、Cu 和Pb）含量及內(nèi)梅羅指數(shù)（n=3,±SD）Table 2 Metal concentrations (Cd,Cu,and Pb) in different soil samples and Nemerow index (n=3,±SD)

表3 不同形態(tài)土壤重金屬（Cd、Cu 和Pb）含量（n=3,±SD）Table 3 Different fractions of soil metal (Cd,Cu,and Pb) concentrations (n=3,±SD) mg/kg

1.1.3 供試容器 供試容器為聚氯乙烯盒（PVC），長寬均為20 cm，高為10 cm。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗設(shè)置清潔土（S0）與兩種復(fù)合污染土（S1和S2）共3 種土壤處理，每處理設(shè)9 次重復(fù)。分別稱取過1 mm 尼龍篩的3 種土壤各1.0 kg，放入聚氯乙烯盒中培養(yǎng)28 d。取10 條生物量大小相近（1.09± 0.2 g）且具有環(huán)帶的蚯蚓放入各供試土壤中；培養(yǎng)過程中，在盒上蓋一層紗布以防止蚯蚓逃逸，保持土壤最大持水量65%左右，放于（23±2）℃恒溫下培養(yǎng)，分別于第7、14 和28 d 時采集蚯蚓樣品。將采集的蚯蚓樣品放入有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在25 ℃且避光條件下吐泥24 h，后用去離子水沖洗干凈，將部分蚯蚓樣品凍干，用于測定體內(nèi)重金屬含量，剩余蚯蚓樣品用液氮冷凍，后置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)貯存，待測生化指標(biāo)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 土壤化學(xué)性質(zhì)測定 采用電位計法【1:2.5（w/v）土/水】測定土壤pH；0.8 mol/L K2Cr2O7外加熱法測定土壤有機碳含量；凱氏定氮法測定土壤全氮含量；采用NaOH 熔融-鉬銻抗比色法測定土壤全磷含量；NaOH 熔融-火焰光度計法測定土壤全鉀含量；1 mol/L NH4OAc 交換法測定土壤陽離子交換量。

1.3.2 土壤重金屬含量測定 土壤全量重金屬（Cd、Cu 和Pb）采用HNO3-H2O2消解，土壤有效態(tài)重金屬（Cd、Cu 和Pb）采用二乙基三胺五乙酸（DTPA）—三乙醇胺（TEA）方法浸提，土壤可交換態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài)以及殘渣態(tài)重金屬（Cd、Cu 和Pb）采用BCR 連續(xù)提取法浸提，分別用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測定樣品中Cd、Cu 和Pb 含量。每批樣品設(shè)置3 個空白對照組和3 個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用土壤成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW07456 進行質(zhì)量控制，其中Cd、Cu 和Pb 的回收率分別為96%、95%和92%。

1.3.3 蚯蚓重金屬含量測定 取凍干后的蚯蚓進行磨樣并過0.15 mm 尼龍篩，稱取0.20 g 于玻璃消解管中，加入HNO3（優(yōu)級純）5 mL，使用消化爐進行消解，加熱過程中加入3 mL H2O2，待消解液基本澄清后，即視為消解完全，移出液體并定容至50 mL容量瓶中，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測定蚯蚓體內(nèi)Cd、Cu和Pb 含量。每批樣品設(shè)置3 個空白對照組和3 個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以GBW08571 作為蚯蚓分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行質(zhì)量控制，其中Cd、Cu 和Pb 的回收率分別為98%、97%和95%。

1.3.4 生化指標(biāo)測定 準(zhǔn)確稱取蚯蚓組織1.0 g，加入9 mL 的磷酸鹽緩沖液，在冰水浴條件下研磨成10%的勻漿，于3 000 r/min 的速度下離心10 min，取上清液待測。TP 含量采用考馬斯亮藍染色法；MDA 含量檢測采用硫代巴比妥酸法；GSH 的檢測采用還原型谷胱甘肽可與二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物反應(yīng)的方法；GPx 的檢測采用H2O2與還原型谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成H2O 及氧化型谷胱甘肽（GSSG）的方法；AChE 的檢測采用膽堿與巰基顯色劑反應(yīng)生成TNB（對稱三硝基苯，Sym-Trinitrobenzene）黃色化合物的方法。以上指標(biāo)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與計算方法

試驗數(shù)據(jù)使用 SPSS 22.0 進行統(tǒng)計，采用單因素方差分析（ANOVA）中的Duncan 檢驗法進行顯著性差異分析，顯著性差異水平設(shè)置為P＜ 0.05。使用Excel 2019 和 SigmaPlot 12.5 制圖。

蚯蚓體內(nèi)重金屬富集系數(shù)：

式中，BAF 為生物富集系數(shù)；Mew為蚯蚓體內(nèi)重金屬含量；Ms為土壤重金屬含量。

綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)（IBRv2）指數(shù)計算過程為（2）～（5）［16］：（此方法需要預(yù)先確定清潔條件下的生物標(biāo)志物作為對照［17］。本研究采用蚯蚓生長于土壤重金屬含量均未超過標(biāo)準(zhǔn)（GB15618—2018）的清潔土（S0）時的生化因子測定值作為對照）

式中，Yi為某生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)化值，Xi為各處理組中該生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)，X0為對照組數(shù)據(jù)的平均值。

式中，μ表示Yi的平均值，s表示Yi的標(biāo)準(zhǔn)差。

式中，A表示單個生物標(biāo)志物系數(shù)的偏離指數(shù)，Zi和Z0分別為某處理組和對照組該生物標(biāo)志物指數(shù)，A＞ 0 表示該生物標(biāo)志物被誘導(dǎo)，A＜ 0 時則表示該生物標(biāo)志物受到抑制。

式中，IBR表示整合生物標(biāo)志物指數(shù)。

內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)計算過程為（6）～（7）［18］：

式中，Pi為土壤重金屬元素i的環(huán)境質(zhì)量指數(shù)；Ci為重金屬i的實測值；Si為重金屬i的農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險篩選值。

式中，Pn為內(nèi)梅羅綜合污染指數(shù)，Pave為各污染物中環(huán)境質(zhì)量指數(shù)Pi的算術(shù)平均值，Pmax為各污染物中環(huán)境質(zhì)量指數(shù)Pi的最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同重金屬污染土壤下天錫杜拉蚓生物量變化

各重金屬污染土壤處理（S0、S1 與S2）下不同暴露時間（7、14 和28 d 時）天錫杜拉蚓蚓的生物量變化，如圖1 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在S1 和S2 處理下，隨暴露時間的增加，蚯蚓生物量均呈顯著下降趨勢（36.7%～58.2%，P＜ 0.05，圖1）。

圖1 各土壤處理下天錫杜拉蚓生物量隨暴露時間的變化情況Fig. 1 Changes of biomass of Drawida gisti with the prolonged exposure under each soil treatment

暴露7 d 時，S2 處理下蚯蚓生物量顯著降低（P＜ 0.05），S0 與S1 處理間無差異（P＞ 0.05）；14 d 時，其與暴露7 d 時結(jié)果相似，S2 處理下生物量顯著低于S0 和S1 處理（P＜ 0.05）；28 d 時，S1 處理下蚯蚓生物量高于S0 和S2 處理（P＜ 0.05）。

2.2 不同重金屬污染土壤下天錫杜拉蚓體內(nèi)Cd、Cu 和Pb 含量及其富集系數(shù)

各土壤處理下，天錫杜拉蚓體內(nèi)重金屬（Cd、Cu 和Pb）含量變化，如圖2 所示。

圖2 3 種重金屬污染土壤處理下天錫杜拉蚓體內(nèi)Cd、Cu和Pb 含量隨暴露時間的變化情況Fig. 2 Concentrations of Cd,Cu and Pb in Drawida gisti with the exposure durations under three levels of metal contaminated soils

隨暴露時間的延長，分別在S1 與S2 處理下，蚯蚓體內(nèi)Cd 含量均呈顯著上升趨勢（P＜ 0.05）。分別暴露至7 與14 d 時，蚯蚓Cd 含量均呈減少趨勢（P＜ 0.05）；僅在28 d 時，Cd 含量增加（P＜ 0.05）。

隨暴露時間的延長，S1 處理下蚯蚓Cu 含量顯著增加（P＜ 0.05）；S2 處理下蚯蚓Cu 含量無顯著變化（P＞ 0.05）。另外，各暴露時間下蚯蚓Cu 含量隨土壤Cu 含量的增加而增加（P＜ 0.05）。

分別在S1 與S2 處理下，蚯蚓Pb 含量隨暴露時間的增加呈顯著上升趨勢，其中14 d 時顯著增加（P＜ 0.05）。各處理下，分別在7d 與28 d 時，蚯蚓Pb 含量無顯著變化（P＞ 0.05），但14 d 時S2處理下的蚯蚓Pb 含量顯著增加（P＜ 0.05）。

各處理下天錫杜拉蚓Cd、Cu 和Pb 的富集系數(shù)（BAFCd、BAFCu和BAFPb），如表4 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著暴露時間的增加，S1 與S2 處理下蚯蚓BAFCd均大于1（分別為5.64～7.20；1.58～2.49）；28 d時蚯蚓BAFCd呈顯著增加趨勢（分別為7.20 與2.46 g，P＜ 0.05）。另外，在各暴露時間下，蚯蚓BAFCd隨土壤Cd 含量的增加均呈顯著下降趨勢（P＜ 0.05）。

表4 天錫杜拉蚓對土壤重金屬（Cd、Cu 和Pb）的富集系數(shù)（n=3,±SD）Table 4 Bioaccumulation factor of the metals (Cd,Cu and Pb) of Drawida gisti (n=3,±SD)

S1 處理下，分別暴露至14 與28 d 時，蚯蚓BAFCu（0.42 和0.40）高 于7 d 時 的BAFCu（0.27）；S2處理下蚯蚓BAFCu無顯著差異（P＞ 0.05）。在暴露7、14 和28 d 時，蚯蚓BAFCu均呈顯著降低趨勢（范圍分別為0.21～0.85，0.29～0.66和0.27～0.67，P＜ 0.05）。

在各土壤處理下，蚯蚓BAFPb均在暴露14 d后顯著增加（P＜ 0.05）；同時，各暴露時間下蚯蚓BAFPb均顯著降低（范圍分別為0.26～1.97、0.45～2.88 和0.43～2.87）。

綜合來看，分別在S1 與S2 污染土處理下，天錫杜拉蚓對Cd、Cu 和Pb 富集能力的大小規(guī)律均表現(xiàn)為BAFCd＞ BAFPb＞ BAFCu，表明該蚯蚓對Cd 的富集能力最強（P＜ 0.05，表4），且S1 處理下蚯蚓BAF（Cd、Cu 和Pb）大于S2 處理下結(jié)果。

2.3 天錫杜拉蚓在生化水平上對重金屬污染的響應(yīng)

土壤重金屬污染處理下，暴露7、14 和28 d 后天錫杜拉蚓體內(nèi)各項生化指標(biāo)，如圖3 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3a），隨著暴露時間的增加，僅在S1 處理下暴露14 d 時蚯蚓體內(nèi) TP 含量顯著增加（P＜ 0.05），而S2 處理下TP 含量無顯著變化（P＜ 0.05）。暴露7 d時，S1 處理下蚯蚓TP 含量顯著下降（P＜ 0.05）；S1與S2 處理下暴露14 d 時，蚯蚓TP 含量顯著高于S0處理（P＜ 0.05）；28 d 時S2 處理下TP 含量高于S0與S1 處理（P＜ 0.05）。另外，S2 處理下暴露14 d 時，蚯蚓體內(nèi)MDA 含量顯著低于7 d 時結(jié)果（P＜ 0.05，圖3b），其在14 與28 d 時則無顯著差異（P＞ 0.05）。各處理下，蚯蚓AChE 活性無顯著變化（P＞ 0.05，圖3c）；S1 處理下暴露至14 d 時AChE 活性低于S0與S2 處理（圖3c），但其在S1 處理下暴露28 d 時顯著高于其他處理（P＜ 0.05，圖3c）。另外，根據(jù)各土壤處理下不同暴露時間結(jié)果顯示，蚯蚓GSH 含量和GPx 活性均無顯著變化（P＞ 0.05，圖3d 和3e）。

圖3 不同重金屬污染土壤處理下天錫杜拉蚓體內(nèi)總蛋白含量、丙二醛含量、乙酰膽堿酯酶活性、還原型谷胱甘肽含量和谷胱甘肽過氧化物酶活性隨暴露時間的變化Fig. 3 Changes of total protein content,malondialdehyde content,acetylcholinesterase activity,glutathione content and glutathione peroxidase activity with the exposure time in Drawida gisti under different levels of metal contaminated soils

2.4 綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)（IBRv2）評價

采用綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)法（IBRv2），綜合評價天錫杜拉蚓體內(nèi)不同生化指標(biāo)對重金屬污染的響應(yīng)情況（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與基線（S0）相比，S1 處理下暴露7 d 時，天錫杜拉蚓體內(nèi)AChE活性和MDA 含量升高，TP 含量、GSH 含量和GPx 活性均被抑制；S2 處理下MDA 含量、TP 含量以及GPx 活性增加，AChE 活性抑制，GSH 降低（圖4a）。暴露14 d 時，S1 處理下TP 含量升高，AChE 及GPx 活性抑制，MDA 降低；同時S2 處理下，MDA 含量降低，GPx 活性抑制（圖4b）。分別在S1 和S2 處理下暴露28 d 時，蚯蚓體內(nèi)GPx 活性、AChE 活性與GSH 含量呈增加趨勢，TP 含量下降；S2 處理下MDA 含量增加（圖4c）。

圖4 不同重金屬污染土壤處理下天錫杜拉蚓暴露至7、14、28 d 時各生物標(biāo)志物響應(yīng)星狀圖Fig. 4 The values of IBRv2 index of the biomarker responses of Drawida gisti after 7,14,and 28 exposure days under different levels of metal contaminated soils,respectively.

各處理下天錫杜拉蚓的綜合生物標(biāo)志物（IBRv2）系數(shù)，如圖5 所示。結(jié)果表明，分別在S1 和S2 處理下分別暴露至第7、14 和28 d 時，蚯蚓IBRv2 指數(shù)呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其中14 d 時S1 與S2 污染土處理下的IBRv2 指數(shù)響應(yīng)最高（分別為6.9 與4.7）。

圖5 S1 和S2 處理下天錫杜拉蚓暴露7、14、28 d 時綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)（IBRv2）Fig. 5 Integrated biomarker response index version 2(IBRv2) of Drawida gisti under treatments of S1 and S2 after 7,14 and 28 exposure days

3 討論

3.1 天錫杜拉蚓生物量變化及其重金屬（Cd、Cu和Pb）富集分析

根據(jù)本研究結(jié)果，S1 與S2 污染土壤下，天錫杜拉蚓生物量隨重金屬污染程度的升高呈顯著降低，表明Cd-Cu 和Cd-Cu-Pb 污染顯著抑制了該蚯蚓的生物量，這與前人研究結(jié)果一致［19］。根據(jù)天錫杜拉蚓對重金屬的富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S1 和S2 處理下暴露14 d 時蚯蚓Cd 含量、28 d 時Cu 含量及S2 處理下28 d 時Pb 含量均有所降低（P＞ 0.05），這與前人研究不同［20］。其主要原因可能是重金屬污染對蚯蚓有較強的生物毒性，抑制了其活性，導(dǎo)致其機體的富集能力下降。其次，Guhra 等［21］發(fā)現(xiàn)，蚯蚓體表所分泌出的粘液含有一定量的營養(yǎng)物質(zhì)及金屬元素。因此，本試驗中Cd 和Cu 離子或?qū)㈦S蚯蚓體腔粘液的分泌而排出。另外，在具有較高有效性重金屬的污染土壤下，蚯蚓表皮與消化系統(tǒng)易受到損傷［22］，腸道吸收重金屬的能力下降，部分金屬離子隨蚓糞排出體外，這或許是天錫杜拉蚓體內(nèi)重金屬含量下降的因素之一，但其機理需進一步探究。

從富集系數(shù)上看，該種蚯蚓對Cd、Cu 和Pb 富集大小規(guī)律為BAFCd＞ BAFPb＞ BAFCu，表明其對Cd 的富集能力最強。在生物地球化學(xué)的遷移轉(zhuǎn)化過程中，土壤中的Cd 具有活性較高、易遷移，易被生物富集且較難排除體外等特點［23］。另外，隨著土壤重金屬含量的增加，蚯蚓對Cd、Cu 和Pb 的富集能力均呈下降趨勢（P＜ 0.05）（表4），這與高濃度的重金屬對蚯蚓毒性作用較大有關(guān)，抑制了蚯蚓的活性及其解毒能力，減少了蚯蚓對金屬的富集。

3.2 天錫杜拉蚓在生化水平上的響應(yīng)

在土壤重金屬污染（Cd-Cu 和Cd-Cu-Pb）下隨著暴露時間的增加，天錫杜拉蚓體內(nèi)MDA 含量呈先升后降趨勢，表明在重金屬污染脅迫下，該蚯蚓體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)在早期響應(yīng)顯著，脅迫環(huán)境使機體無法及時清除ROS 導(dǎo)致細胞脂質(zhì)損傷；暴露時間增加時，其機體為緩解氧化脅迫，調(diào)動GSH 和GPx等參與了調(diào)節(jié)與解毒過程，機體逐漸恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。其中，GSH 主要由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸為前體合成物質(zhì)，富含巰基（-SH），易與重金屬離子結(jié)合，減輕金屬離子毒性，起到解毒作用［7］。本研究中，S1 與S2 土壤下蚯蚓GSH 含量和GPx 活性在28 d時上升（圖4a），表明Cd、Cu 和Pb 污染誘發(fā)了蚯蚓機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，即污染脅迫激活了抗氧化系統(tǒng)，協(xié)同消除ROS，減緩蚯蚓脂質(zhì)損傷［24］。另外，蚯蚓體內(nèi)總蛋白（TP）含量變化指示著其體內(nèi)調(diào)節(jié)與響應(yīng)情況［25］。S2 處理下蚯蚓TP 含量呈先升后降趨勢，這與竇晶晶［26］的研究一致，但S1 處理下的結(jié)果與其相反，這可能由于S1 污染較S2 輕，蚯蚓在重金屬脅迫下并未生成急性時相蛋白和一些病理性蛋白，而是將蛋白質(zhì)分解提供能量來維持生存［27］。另外，AChE 作為生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶，能保證神經(jīng)信號在生物體內(nèi)的正常傳遞。本研究中，在S1 與S2 污染土下的蚯蚓AChE 活性抑制，暴露后期略有升高，表明暴露初期，脅迫刺激神經(jīng)沖動傳導(dǎo)過度，神經(jīng)纖維處于興奮狀態(tài)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，隨暴露時間延長，其體內(nèi)AChE 受抑制效果減弱，機體逐漸達到正常生理平衡狀態(tài)［28］。

根據(jù)IBRv2 綜合指數(shù)來看，天錫杜拉蚓在兩種污染土下的IBRv2 值均呈先升后降趨勢。暴露至14與28 d 時，S1 污染土下的IBRv2 指數(shù)均高于S2 處理，表明該蚯蚓對Cd-Cu 污染（S1 處理）的響應(yīng)隨暴露時間的增加呈顯著應(yīng)激反應(yīng)，這或許與S1 與S2 土壤重金屬污染對蚯蚓的強烈生物毒性有關(guān)。綜合來看，隨著暴露時間的增加，Cd-Cu 復(fù)合污染土壤下天錫杜拉蚓在生化水平上的毒性效應(yīng)表現(xiàn)更強。

4 結(jié)論

隨暴露時間的增加，原位重金屬（Cd-Cu 與Cd-Cu-Pb）復(fù)合污染土壤抑制了天錫杜拉蚓生物量（P＜ 0.05）。該蚯蚓體內(nèi)重金屬（Cd、Cu 和Pb）含量隨暴露時間及重金屬污染程度的增加呈上升趨勢；各處理下該蚯蚓對Cd、Cu 和Pb 的富集能力表現(xiàn)為Cd ＞ Pb ＞ Cu，且S1 處理下Cd、Cu 和Pb 的有效性影響了其對重金屬的富集。在生化水平上，S1 與S2 處理下，早期暴露（7 d）時蚯蚓體內(nèi)MDA、GPx、GSH 與AChE 各項指標(biāo)均響應(yīng)顯著；隨著暴露時間的增加（14 和28 d 時），蚯蚓體內(nèi)TP、GPx、GSH 與AChE 較為敏感。IBRv2 指數(shù)顯示，暴露14 d 時，天錫杜拉蚓在生化水平上呈顯著應(yīng)激狀態(tài)，Cd-Cu 復(fù)合污染對天錫杜拉蚓的毒性效應(yīng)表現(xiàn)更強。