劉 鼎,梁高星,房凱敏,任 尊,牛雨薇,吳敏楠,宋軍科

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院,陜西楊凌 712100)

犢牛腹瀉是犢牛生長過程中的一種常見疾病,嚴重威脅牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,其病因錯綜復雜,包括環(huán)境、營養(yǎng)等非感染性因素,以及細菌、病毒和寄生蟲等病原感染因素[1]。由寄生性腸道原蟲病所致的犢牛腹瀉,常被誤診為其他疾病,使病畜得不到合理的救治,給飼養(yǎng)場造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。藍氏賈第蟲(Giardialamblia)和隱孢子蟲(Cryptosporidiumsp.)為2種常見的人獸共患腸道原蟲,不僅可以引起犢牛腹瀉,甚至嚴重威脅著人類健康,因此探明這些腸道原蟲在腹瀉犢牛中的感染情況十分必要[3]。

隱孢子蟲和藍氏賈第蟲的基因型和種類的分子特征對于病原的準確鑒定和評估人畜共患傳播至關(guān)重要[4]。報道顯示,可感染牛的隱孢子蟲共有十幾種,其中常見的有微小隱孢子蟲(C.parvum)、安氏隱孢子蟲(C.andersoni)、芮氏隱孢子蟲(C.ryanae)以及牛隱孢子蟲(C.bovis),其他隱孢子蟲蟲種在牛體內(nèi)也零星地被發(fā)現(xiàn)[5]。目前研究已證明藍氏賈第蟲存在8個集聚體(A～H),其中可感染包括人在內(nèi)的多種哺乳動物的集聚體A和B被認為是人獸共患基因型;而集聚體E則常見于偶蹄類動物,但是在埃及也曾發(fā)現(xiàn)人類感染藍氏賈第蟲集聚體E[6]。

本研究利用分子生物學技術(shù)分別對隱孢子蟲和藍氏賈第蟲的SSUrRNA和BG基因位點進行PCR擴增、序列對比和遺傳進化分析,明確隱孢子蟲和藍氏賈第蟲在犢牛腹瀉中的作用,本研究結(jié)果可為該地區(qū)犢牛腹瀉的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 18份(樣品編號:NMX1～NMX18)腹瀉犢牛(2～3月齡)的新鮮糞便,均采自于內(nèi)蒙古某奶牛場,采集時間為2021年12月份,采集后的糞便樣品在冰盒中運回實驗室,置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 糞便基因組DNA試劑盒E.Z.N.A.?Stool DNA Kit,美國Omega公司產(chǎn)品;瓊脂糖,擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;6×Loading buffer、DNA標準DL 2 000,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;2×RapidTaqMaster Mix,南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 電子天平,日本Shimadzu公司產(chǎn)品;顯微鏡,日本Nikon公司產(chǎn)品;超純水制造儀,四川優(yōu)普超純科技有限公司產(chǎn)品;網(wǎng)篩(60目),宇晨化玻站產(chǎn)品;單道移液器(100～1 000 μL),大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 顯微鏡檢查 取新鮮糞樣5 g,加10倍蒸餾水,攪勻用網(wǎng)篩過濾糞樣至燒杯中,分裝糞便至50 mL離心管中,以3 500 r/min離心10 min,倒掉部分上清液,剩余上清液與沉淀體積相當,將剩余上清液及沉淀用玻璃棒攪勻,加等體積乙醚,搖勻后3 500 r/min離心10 min,倒掉脂肪層,留沉淀物加水至5 mL,加飽和蔗糖溶液至35 mL,搖勻后3 500 r/min離心7 min。用鐵絲環(huán)釣取表層液膜制片,置400倍顯微鏡下檢測。

1.2.2 糞便DNA的提取 根據(jù)E.Z.N.A.?Stool DNA Kit糞便基因組提取試劑盒說明書,從糞便樣品中分別提取基因組DNA,并將提取到的DNA分裝,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增 基于隱孢子蟲小亞基核糖體RNA(SSUrRNA)基因,參照文獻[7]設(shè)計的2對引物,通過套式PCR擴增830 bp左右片段的基因序列篩選隱孢子蟲陽性樣品;基于藍氏賈第蟲BG基因序列,參照文獻[8]設(shè)計的2對引物,通過套式PCR擴增511 bp左右片段的基因序列篩選藍氏賈第蟲陽性樣品。PCR反應(yīng)體系總體系為25 μL,包括12.5 μL 2×RapidTaqMaster Mix、8.5 μL雙蒸水、上、下游引物(25 pmol/μL)各1 μL、2 μL模板DNA。PCR擴增程序:95 ℃預變性3 min;95 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s,共30個循環(huán);72 ℃ 5 min,降至16 ℃結(jié)束。引物序列及退火溫度見表1,所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,攝像記錄結(jié)果后,將電泳檢測陽性的第2輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

表1 引物序列

1.2.4 序列分析 將測得的基因序列使用Clustal X 1.83軟件進行比對,并參考圖譜校準,將校準后的序列上傳至NCBI使用Blast進行比對,下載匹配度較高的蟲種序列作為參考序列,最后采用MEGA6.06中的Neighbor-Joining(N-J)法評估序列之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。采用Kimura 2-parameter參數(shù)模型,引導分析使用1 000個重復/樹進行。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡檢測結(jié)果

通過顯微鏡觀察經(jīng)飽和蔗糖漂浮法處理后的糞便樣品,觀察到隱孢子蟲卵囊和賈第蟲包囊,隱孢子蟲卵囊呈卵圓形,大小約為4.9 μm×4.6 μm,在卵囊內(nèi)卵囊殘體明顯,隱約可見4個子孢子;賈第蟲包囊呈橢圓形,大小約為12 μm×8 μm,盧戈氏碘液染色后呈棕綠色,貫穿蟲體長軸的軸柱和細胞核清晰可見(圖1)。

A.隱孢子蟲;B.藍氏賈第蟲(盧戈氏碘液染色)

2.2 PCR擴增結(jié)果

以18份糞便樣品的DNA為模板分別進行Cryptosporidiumsp.的SSUrRNA基因位點和Giardialamblia的BG基因位點PCR擴增,1份樣品擴增出Cryptosporidiumsp.的SSUrRNA基因位點的目的片段,長度約為830 bp左右,陽性率為5.56%(1/18),13份樣品擴增出Giardialamblia的BG基因位點的目的片段,長度約為511 bp左右,陽性率為72.22%(13/18),陰性對照無條帶(圖2和圖3)。

M.DNA標準DL 2 000;1～18.樣品NMX1 NMX18;19.陰性對照

M.DNA標準DL 2 000;1～18.樣品NMX1 NMX18;19.陰性對照

2.3 序列比對及分析

本研究對采集的18份犢牛腹瀉糞便樣品,基于SSUrRNA基因位點進行PCR擴增共得到的1份Cryptosporidiumsp.陽性樣本NMX3,去除兩端模糊序列后序列長度為728 bp,使用Blast工具進行比對分析發(fā)現(xiàn)檢測得到的陽性樣品為牛隱孢子蟲(C.bovis),與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列號MK982466(孟加拉國分離株)、MG972763(馬來西亞分離株)、MW788435(泰國分離株)和MF074597(中國分離株)均具有100%的序列同源性。

基于BG基因位點進行PCR擴增共得到13份Giardialamblia陽性樣本,去除兩端模糊序列后序列長度為448 bp,將所有序列通過NCBI使用Blast工具進行比對分析,檢測得到的13份藍氏賈第蟲陽性樣品均被鑒定為集聚體E型,其中NMX3、NMX5和NMX11與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列號MK610389有99.78%～100%的序列同源性,NMX8、NMX9和NMX16與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列號AY655703有99.78%～100%的序列同源性,NMX6、NMX12、NMX13和NMX14與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列號KY633469有99.78%～100%的序列同源性,NMX1和NMX18與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列號JX978261有100%的序列同源性,NMX7與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列號MH158457有100%的序列同源性。

2.4 種群遺傳進化分析

牛隱孢子蟲分離株SSUrRNA基因位點構(gòu)建的系統(tǒng)進化發(fā)育樹表明,本研究獲得的C.bovis分離株與牛隱孢子蟲(C.bovis,GenBank登錄號:MK982466、MG972763、MW788435和MF074597)位于同一分支(圖4)。藍氏賈第蟲分離株BG基因位點構(gòu)建的系統(tǒng)進化發(fā)育樹表明,本研究獲得的13株Giardialamblia分離株與集聚體E(GenBank登錄號MK610389、AY655703、KY633469、JX978261和MH158457)位于同一分支(圖5)。

圖4 牛隱孢子蟲分離株SSU rRNA基因位點遺傳進化樹(Neighbor-Joining法)

圖5 藍氏賈第蟲分離株BG基因位點遺傳進化樹(Neighbor-Joining法)

3 討論

寄生性腸道原蟲引起的犢牛腹瀉與細菌或者病毒感染引起的犢牛腹瀉臨床癥狀相似,因此常被誤診,使病畜得不到有效的治療,錯過最佳治療期并造成抗菌藥物殘留等問題[1]。其中,隱孢子蟲和藍氏賈第蟲均為人獸共患原蟲,在世界范圍內(nèi)廣泛流行,宿主感染后排出的包囊和卵囊會污染周圍環(huán)境,對動物和人類的健康生活均造成嚴重危害。

本研究中藍氏賈第蟲在犢牛腹瀉糞便樣品具有較高的檢出率,陽性率為72.22%(13/18),低于廣東斷奶前小牛中藍氏賈第蟲74.2%(288/388)的感染率[9],普遍高于國內(nèi)大多數(shù)研究者報道的數(shù)據(jù)[10-11]。感染情況的差異可能與采樣動物年齡、健康狀況及檢測方法、標本采集時間、地理生態(tài)條件等多種因素有關(guān)[12]。此外,藍氏賈第蟲感染性和致病性與集聚體分類有密切聯(lián)系,不同集聚體之間的生物學特性具有差異,本研究得到的13份藍氏賈第蟲陽性樣品均被鑒定為集聚體E,該型常見于偶蹄類動物,但存在人類感染的報道,這說明藍氏賈第蟲不僅具有動物間互相傳播的風險,而且極有可能危害人類的身體健康[5]。本研究中隱孢子蟲在犢牛腹瀉糞便樣品中僅發(fā)現(xiàn)1例,陽性率為5.56%(1/18),且與藍氏賈第蟲為混合感染,檢測得到的陽性樣品被鑒定為牛隱孢子蟲(C.bovis)。牛為哺乳動物中常見感染隱孢子蟲的種類,在斷奶之前的犢牛尤為易感,成為隱孢子蟲病最重要的直接宿主之一[13]。犢牛隱孢子蟲病呈世界性分布,且各地感染率之間具有很大差別,目前國內(nèi)有多個省市已從牛糞便樣品中鑒定出了隱孢子蟲,感染率為1.0%～48.5%,其在國內(nèi)的分布跨度較大,給養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)帶來了很大威脅,嚴重制約養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[14]。

本研究結(jié)果表明,藍氏賈第蟲和隱孢子蟲是影響犢牛腹瀉的重要因素,提示在犢牛腹瀉時應(yīng)綜合考慮各種致病因素,采取綜合性防控措施,加強防范意識,總結(jié)科學的防控措施,以降低犢牛感染該病的風險。