沈國(guó)平,張 鑫,王智博,舒志萬(wàn),崔金子,衡 珊,汪明香,朱德銳,王 嶸

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心,西寧 810016)

四氫嘧啶(Ectoine)作為嗜鹽微生物胞內(nèi)重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物,已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和生物制劑等領(lǐng)域。如何改善和提高細(xì)菌的Ectoine生產(chǎn)能力是目前需要著重解決的問題[1]。目前,國(guó)內(nèi)外實(shí)現(xiàn)Ectoine過量化生產(chǎn)的主要策略集中于:(1)篩選易于培養(yǎng)、能耐受高鹽且生長(zhǎng)鹽度范圍寬泛、胞內(nèi)Ectoine合成量大的菌株;(2)深入研究酸堿度、鹽度、溫度和碳氮源、合成前體物質(zhì)等因素對(duì)Ectoine發(fā)酵產(chǎn)量的影響,并優(yōu)化發(fā)酵工藝以提高產(chǎn)率;(3)基于Ectoine合成代謝通路和系統(tǒng)代謝工程原理,借助基因重組或基因敲除技術(shù),構(gòu)建高效工程菌株[2-4]。本研究通過構(gòu)建小柴旦鹽湖野生菌株XH26的系統(tǒng)發(fā)育樹,明確進(jìn)化分類地位并進(jìn)行基因組測(cè)序。同時(shí),探索合成前體底物(L-谷氨酸鈉)對(duì)菌株XH26胞內(nèi)Ectoine的合成影響,利用基因組測(cè)序法分析L-谷氨酸鈉代謝途徑與Ectoine生物合成通路的關(guān)聯(lián)性,明確相關(guān)代謝基因的參與情況,為后續(xù)Ectoine的高效生產(chǎn)和系統(tǒng)代謝工程菌株改造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與培養(yǎng)條件

從小柴旦鹽湖分離出的野生鹽單胞菌株H.campaniensisstrain XH26(CCTCC2019776 M)可高效合成Ectoine。菌株XH26的最佳培養(yǎng)基條件[5]:L-谷氨酸鈉35 mM、酶水解酪素100 mM、NaCl 1.0 M、MgSO4·7H2O 0.1 M和KCl 0.75 M,接種量為1%,培養(yǎng)時(shí)間為36 h,酸堿度為8,溫度為35℃。

1.2 主要試劑與設(shè)備

L-谷氨酸鈉和酶水解酪素(分析純,天津永大公司),乙腈(HPLC級(jí),美國(guó)賽默飛公司),Invitrogen Trizol試劑(美國(guó)賽默飛公司),Ectoine標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(HPLC級(jí)>95%,德國(guó)Fluka分析公司) ,微孔過濾器(0.22 μm水系膜,天津亳津公司),色譜分析柱(德國(guó)Merck公司);細(xì)菌Ribo-Zeror RNA去除試劑盒(美國(guó)Illumina公司),細(xì)菌基因組DNA試劑盒(QI Aamp Fast DNA Stool Mini Kit,德國(guó)Qiagen公司),qPCR試劑盒(TB Green?Premix Ex TaqTMII,日本Takara公司);高效液相色譜儀(HPLC-2100型,美國(guó)Agilent公司),NanoDrop 2000微量檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司),PacBio Sequel測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)PacBio公司),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche Light Cycler?96,瑞士Roche公司)。

1.3 16S rRNA基因測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析法

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行基因組DNA提取。用PCR法擴(kuò)增16S rRNA基因時(shí)采用通用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT)[6]。PCR反應(yīng)體系(25 μL):10×Buffer 2.5 μL,2.5 mM dNTPs 1 μL,正/反向引物(10 μM)各0.5 μL,DNA聚合酶0.2 μL,DNA模板(20～50 ng/μL)0.5 μL,最后用ddH2O補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃(240 s),94℃(45 s),55℃(45 s),72℃(60 s),25個(gè)循環(huán),最后于72℃延伸10 min后純化回收目的條帶測(cè)序。通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與菌株相似性較高的近緣物種基因序列,利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行相似性比對(duì),采用鄰接法(Neighbor joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(Bootstrap 1000),分析菌株XH26的系統(tǒng)發(fā)育地位[7]。

1.4 細(xì)菌全基因組測(cè)序法

細(xì)菌基因組DNA采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法分析完整性。采用微量檢測(cè)儀檢測(cè)DNA質(zhì)量純度。細(xì)菌全基因組由武漢菲沙公司利用PacBio Sequel平臺(tái)完成測(cè)序。使用HGAP4、Canu(v.1.6)軟件對(duì)純?nèi)鷶?shù)據(jù)進(jìn)行組裝,并對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)洞、優(yōu)化和評(píng)價(jià)[8]。使用Pbalign(v.0.3.1,默認(rèn)Blasr算法)軟件將三代Subreads比對(duì)組裝到基因組上,用K-mer統(tǒng)計(jì)法評(píng)估基因組大小以及Scaffolds、Orphan contigs數(shù)目[9]。通過統(tǒng)計(jì)組裝序列的GC含量、重復(fù)序列度和覆蓋深度,分析Reads的測(cè)序深度。采用Genemark S軟件預(yù)測(cè)編碼基因,利用GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)判斷直系同源基因,并進(jìn)行功能基因注釋[10-11]。

1.5 Ectoine定量檢測(cè)法

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法定量檢測(cè)Ectoine[5]。

1.6 熒光qRT-PCR法驗(yàn)證L-谷氨酸鈉相關(guān)代謝基因

L-谷氨酸鈉濃度梯度設(shè)置為15、30、45 mM,同步培養(yǎng)XH26菌株36 h后,離心收集菌泥。采用Invitrogen Trizol試劑盒提取菌株XH26的總RNA,總RNA符合樣品要求(OD260/OD280=1.8～2.2;濃度>4 nM)。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行qRT-PCR(2 μg RNA)實(shí)驗(yàn),將實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物cDNA 稀釋20倍作為qRT-PCR模板。用qPCR試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè),將樣品混合均勻于96孔板,上機(jī)運(yùn)行,反應(yīng)體系(20 μL):cDNA 6 μL,TB溶液10 μL,正/反向引物各0.5 μL,無菌水3 μL。qRT-PCR運(yùn)行條件:95℃(180 s),95℃(10 s),65℃(20 s),72℃(30 s),40個(gè)循環(huán),在延伸階段采集每個(gè)循環(huán)的數(shù)據(jù)。內(nèi)參基因?yàn)榱姿彳沼退崦摎涿?GADPH)基因,采用2-ΔΔCT法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平(n=3)[12]。PCR引物由南京金斯瑞公司合成(表1)。

表1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)涉及L-谷氨酸鈉和Ectoine相關(guān)代謝的基因引物

2 結(jié)果

2.1 菌株XH26形態(tài)特征與系統(tǒng)發(fā)育

野生菌株XH26的菌落適應(yīng)高鹽生長(zhǎng)(0～3.0 M NaCl),最適生長(zhǎng)鹽度為(NaCl)1.5 M。將16S rRNA基因測(cè)序(1438 bp)結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果比對(duì),其結(jié)果顯示:菌株XH26與H.campaniensisLS21(No.CP007757.1)的序列相似性為99.86%(進(jìn)化同源)。同時(shí),系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)顯示:菌株XH26與鹽單胞菌屬類聚,隸屬于γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)海洋螺菌目(Oceanospirillales)鹽單胞菌科(Halomonadaceae)鹽單胞菌屬(Halomonas)的坎帕尼亞鹽單胞菌(H.campaniensis)。

紅色圓點(diǎn)代表本研究中應(yīng)用的模式菌株及其NCBI登錄號(hào)

2.2 L-谷氨酸鈉對(duì)菌株XH26胞內(nèi)Ectoine的合成影響

前期研究顯示,將L-谷氨酸鈉作為碳源時(shí),Ectoine的合成量最大。分析不同濃度的L-谷氨酸鈉對(duì)菌株XH26胞內(nèi)Ectoine合成量的影響(圖2)表明:隨著L-谷氨酸鈉濃度的增加,Ectoine的合成量隨之升高,當(dāng)L-谷氨酸鈉濃度為30 mM時(shí),Ectoine的合成量達(dá)到最大值(321.83 mg/L);此后,隨著L-谷氨酸鈉濃度的增加,Ectoine的合成量逐漸呈下降趨勢(shì)。由此表明XH26菌株合成Ectoine的最適L-谷氨酸鈉濃度為30 mM。

圖2 不同濃度的L-谷氨酸鈉影響菌株XH26的Ectoine合成量

2.3 菌株XH26全基因組特征分析

利用高通量測(cè)序法進(jìn)行坎帕尼亞鹽單胞XH26基因組組裝(圖3)。結(jié)果顯示:模式菌株XH26的基因組大小為4 112 053 bp、預(yù)測(cè)編碼基因3 927個(gè)、編碼基因總長(zhǎng)度為3 687 732 bp、編碼基因GC含量為53.28%、編碼基因總長(zhǎng)/基因組大小為89.68%;tRNA為63個(gè),5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA均為6個(gè)。基于NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋出的基因數(shù)目為3 669個(gè)(比例為93.43%)、SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)注釋出的基因數(shù)目為2 812個(gè)(71.61%)、COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋出的基因數(shù)目為3 252個(gè)(82.81%)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋出的基因數(shù)目為2 305個(gè)(58.70%)、GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋出的基因數(shù)目為2 618個(gè)(66.67%)。注釋基因數(shù)目共計(jì)3 669個(gè)(93.43%)?；贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,代謝富集基因主要涉及氨基酸代謝(amino acid metabolism)的相關(guān)基因277個(gè)、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)的相關(guān)基因221個(gè)、輔助因子和維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins)的相關(guān)基因182個(gè)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membrane transport)的相關(guān)基因178個(gè)、能量代謝(energy metabolism)的相關(guān)基因140個(gè)以及參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)的相關(guān)基因115個(gè)。

圖3 坎帕尼亞鹽單胞菌株XH26的基因組組裝圖

2.4 L-谷氨酸鈉與Ectoine代謝通路的關(guān)聯(lián)分析

基于菌株XH26基因組進(jìn)行KEGG氨基酸代謝通路和Ectoine合成途徑分析(圖4),結(jié)果顯示:Ectoine的生物合成采用保守的連鎖基因簇ectABC操縱子實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控,合成前體底物是天冬氨酸半醛(L-aspartate-β-semialdehyde),由天冬氨酸(L-aspartate)經(jīng)天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脫氫酶催化而來,分別由lysC、asd編碼;而天冬氨酸的代謝與三羧酸循環(huán)的代謝中間物(如草酰乙酸、蘋果酸、延胡索酸和琥珀酸)、琥珀酸半縮醛以及上游的谷氨酸(或谷氨酰胺)的分解代謝直接關(guān)聯(lián)。至此,在優(yōu)化培養(yǎng)基中添加L-谷氨酸鈉(30 mM),能有效提高胞內(nèi)Ectoine的合成量。通過增加L-谷氨酸鈉的碳/氮代謝流量(C/N metabolic flux)提高下游產(chǎn)物天冬氨酸或天冬氨酸半醛的濃度,最終導(dǎo)致胞內(nèi)Ectoine合成量增加。該過程中可能涉及相關(guān)基因參與其中,如gltB、gltD、davT、gdhA、lysC與asd。

圖中紅色標(biāo)記為物質(zhì)變化過程中的主要官能基團(tuán)

2.5 L-谷氨酸鈉代謝的參與基因驗(yàn)證

設(shè)置L-谷氨酸鈉濃度梯度組(15、30、45 mM),培養(yǎng)菌株XH26并提取總RNA,并利用qRT-PCR分析Ectoine合成通路基因的相對(duì)表達(dá)量(圖5)。分析表明:隨著L-谷氨酸鈉濃度升高,基因gltB、gdhA、lysC的相對(duì)表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)且有顯著差異(P<0.05),ectB、ectA和ectC的相對(duì)表達(dá)量亦呈遞增趨勢(shì)但無顯著差異;當(dāng)L-谷氨酸鈉濃度較低時(shí)(15 mM),gltD、asd的相對(duì)表達(dá)量無顯著差異,當(dāng)L-谷氨酸鈉濃度較高時(shí)(45 mM),gltD、asd的相對(duì)表達(dá)量較高(P<0.05)。此外,當(dāng)L-谷氨酸鈉濃度為30 mM時(shí),davT的相對(duì)表達(dá)量較高,而L-谷氨酸鈉為低濃度(15 mM)或高濃度(45 mM)時(shí),相對(duì)表達(dá)量較低。

*:組間比較,P<0.05

3 討論

目前,規(guī)?；a(chǎn)Ectoine選用的模式菌株主要集中在γ-變形菌綱海洋螺菌目鹽單胞菌科(Halomonadaceae),以鹽單胞菌屬(Halomonas)和色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)應(yīng)用最為廣泛[3]。截至2023年3月,LPSN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.bacterio.net/halomonas.html)收錄鹽單胞菌屬167個(gè),成為種數(shù)最多的嗜鹽菌屬群,其典型代表有延長(zhǎng)鹽單胞菌(H.elongate)、鹽水鹽單胞菌(H.salina)、南極堿鹽單胞菌(H.alkaliantarctica)、樊氏鹽單胞菌(H.ventosae)以及玻利維亞鹽單胞菌(H.boliviensis)等[16]。Romano等[13]從意大利坎帕尼亞Malvizza礦池中首次分離并命名為H.campaniensisstrain 5AG。該菌能在10.0℃～43.0℃范圍內(nèi)生長(zhǎng),最適溫度為37.0℃;同時(shí),該菌(在10% NaCl下生長(zhǎng)最佳,生長(zhǎng)pH范圍為7.0～10.0,最適pH值為9.0)大量合成細(xì)胞滲透壓保護(hù)劑Ectoine和谷氨酸。本研究選用的菌株XH26的生長(zhǎng)鹽度范圍寬泛(0～3.0 M NaCl),最適生長(zhǎng)鹽度(NaCl)為1.5 M;系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明:該菌與H.campaniensis進(jìn)化同源,具備高效的Ectoine合成能力。

L-谷氨酸鈉作為培養(yǎng)基碳源或氮源,可有效提高菌株胞內(nèi)Ectoine的合成量[14]。姜蔚宇等的研究結(jié)果[15]顯示:當(dāng)酵母提取物為4.0 g/L時(shí),Ectoine的產(chǎn)量為123.84 mg/L;當(dāng)L-谷氨酸鈉為0.355 M時(shí),Ectoine的產(chǎn)量為134.37 mg/L;氮源酶水解酪素為12.5 g/L時(shí),Ectoine的合成量為467.94 mg/L。Lang[14]和Chen[16]等在不同濃度的L-谷氨酸鈉(0.237、0.355、0.473、0.592 M)中培養(yǎng)鹽水鹽單胞菌H.salinaDSM 5928T,研究批式發(fā)酵過程中Ectoine的產(chǎn)量變化。當(dāng)L-谷氨酸鈉濃度為0.473 M、NaCl濃度為0.5 M及pH為7.0時(shí),Ectoine產(chǎn)量為8.21 g/L。本研究采用單批次方式搖瓶培養(yǎng)XH26菌株,當(dāng)L-谷氨酸鈉濃度為0.03 M時(shí),Ectoine的合成量最大值為321.83 mg/L。對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),以L-谷氨酸鈉作為碳/氮源,菌株XH26的Ectoine合成量較高。

本研究中,菌株H.campaniensisstrain XH26的基因組大小為4.11 Mb,預(yù)測(cè)編碼基因?yàn)? 927個(gè),代謝通路富集基因主要涉及氨基酸代謝基因(277個(gè)基因)和碳水化合物代謝基因(221個(gè)基因)等。谷氨酸或谷氨酰胺的分解代謝通路,依次生成琥珀酸半縮醛→琥珀酸→延胡索酸→蘋果酸→草酰乙酸→天冬氨酸→天冬氨酸半縮醛等中間產(chǎn)物,最終合成Ectoine[12]。熒光qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí):當(dāng)L-谷氨酸鈉濃度從15 mM升至30 mM時(shí),L-谷氨酸鈉的代謝流量增加了Ectoine的合成量。在該代謝過程中,主要參與基因的相對(duì)表達(dá)量呈明顯的上調(diào)趨勢(shì),如基因davT(1 275 bp)、gdhA(2 427 bp)和lysC(1 398 bp)?；騞avT、gdhA和lysC分別編碼4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(424 aa)、谷氨酸脫氫酶(808 aa)和天冬氨酸激酶(465 aa)。谷氨酸脫氫酶和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶共同參與L-谷氨酸α-碳原子位點(diǎn)的脫羧基和脫氨基作用,生成琥珀酸半縮醛;天冬氨酸激酶參與L-天冬氨酰磷酸水解和脫氫反應(yīng),生成天冬氨酸半醛[3,17]。天冬氨酸激酶(EC2.7.2.4)是合成L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸和L-異亮氨酸等氨基酸的關(guān)鍵酶,亦是合成天冬氨酸族氨基酸的限速酶[18]。同時(shí),隨著L-谷氨酸鈉濃度從15 mM升至45 mM,Ectoine合成核心基因簇ectABC的相對(duì)表達(dá)量均輕度上調(diào),可促進(jìn)Ectoine的合成效率。此外,當(dāng)L-谷氨酸鈉濃度為45 mM時(shí),基因gltD、lysC、asd的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào),此時(shí)Ectoine的合成量并未顯著增加;與合成量最大值(L-谷氨酸鈉濃度為30 mM時(shí))相比,反而有所下降,可能與前體物質(zhì)(天冬氨酸半醛)的代謝流量分配有關(guān),具體的調(diào)控機(jī)理有待深入研究。