丁軒 楊立軍 徐源 劉敏杰 葉潤(rùn) 耿曉桐 李蕊 喬新榮

摘要 ［目的］優(yōu)化貓爪草多糖熱浸提法提取工藝。［方法］以貓爪草塊根為原料，采用熱水浸提法提取貓爪草多糖，選取提取時(shí)間、提取溫度、液料比進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以貓爪草的多糖得率作為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)貓爪草多糖熱浸提法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。［結(jié)果］熱浸提法提取貓爪草多糖最佳提取工藝是提取時(shí)間2.16 h、提取溫度82 ℃、液料比38∶1（mL∶g），在此條件下，貓爪草多糖得率最高，為3.160%。［結(jié)論］該研究為貓爪草多糖的藥理作用研究和進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 貓爪草；多糖得率；熱浸提法；響應(yīng)面法；提取工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào) R 284.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）23-0142-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.23.034

Response Surface Methodology to Optimize the Extraction Process of Ranunculi ternati Radix Polysaccharides by Hot Extraction Method

HE Ding-xuan， YANG Li-jun， XU Yuan et al

（School of Pharmaceutical Engineering， Xinyang Agriculture and Forestry University， Xinyang， Henan 464000）

Abstract ［Objective］ To optimize the extraction process of polysaccharides from Ranunculi ternati Radix by hot extraction method.［Method］Using the root tubers of Ranunculi ternati Radix as raw materials， the hot water extraction method was used to extract polysaccharides from Ranunculi ternati Radix. Single factor experiments were conducted by selecting extraction time， extraction temperature and liquid-solid ratio. Based on the single factor experiment， the polysaccharide yield of Ranunculi ternati Radix was used as the response value， and the response surface methodology was used to optimize the extraction process of Ranunculi ternati Radix polysaccharides using the hot water extraction method.［Result］ The optimal extraction process for extracting polysaccharides from Ranunculi ternati Radix using hot extraction method was extraction time of 2.16 hours， extraction temperature of 82 ℃， and liquid-solid ratio of 38∶1 （mL∶g）. Under these conditions， the highest yield of Ranunculi ternati Radix polysaccharides was 3.160%.［Conclusion］ This study provides a theoretical basis for the pharmacological study and further development and application of polysaccharides from Ranunculi ternati Radix.

Key words Ranunculi ternati Radix;Polysaccharide yield;Hot extraction method;Response surface methodology;Optimization of extraction process

基金項(xiàng)目 河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（222102310440，222102110247）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（20A180028）；信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院青年基金項(xiàng)目（QN2021061）；信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院科研促進(jìn)教學(xué)專項(xiàng)（kj-2021013）；信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（XNKJTD-009）。

作者簡(jiǎn)介 赫丁軒（1992—），女，河南信陽(yáng)人，講師，博士，從事天然產(chǎn)物的提取與開發(fā)研究。*通信作者，副教授，博士，從事藥學(xué)生物技術(shù)研究。

收稿日期 2023-01-12

貓爪草（Ranunculi ternati Radix）為毛茛科植物小毛茛（Ranunculus ternatus Thunb.）的干燥塊根，因?yàn)槠涓筛庑嗡埔恢回堊η夷軌蛴行е委熑祟愂蟑彾虼说妹?］。關(guān)于貓爪草的最早書面使用記錄是在《中藥材手冊(cè)》中，1955年《中國(guó)藥典》將其重新收載。貓爪草主要在信陽(yáng)地區(qū)上游生長(zhǎng)，在長(zhǎng)江下游及其他上游地區(qū)也有其廣泛分布，若以貓爪草的主要有效成分貓爪草多糖糖苷為指標(biāo)，則其原產(chǎn)地以河南信陽(yáng)、駐馬店地區(qū)為優(yōu)［2］。貓爪草性味甘、性溫、歸經(jīng)入肝、肺經(jīng)，具有化痰止咳散結(jié)、解毒清熱消腫的重要作用，可以廣泛用于治療疔瘡病的腫痛，蛇毒絳蟲咬傷、結(jié)核等［3］。貓爪草多糖為貓爪草活性成分之一，具有顯著的藥理作用，在很多臨床研究中，貓爪草抗肝多糖藥物具有強(qiáng)效抗惡性腫瘤、抗結(jié)核、抗慢性肝損傷、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等生物活性，它對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用，阻止其增殖分裂，對(duì)正常的細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，可以明顯改善肝細(xì)胞損傷，具有保肝作用［4］。因此對(duì)貓爪草多糖提取條件的優(yōu)化具有重要意義。

目前，貓爪草的生物提取方法主要有熱水浸提法、回流浸提法、酶分解法、超聲波提取等，其中熱水浸提法是最傳統(tǒng)的提取法，該法操作簡(jiǎn)單、提取多糖效率較高，并且對(duì)多糖成分的活性和其他成分的破壞影響較?。?］。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）指通過(guò)綜合采用多元二次回歸方程進(jìn)行模擬化綜合確定多個(gè)因素和多個(gè)響應(yīng)值之間的一種函數(shù)響應(yīng)關(guān)系，再對(duì)回歸方程結(jié)果進(jìn)行綜合分析找出響應(yīng)預(yù)測(cè)值和響應(yīng)最優(yōu)化值以及給出相應(yīng)的最優(yōu)試驗(yàn)條件，是以最少的試驗(yàn)人力資源消耗，在最短的試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)可得到發(fā)展更多、更好的生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)成果最有效的技術(shù)研究方法，被廣泛應(yīng)用于優(yōu)化提取工藝變量［6］。

該試驗(yàn)在對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、液料比進(jìn)行單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以貓爪草多糖得率作為考察指標(biāo)，采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化貓爪草多糖熱浸提法提取工藝，得到最佳且穩(wěn)定的提取工藝參數(shù)，為貓爪草多糖相關(guān)制劑的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材

所用貓爪草塊根購(gòu)自河南省信陽(yáng)市中成藥采購(gòu)供應(yīng)站。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（≥98％，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚（分析純，云南新藍(lán)景化學(xué)工業(yè)有限公司）。

1.2 儀器

高速粉碎機(jī)（欣鎮(zhèn)企業(yè)有限公司，型號(hào)6202）；電子天平（上海越平儀器有限公司，型號(hào)FA2004）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（長(zhǎng)葛市唯恒機(jī)械設(shè)備有限公司，型號(hào)101-0013）；恒溫電熱水浴鍋（金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠，型號(hào)HH B11 50）；高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)HC-2062）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅容生化儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)RE-3000）；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，型號(hào)TU-1901）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.020 g，用純化水溶解，定容至100 mL，配制成0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)備7支干凈的試管，按梯度吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL放入6支試管中，向6支試管中分別加入純化水使每支試管中均有2.0 mL的溶劑，另取一試管加入2.0 mL純化水做空白對(duì)照。加入1.0 mL 5％苯酚、5 mL濃硫酸，振蕩搖勻后加塞沸水中放置20 min，取出后涼水冷卻10 min［7］。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［8］，得到回歸方程為A=0.055 9C-0.128 2（R2=0.985 1）。

1.3.2 貓爪草多糖得率的測(cè)定。

將貓爪草的塊根洗凈、干燥再粉碎，電子天平稱取5 g，在85%乙醇中進(jìn)行浸泡1 h以去除有色物質(zhì)、油脂和其他小分子物質(zhì)［9］，將浸泡好的貓爪草進(jìn)行減壓抽濾，收獲濾渣。加入純化水，用熱水浸提法提取貓爪草多糖，再次進(jìn)行減壓抽濾后得濾液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中55 ℃真空下將濾液濃縮后得濃縮液，再用95%乙醇4倍體積沉淀24 h，吸取上層乙醇，將沉淀進(jìn)行離心，棄上清液取沉淀，沉淀用純化水溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中用純化水定容至刻度處，精密量取1 mL置于10 mL容量瓶中再用純化水稀釋至刻度線，得到貓爪草的多糖提取液。

取貓爪草多糖提取液2.0 mL于試管中，加入1 mL 5%苯酚和5 mL濃硫酸，振蕩搖勻，沸水中放置20 min，取出后涼水冷卻10 min，在490 nm處測(cè)定其吸光度。根據(jù)回歸曲線方程可以得到貓爪草多糖質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算貓爪草多糖得率：

Y=C×V×nm×106×100%

式中：Y為貓爪草多糖得率（%）；C為貓爪草多糖質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為貓爪草溶液最終體積（mL）；n為稀釋倍數(shù)；m為稱取的貓爪草粉末的質(zhì)量（g）。

1.3.3 單因素試驗(yàn)。

精確稱取貓爪草粉末5 g，在不同提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、不同提取溫度（55、65、75、85、95 ℃）、不同液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，mL∶g）條件下按“1.3.2”方法提取貓爪草多糖，考察各因素對(duì)貓爪草多糖得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)基本原理［10］，以貓爪草多糖得率為響應(yīng)值，提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、液料比（C）為自變量進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)［11］，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)貓爪草多糖得率的影響。

在液料比20∶1（mL∶g）、提取溫度85 ℃的條件下，考察不同提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對(duì)貓爪草多糖得率的影響。由圖1可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)時(shí)間為2.0 h時(shí)，貓爪草多糖得率達(dá)到最大值，為2.628%，再延長(zhǎng)提取時(shí)間多糖得率下降。分析原因可能是剛開始提取時(shí)多糖持續(xù)從植物組織中釋放出來(lái)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖成分分解；另外，雜質(zhì)溶出的增多也會(huì)影響多糖溶出。因此，提取時(shí)間為2.0 h時(shí)，提取效果最佳。

2.1.2 提取溫度對(duì)貓爪草多糖得率的影響。

在液料比20∶1、提取時(shí)間2.0 h的條件下，考察不同提取溫度（55、65、75、85、95 ℃）對(duì)貓爪草多糖得率的影響。由圖2可知，當(dāng)提取溫度在55～85 ℃，多糖得率逐漸增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到85 ℃時(shí)，貓爪草多糖得率達(dá)到最大值，為2.621%；當(dāng)提取溫度大于85 ℃，多糖得率開始下降，這有可能是提取溫度比較高，破壞了已經(jīng)溶出的多糖。因此，在提取溫度為85 ℃時(shí)，提取效果最佳。

2.1.3 液料比對(duì)貓爪草多糖得率的影響。

在提取時(shí)間2.0 h、提取溫度85 ℃的條件下，考察不同液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）對(duì)貓爪草多糖得率的影響。由圖3可知，當(dāng)液料比達(dá)40∶1時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，為1.622%，再增加提取液用量，多糖得率持續(xù)降低。可能因?yàn)楫?dāng)提取的溶液過(guò)少時(shí)，多糖的溶出就會(huì)受到限制，當(dāng)增大提取的溶液量時(shí)，多糖的溶出量也隨之增加，而當(dāng)提取溶液過(guò)多時(shí)，其他雜質(zhì)的溶出影響貓爪草多糖的溶出。因此，在液料比為40∶1時(shí)，提取效果最佳。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、液料比（C）3個(gè)因素設(shè)為自變量，貓爪草多糖得率（Y）設(shè)為因變量，用Box-Behnken組合設(shè)計(jì)法進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

運(yùn)用Design Expert 10.0.1軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到回歸方程為

Y=2.99+0.13A-0.37B-0.25C-0.29AB+0.18AC+0.19BC-0.29A2-0.75B2-0.61C2。

多項(xiàng)式模型方程擬合可靠性由決定系數(shù)（R2）表達(dá)，R2越接近于1，擬合度越好。該模型的R2為0.944 3，模型擬合良好。在回歸方程方差分析中，P的差值系數(shù)是用來(lái)檢驗(yàn)回歸模型系數(shù)的顯著性，P值越小，模型的系數(shù)越顯著［12］。由表3可知，模型P=0.001 3<0.01，表明該模型極為顯著。失擬項(xiàng)P=0.226 2>0.05，模型選取是合理的，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著。B、B2、C2的P值均小于0.01，表明對(duì)貓爪草多糖得率表現(xiàn)出極顯著影響；C、AB、A2的P值均小于0.05，表明對(duì)貓爪草多糖得率表現(xiàn)出顯著影響；A、AC、BC的P值均大于0.05，說(shuō)明對(duì)貓爪草多糖的影響不顯著。F值越大對(duì)貓爪草多糖得率的影響越大，該模型中各因素影響程度依次為提取溫度（B）>液料比（C）>提取時(shí)間（A）。

響應(yīng)面圖和等高線圖可以反映各因素間的交互作用對(duì)貓爪草多糖得率的影響。響應(yīng)面圖越陡越傾斜表示該因素的交互作用對(duì)貓爪草多糖的得率影響越顯著，等高線越密集越接近橢圓形表示該因素的交互作用對(duì)貓爪草多糖的得率影響越顯著［13］。

由圖4可知，提取溫度曲面的彎曲程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于提取時(shí)間的彎曲程度，提取溫度的曲面比較陡峭，說(shuō)明提取溫度對(duì)貓爪草多糖得率影響更大。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為提取時(shí)間1.9～2.3 h、提取溫度80～85 ℃，在此范圍貓爪草多糖得率最高。等高線為橢圓形，說(shuō)明提取時(shí)間與提取溫度的交互作用顯著。

由圖5可知，提取時(shí)間曲面的彎曲程度比液料比曲面的彎曲程度小，液料比的曲面更陡峭，說(shuō)明液料比對(duì)貓爪草多糖得率的影響更大。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為提取時(shí)間1.9～2.3 h、液料比35∶1～40∶1，在此范圍貓爪草多糖得率最高。等高線為橢圓形，說(shuō)明提取時(shí)間與液料比的交互作用顯著。

由圖6可知，提取溫度曲面的彎曲程度與液料比曲面的彎曲程度大致相同，說(shuō)明這2個(gè)因素對(duì)貓爪草多糖得率的影響程度相差不大。確定兩因素最佳水平參數(shù)范圍為提取溫度80～85 ℃、液料比35∶1～40∶1，在此范圍內(nèi)貓爪草多糖得率最高。等高線為橢圓形，說(shuō)明提取溫度與液料比的交互作用顯著。

2.2.2 最佳工藝參數(shù)預(yù)測(cè)和驗(yàn)證試驗(yàn)。

經(jīng)Design Expert 10.0.1擬合后得貓爪草多糖熱浸提法最佳提取工藝為提取時(shí)間2.16 h、提取溫度81.66 ℃、液料比37.90∶1，在此條件下，貓爪草多糖得率的理論值為3.094%。為了充分驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性和試驗(yàn)可行性，采用上述方法得到的最優(yōu)提取工藝以及參數(shù)數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)考慮到試驗(yàn)實(shí)際操作的安全可行性可操作性和簡(jiǎn)便性，確定貓爪草多糖的提取條件為提取時(shí)間2.16 h、提取溫度82 ℃、液料比為38∶1，在此條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，得到的貓爪草多糖實(shí)際得率分別為3.159%、3.145%、3.177%，平均值為3.160%，與理論值（3.094%）相差了0.07百分點(diǎn)，非常接近，這表明響應(yīng)面法對(duì)貓爪草多糖熱浸提提取工藝的優(yōu)化可行可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)以貓爪草為原料，采用熱水浸提法提取貓爪草多糖。選取提取時(shí)間、提取溫度、液料比進(jìn)行3因素5水平的單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、提取溫度、液料比為考察因素，以貓爪草多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了貓爪草多糖的熱水浸提提取工藝。確定最佳提取工藝為提取時(shí)間2.16 h、提取溫度82 ℃、液料比38∶1（mL∶g），在此條件下，貓爪草多糖得率為3.160%，與理論值（3.094%）相差0.07百分點(diǎn)。該試驗(yàn)對(duì)貓爪草多糖成分提取工藝的優(yōu)化為貓爪草多糖的藥理作用研究和進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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