張夢(mèng)玥，劉競(jìng)男，陳 鵬，王 旭，王喜波，徐 寧

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（Soy protein isolate，SPI）不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，還有良好的凝膠性，常被添加于冷凍肉制品、面制品和速凍食品中，改善其質(zhì)構(gòu)特性，增加保水性，提高品質(zhì)。然而，冷凍食品在運(yùn)輸和貯藏時(shí)，由于環(huán)境溫度、pH 值、離子強(qiáng)度等發(fā)生變化，易反復(fù)經(jīng)歷冷凍-解凍過(guò)程（即凍融循環(huán)，F(xiàn)reeze-thaw cycle，F(xiàn)TC），SPI 凝膠有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，產(chǎn)生收縮、變硬、持水能力減弱等現(xiàn)象，導(dǎo)致食品劣變[1-2]。因此，提高SPI 凝膠凍融穩(wěn)定性，滿足冷凍食品行業(yè)需求，已成為此領(lǐng)域亟需攻克的技術(shù)難題。

適度的美拉德反應(yīng)能夠改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，改善蛋白的凝膠特性，例如提升凝膠強(qiáng)度、持水性，改善凝膠彈性等[3-6]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，TG）能夠催化谷氨?；；w）和各種伯胺化合物（包括賴(lài)氨酸殘基中的ε-氨基，即酰基受體）之間發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)[7]。蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)后，分子結(jié)構(gòu)伸展，內(nèi)部的賴(lài)氨酸殘基暴露，TG 酶的結(jié)合位點(diǎn)增加，更易形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的γ-谷氨?；?ε-賴(lài)氨酸異肽鍵，增強(qiáng)交聯(lián)效應(yīng)，使得凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密、有序，抵御外界環(huán)境對(duì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的破壞。

目前，Zhang 等[8]、Yu 等[9]、孫洪蕊等[10]已證實(shí)葡聚糖與SPI 發(fā)生美拉德反應(yīng)可有效增強(qiáng)蛋白乳液抗凍性，然而，針對(duì)蛋白凝膠抗凍性的研究較少，關(guān)于TG 酶法制備的大豆分離蛋白-葡聚糖共價(jià)物凝膠的凍融穩(wěn)定性的研究也鮮有報(bào)道。本文采用TG 酶交聯(lián)不同蛋白質(zhì)量濃度（30，40，50，60 mg/mL）的SPI-D 凝膠，通過(guò)測(cè)定接枝度、SDSPAGE、內(nèi)源熒光光譜、表面疏水性來(lái)分析SPI-D結(jié)構(gòu)變化，再通過(guò)質(zhì)構(gòu)測(cè)定及掃描電鏡等方法，與SPI、D 混合物（SPI+D）凝膠、SPI 凝膠進(jìn)行對(duì)比，研究其在凍融循環(huán)中持水性、硬度、彈性、可溶性蛋白含量及微觀形貌變化，旨在為制備抗凍大豆分離蛋白提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂豆粕，山東禹王有限公司；葡聚糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TG 酶，江蘇一鳴生物有限公司；ANS 熒光探針，Sigma 公司；其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器

TU-1800 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；F-4500 型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；TA-XT2i 型質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)SMS 公司；掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI 制備 按照Wang 等[11]方法，將粉碎過(guò)篩后的脫脂豆粕以質(zhì)量比1∶10 溶于去離子水，取2 mol/L NaOH 溶液，調(diào)節(jié)pH 值至8.5，室溫混勻1 h 后，4 000 r/min 條件下離心30 min。收集上清液，用HCl 溶液（2 mol/L）調(diào)節(jié)pH 值至4.5，室溫靜置2 h 后，棄去上清液，4 000 r/min 離心15 min，將沉淀用去離子水洗滌3 次，復(fù)溶后，用NaOH 溶液（2 mol/L）中和pH 值至7.0，4 ℃條件下透析24 h 除鹽，儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱內(nèi)預(yù)凍，冷凍干燥后置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 樣品制備 SPI-D 制備方法如下：將SPI與葡聚糖（D）以質(zhì)量比3∶1（SPI 質(zhì)量濃度分別為30，40，50，60 mg/mL）溶于PBS 緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）中，25 ℃下攪拌4 h，加入疊氮鈉4 ℃水合過(guò)夜。密封樣品液，95 ℃水浴攪拌3 h 后，迅速冷卻至室溫得到SPI-D 樣品。未經(jīng)加熱的SPI 與葡聚糖混合物為SPI+D 樣品。冷凍干燥后備用。

1.3.3 接枝度（DG）測(cè)定 取200 μL 樣品溶液，添加至4 mL 鄰苯二甲醛溶液（OPA）中，混勻后置于水浴鍋內(nèi)，35 ℃反應(yīng)2 min，測(cè)量波長(zhǎng)340 nm 測(cè)量吸光度，空白對(duì)照為去離子水[12]。其中，OPA 試劑現(xiàn)用現(xiàn)配，用1 mL 去離子水溶解40 mg 鄰苯二甲醛，再按照順序加入2.5 mL 十二烷基磺酸鈉（SDS）溶液、25 mL 硼砂溶液（0.1 mol/L）、0.1 mL β-疏基乙醇，最后用去離子水定容至50 mL。

式中，A0——未發(fā)生反應(yīng)的吸光值；A1——反應(yīng)后的吸光值。

1.3.4 接枝反應(yīng)程度的測(cè)定 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠和13%的分離膠，將樣品溶液（質(zhì)量濃度為5 mg/mL）與5×SDS 上樣緩沖液按體積比4∶1 混合，沸水浴5 min 后冷卻至室溫備用。取10 μL 樣品液注入點(diǎn)樣孔中，濃縮膠中電壓為90 V，進(jìn)入分離膠后以120 V 進(jìn)行電泳，溴酚藍(lán)與凝膠底部相距約1 cm 時(shí)終止電泳、起膠[13]。完成電泳后，移入考馬斯亮藍(lán)溶液中染色12 h，再使用脫色液洗脫3～4 次，直至出現(xiàn)清晰的條帶。

1.3.5 表面疏水性的測(cè)定 樣品溶液處理方式如下：稀釋蛋白質(zhì)量濃度至0.02，0.01，0.005 和0.0025 mg/mL。取8 mL 樣品溶液，加入20 μL 的ANS 熒光探針（8 mmol/L）混勻，25 ℃避光15 min后，進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定。參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)390 nm、發(fā)射波長(zhǎng)470 nm，狹縫5 nm[14]。以測(cè)得的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行作圖，蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)即為線性關(guān)系良好的回歸線斜率。

1.3.6 內(nèi)源熒光強(qiáng)度的測(cè)定 將樣品液用PBS 緩沖溶液（0.01 mol/L、pH 7.0）稀釋?zhuān)鞍踪|(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，固定激發(fā)波長(zhǎng)347 nm，發(fā)射波長(zhǎng)375～550 nm；蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，固定激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)300～400 nm。狹縫5.0 nm，速度240 nm/min[15]。

1.3.7 凝膠制備及凍融循環(huán) 用PBS 緩沖溶液（0.01 mol/L、pH 7.0）溶解各組樣品，并將蛋白質(zhì)量濃度配制為100 mg/mL，再加入TG 酶（酶與蛋白質(zhì)量比3∶100）溶解，調(diào)節(jié)體系pH 值至7.0。在45 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 h 后，90 ℃加熱10 min，制得的凝膠樣品于4 ℃保存過(guò)夜。

1 次凍融循環(huán)（1 FTC）流程如下：將凝膠樣品放入-20 ℃冰箱中冷凍22 h，取出后，移至25 ℃的水浴鍋，解凍2 h。試驗(yàn)中，每組樣品歷經(jīng)5 次凍融循環(huán)（5 FTCs）。

1.3.8 持水性（WHC）測(cè)定 參照Cui 等[16]的方法，取適量凝膠樣品置于離心管內(nèi)，4 000 r/min 離心15 min，離心結(jié)束后小心棄去離心管內(nèi)水分。

式中，mt——離心前凝膠樣品、離心管的總質(zhì)量，g；mr——離心后凝膠樣品、離心管的總質(zhì)量，g。

1.3.9 質(zhì)構(gòu)測(cè)定 采用TA-XT2i 型質(zhì)構(gòu)儀（探頭：P/0.5 柱形）進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)前，將樣品在25 ℃下平衡0.5 h，設(shè)置每測(cè)定1 次，探頭下壓2 次，下行速度：1 mm/s，檢測(cè)速度：5 mm/s，后撤速度：5 mm/s，觸發(fā)力為5 g[17]。

1.3.10 可溶性蛋白含量測(cè)定 按照Z(yǔ)hou 等[18]的方法，切取凝膠樣品，研磨破碎，溶解于PBS 緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）中，定容后磁力攪拌30 min，以10 000 r/min 離心0.5 h?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.11 掃描電鏡測(cè)定 蛋白凝膠樣品處理方法如下：將制得的凝膠切成小塊后，在戊二醛固定液（體積分?jǐn)?shù)2.5%，pH 6.8）中浸泡24 h。取出用0.1 mol/L PBS 緩沖液沖洗后脫水：1）用體積分?jǐn)?shù)50%，70%，90%乙醇溶液各進(jìn)行一次。2）用體積分?jǐn)?shù)100%的乙醇溶液脫水3 次。3）用等體積乙醇（100%）和叔丁醇的混合液置換，時(shí)間15 min。4）純叔丁醇溶液置換，時(shí)間15 min。脫水后將樣品進(jìn)行凍干，鍍金（5 kV，15 mA，1.5 min）后移至掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察[19]。

1.3.12 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，使用SPSS 23.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析（單因素ANOVA，P<0.05 表示差異顯著），采用Origin 2018軟件作圖。試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI 質(zhì)量濃度對(duì)接枝度的影響

通常采用接枝度來(lái)反映美拉德反應(yīng)進(jìn)程，不同蛋白質(zhì)量濃度的SPI-D 接枝度如圖1 所示。蛋白質(zhì)中的游離氨基與多糖的羰基發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成SPI-D 共價(jià)物[8]，隨著SPI 質(zhì)量濃度的不斷增加，SPI-D 的接枝度先升高后降低，當(dāng)SPI 質(zhì)量濃度為50 mg/mL 時(shí)，達(dá)到最大值12.54%。SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加導(dǎo)致體系中底物濃度變大，化學(xué)反應(yīng)速度提高，然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度高于50 mg/mL 時(shí)，溶液黏稠度增加，不易流動(dòng)，同時(shí)產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，阻礙美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，接枝度下降[20]。

圖1 SPI 質(zhì)量濃度對(duì)接枝度的影響Fig.1 Effects of SPI mass concentration on the degree of grafting

圖2 SPI、SPI-D 和SPI+D 的SDS-PAGE 圖譜Fig.2 SDS-PAGE spectra of SPI，SPI-D and SPI+D

2.2 接枝反應(yīng)進(jìn)行程度分析

SDS-PAGE 是一種常用的蛋白質(zhì)分析方法，能夠進(jìn)一步證實(shí)大豆分離蛋白與葡聚糖間共價(jià)鍵的生成[21]。由泳道5～9 可以看出，與SPI 相比，SPI+D 條帶幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明葡聚糖與SPI 僅為簡(jiǎn)單混合，并未發(fā)生反應(yīng)；泳道1～4 在分離膠頂部區(qū)域（高相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)）出現(xiàn)密集的譜帶，連續(xù)性較強(qiáng)，并且1～4 泳道SPI 質(zhì)量濃度依次增加，譜帶顏色逐漸變深，其中泳道3 的條帶顏色最深，泳道4 次之，證實(shí)了SPI 與葡聚糖之間美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，有高分子質(zhì)量共價(jià)物生成，當(dāng)SPI 質(zhì)量濃度為50 mg/mL 時(shí)，反應(yīng)程度最大。

2.3 內(nèi)源熒光光譜分析

熒光物質(zhì)是美拉德反應(yīng)中褐色色素的前體物，可以表征反應(yīng)進(jìn)行程度[15]。圖3a 為固定激發(fā)波長(zhǎng)347 nm 掃描得到的熒光光譜，其熒光強(qiáng)度反映了高級(jí)階段熒光物質(zhì)的產(chǎn)生狀態(tài)。由圖可以看出，SPI+D 的光譜曲線與SPI 十分接近，沒(méi)有熒光物質(zhì)產(chǎn)生。SPI-D 的最大熒光強(qiáng)度（λmax）向短波方向移動(dòng)，發(fā)生藍(lán)移，顯著高于對(duì)照SPI，SPI50-D（SPI 質(zhì)量濃度為50 mg/mL）熒光強(qiáng)度達(dá)到最高值，表明了美拉德反應(yīng)特征熒光小分子的生成。

色氨酸殘基對(duì)微環(huán)境的變化很敏感，內(nèi)源熒光光譜主要通過(guò)觀察其周?chē)鷺?gòu)象和極性改變來(lái)呈現(xiàn)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[22]。如圖3b 所示，固定激發(fā)波長(zhǎng)290 nm 掃描時(shí)，相較SPI、SPI+D，不同蛋白質(zhì)量濃度SPI-D 接枝物的熒光強(qiáng)度均存在降低現(xiàn)象，這是由于糖與蛋白共價(jià)結(jié)合，對(duì)色氨酸殘基具有屏蔽作用，蛋白分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，發(fā)色基團(tuán)在溶劑中暴露，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，SPI-D 內(nèi)源熒光光譜λmax發(fā)生紅移（即向長(zhǎng)波方向移動(dòng)），表明葡聚糖鍵合對(duì)SPI 有顯著的熒光猝滅作用，色氨酸殘基周?chē)h(huán)境極性更高，親水性較強(qiáng)，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)變得松散，更易發(fā)揮功能特性[23]。

2.4 表面疏水性

表面疏水性（H0）反映了疏水基團(tuán)的分布，由蛋白質(zhì)表面殘基暴露的程度決定，體現(xiàn)了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化，也能夠影響其功能性質(zhì)[24]。如圖4 所示，SPI+D 混合物表面疏水性與SPI 無(wú)顯著差異（P＜0.05），說(shuō)明葡聚糖的單純加入對(duì)SPI 的表面疏水性不會(huì)產(chǎn)生影響。然而，SPI-D 表面疏水性顯著高于SPI、SPI+D，并且當(dāng)SPI 質(zhì)量濃度為50 mg/mL 時(shí)，表面疏水性達(dá)到最高為6 649.2，較對(duì)照SPI 提高了23.96%。這是由于大多數(shù)疏水基團(tuán)都埋藏在致密球狀區(qū)域內(nèi)部，美拉德反應(yīng)改變蛋白構(gòu)象，導(dǎo)致聚集體解離或蛋白質(zhì)去折疊，表面疏水性有所增加[25]。

圖4 SPI 質(zhì)量濃度對(duì)表面疏水性的影響Fig.4 Effects of SPI mass concentration on surface hydrophobicity

2.5 凝膠持水性

持水性能夠反映蛋白質(zhì)-水之間在凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的相互作用，表征凝膠吸收和保持水分的能力，是影響凝膠穩(wěn)定的重要功能特性之一[26]。如圖5所示，未經(jīng)凍融時(shí)，SPI50-D 凝膠的持水性高達(dá)91.33%，1 FTC、3 FTCs、5 FTCs 后，持水性分別為67.11%，61.83%，58.87%，因?yàn)榉磸?fù)冷凍-解凍，游離水、結(jié)合水形成低密度冰晶，體積逐漸加大，凝膠結(jié)構(gòu)變得粗糙，孔徑隨之?dāng)U大，為凝膠體系中的水分提供了更多自由流動(dòng)的空間，凝膠持水性整體降低[27]。

圖6 SPI 質(zhì)量濃度對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Fig.6 Effects of SPI mass concentration on gel texture

圖7 SPI 質(zhì)量濃度對(duì)凝膠可溶性蛋白含量的影響Fig.7 Effects of SPI mass concentration on soluble protein content of gel

5 次凍融后，SPI 凝膠持水性減少了44.98%，變化幅度在所有試驗(yàn)組中最大，SPI+D 凝膠的持水性降低42.81%，相較SPI 凝膠無(wú)明顯改善，說(shuō)明多糖的單純加入并未提升凝膠持水性[28]，而SPI50-D 凝膠持水性?xún)H降低了32.46%，保水能力優(yōu)于SPI、SPI+D 凝膠。SPI-D 引入糖分子，比蛋白本身具有更多親水性基團(tuán)，提升了與水分子的結(jié)合能力，而糖鏈空間位阻可以防止蛋白過(guò)度交聯(lián)，糖鏈上的羥基與蛋白質(zhì)分子部分基團(tuán)結(jié)合，抑制蛋白分子間作用，防止其聚集[29-30]，這些變化都能夠促進(jìn)平滑勻稱(chēng)的凝膠網(wǎng)絡(luò)形成，使得結(jié)構(gòu)更為致密，抵御冰晶的破壞，束縛更多的水分子，維持SPI-D 較好的凝膠持水性，提高凍融穩(wěn)定性。

2.6 凝膠質(zhì)構(gòu)

凝膠硬度和彈性是評(píng)價(jià)質(zhì)構(gòu)特性的重要指標(biāo)，能夠表征蛋白分子間作用力的強(qiáng)弱及凝膠結(jié)構(gòu)致密程度、抵抗外力壓縮能力[2]。凍融后，凝膠體系產(chǎn)生冷凍濃縮效應(yīng)，蛋白質(zhì)分子重新緊密排列，相互作用增強(qiáng)，并伴隨著水分子析出，取代了蛋白質(zhì)-水的作用[31]。歷經(jīng)5 FTCs，SPI 凝膠硬度和彈性分別增加了938.96 g、0.10 mm，而SPI+D 和SPI50-D 凝膠硬度和彈性分別增加了818.80 g、0.08 mm，彈性分別增加了324.03 g、0.04 mm，變化幅度順序?yàn)椋篠PI50-D＜SPI+D＜SPI，在凍融循環(huán)過(guò)程中，SPI50-D 硬度、彈性變化程度都最小，說(shuō)明SPI-D 凝膠抵御劣變的能力增強(qiáng)，質(zhì)構(gòu)特性保持得最好。

2.7 可溶性蛋白含量

蛋白質(zhì)分子聚集構(gòu)成了凝膠網(wǎng)絡(luò)，三維結(jié)構(gòu)由相互連接的蛋白質(zhì)骨架組成，測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量能夠衡量蛋白質(zhì)參與形成凝膠的程度[18]。冷凍引起蛋白變性，凝膠結(jié)構(gòu)進(jìn)一步重排，蛋白分子發(fā)生聚合，原本的游離蛋白結(jié)合到了凝膠體系中，引起可溶性蛋白含量降低[31]。同時(shí)蛋白質(zhì)肽鏈展開(kāi)，疏基總基團(tuán)轉(zhuǎn)化為二硫鍵，疏水作用力減弱，在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用下，可溶性蛋白結(jié)合到原先的凝膠網(wǎng)絡(luò)中，形成更粗糙、不規(guī)則的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致凝膠品質(zhì)劣變[32]。

5 FTCs 后，SPI、SPI+D 凝膠可溶性蛋白含量分別降低了7.17%，3.61%，而SPI50-D 凝膠可溶性蛋白含量為12.79%，僅降低2.05%，各試驗(yàn)組可溶性蛋白含量變化幅度為：SPI-D＜SPI+D＜SPI。美拉德反應(yīng)減少了凍融過(guò)程中酶法凝膠可溶性蛋白的降低量，也能防止蛋白分子因脫水形成不溶性聚集體，抵御凍融循環(huán)對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)的破壞。

2.8 凝膠微觀形貌變化

掃描電子顯微鏡（SEM）能夠直觀地展示蛋白質(zhì)凝膠的微觀三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，圖8 顯示了不同SPI 質(zhì)量濃度凝膠在未凍融時(shí)及凍融循環(huán)5 次后，放大×100 和×5 000 下的微觀形貌圖。5 FTCs后，凝膠的表面結(jié)構(gòu)破裂、塌陷，內(nèi)部平均孔徑增大，凝膠基質(zhì)變得疏松，低溫使得凝膠中水分凍結(jié)形成低密度冰晶，冰晶嵌入，呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)，結(jié)冰膨脹壓力和滲透壓力也會(huì)顯著破壞凝膠形貌[33]。凝膠被破壞程度：SPI＞SPI+D＞SPI-D，SPI 凝膠、SPI+D 凝膠網(wǎng)絡(luò)都有局部斷裂現(xiàn)象出現(xiàn)，凍結(jié)形成的大冰晶破壞了三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，而SPI-D 凝膠相對(duì)均勻、致密、規(guī)則，且SPI 質(zhì)量濃度為50 mg/mL 時(shí)，凝膠微觀結(jié)構(gòu)保持得最好，在高放大倍數(shù)（×5 000）下可以明顯觀察到致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)間相互交聯(lián)，孔洞細(xì)小、均勻，表征了較好的持水性，這是由于美拉德反應(yīng)使SPI 結(jié)構(gòu)打開(kāi)，有利于TG 酶的交聯(lián)作用，葡聚糖的結(jié)合也能增加蛋白表面疏水性，分子間斥力也隨之增加，抑制蛋白質(zhì)分子間聚集變性，減少冰晶的形成，顯著提高凝膠強(qiáng)度[34]，提升凝膠凍融穩(wěn)定性。

圖8 不同SPI 質(zhì)量濃度蛋白樣品凝膠凍融前、后的SEM 圖Fig.8 SEM images of protein samples with different SPI mass concentration before and after gel freeze-thaw

3 結(jié)論

1）通過(guò)接枝度測(cè)定和SDS-PAGE 試驗(yàn)表明大豆分離蛋白與葡聚糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)，生成大豆分離蛋白-葡聚糖共價(jià)物（SPI-D），表面疏水性和內(nèi)源熒光光譜分析證明了SPI 結(jié)構(gòu)的變化，蛋白分子結(jié)構(gòu)伸展、柔性增大，有美拉德反應(yīng)的特定熒光物質(zhì)生成。

2）經(jīng)過(guò)5 次凍融循環(huán)，當(dāng)SPI 質(zhì)量濃度為50 mg/mL 時(shí)，TG 酶交聯(lián)下的SPI-D 凝膠的持水性、可溶性蛋白含量與SPI、SPI+D 凝膠相比，降低程度最小，硬度、彈性等質(zhì)構(gòu)特性也保持得最佳，同時(shí)掃描電子顯微鏡觀察到，SPI-D 凝膠凍融后呈現(xiàn)均勻纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表面平滑，基質(zhì)更加緊密，凝膠形貌優(yōu)于與對(duì)照組。本研究證明美拉德反應(yīng)切實(shí)有效增強(qiáng)了TG 酶法SPI-D 凝膠的凍融穩(wěn)定性，對(duì)制備冷凍食品專(zhuān)用的大豆分離蛋白具有理論與實(shí)踐價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。