梁家浩 張馨慧 王海

摘要：為確定潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的潛在生物標(biāo)志物，并預(yù)測(cè)其靶向中藥，從GEO數(shù)據(jù)庫下載包含人類UC和健康對(duì)照組織（GSE179285、GSE206285和GSE87466）的數(shù)據(jù)集，合并GSE179285和GSE206285數(shù)據(jù)集，通過limma R軟件包篩選出UC與健康對(duì)照組織之間的差異表達(dá)基因（DEGs）。采用LASSO回歸模型和支持向量機(jī)遞歸特征消除算法篩選出核心生物標(biāo)志物。GSE87466數(shù)據(jù)集用作驗(yàn)證隊(duì)列，受試者工作特征曲線用于評(píng)估診斷效能。利用CIBERSORT探討UC中的免疫浸潤(rùn)特性，并進(jìn)一步分析潛在生物標(biāo)志物與不同免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。最后，在HERB數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)核心生物標(biāo)志物靶向中藥。共篩選出157個(gè)DEGs，其中102個(gè)基因上調(diào)，55個(gè)基因下調(diào)。功能富集分析顯示，這些DEGs主要參與IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、趨化因子信號(hào)通路、體液免疫反應(yīng)、中性粒細(xì)胞趨化和遷移等。LOC389023、OLFM4、AQP8和CWH43被鑒定為UC的潛在生物標(biāo)志物，且其診斷價(jià)值在GSE87466驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中有顯著意義。CIBERSORT免疫浸潤(rùn)分析顯示，UC與健康對(duì)照組織的免疫浸潤(rùn)特征存在顯著差異。UC組發(fā)現(xiàn)高水平的CD4+記憶活化T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，而健康對(duì)照組發(fā)現(xiàn)高水平的記憶B細(xì)胞、CD4+記憶靜息T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和靜息樹突狀細(xì)胞。在HERB數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到淡豆豉、牡荊子、骨節(jié)草、酒、苦豆子、鹿茸和紫河車7味靶向中藥。研究認(rèn)為，LOC389023、OLFM4、AQP8和CWH43可能作為UC的診斷生物標(biāo)志物；淡豆豉等7味靶向中藥可能通過調(diào)節(jié)肺腸菌群、影響炎癥通路、調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮對(duì)UC的治療作用。

關(guān)鍵詞：潰瘍性結(jié)腸炎；生物信息學(xué)；機(jī)器學(xué)習(xí)；免疫浸潤(rùn)；核心基因；靶向中藥

中圖分類號(hào)：R285?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1002-4026（2023）06-0056-12

Exploringtrait genes and predicting the targeted Chinese medicine

for ulcerative colitis based on bioinformatics and machine learning

LIANG Jiahao1， ZHANG Xinhui 1， WANG Hai 1，2*

（1. First Clinical Medical College，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2. First Affiliated Hospital， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract∶For the identification of potential biomarkers for ulcerative colitis （UC） and prediction of their targeted traditional Chinese medicines， datasets containing human UC and healthy control tissues （GSE179285， GSE206285， and GSE87466） were downloaded from the GEO database. The GSE179285 and GSE206285 datasets were merged， and the differentially expressed genes （DEGs） between UC and healthy control tissues were screened using the limma R package. The LASSO regression model and SVM-RFE （support vector machine recursive feature elimination） algorithm were used to identify core biomarkers. The GSE87466 dataset was used as a validation cohort， and the ROC （receiver operating characteristic） curve was used to evaluate the diagnostic performance. CIBERSORT was used to investigate the immune infiltration characteristics in UC， and the correlation between potential biomarkers and different immune cells was further analyzed. Subsequently， the targeted traditional Chinese medicinal herbs were predicted using the HERB database. In total， 157 DEGs were screened out， with 102 genes upregulated and 55 genes downregulated. Functional enrichment analysis showed that these DEGs were mainly involved in IL-17 and TNF signaling pathway， rheumatoid arthritis， chemokine signaling pathway， humoral immune response， neutrophil chemotaxis， neutrophil migration， etc. LOC389023， OLFM4， AQP8， and CWH43 were identified as potential biomarkers for UC， and their diagnostic values were significant in the GSE87466 validation dataset. CIBERSORT immune infiltrate analysis showed significant differences in immune infiltration characteristics between UC and healthy control tissues. High levels of CD4+ memory activated T cells， M1 macrophages， and neutrophils were found in the UC group， while high levels of memory B cells， CD4+ memory resting T cells， M2 macrophages， and resting dendritic cells were found in the healthy control group. Seven traditional Chinese medicinal herbs targeting core biomarkers， including Sojae Semen Praeparatum， Fructus Viticis Cannabifoliae， Herba Equiseti Palustris， Liquor， Sophora alopecuroides L.， Cervi Cornu Pantotrichum， and Placenta Hominis， were predicted in the HERB database. The study suggested that LOC389023， OLFM4， AQP8， and CWH43 were identified as diagnostic biomarkers for UC， and the aforementioned seven targeted traditional Chinese medicinal herbs may play a therapeutic role in UC by regulating gut microbiota， affecting inflammation pathways， and modulating the immune system.

Key words∶ulcerative colitis; bioinformatics; machine learning; immune infiltration; core gene; targeted traditional Chinese medicine

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以結(jié)腸慢性炎癥為特征的復(fù)雜疾病，全球每年約有9萬至10萬UC患者，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［1-2］。迄今為止，UC的潛在病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，以至于限制了UC的早期診斷和治療。UC不僅降低患者生活質(zhì)量，也給社會(huì)帶來巨大的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［3］。因此，目前迫切需要深入了解UC的發(fā)病機(jī)制，從分子水平鑒定疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物，為UC的早期診斷提供新的思路。

醫(yī)學(xué)界至今尚無根治UC的方法，臨床上以緩解癥狀、提高患者生活質(zhì)量為首要目標(biāo)，以降低危重并發(fā)癥和結(jié)直腸癌發(fā)生率為基本治療原則［4］。中醫(yī)藥治療UC方法多樣且副作用較少［5］，通過挖掘有效靶向中藥，可為UC的中醫(yī)臨床治療提供參考和方向。近年來，將微陣列技術(shù)、生物信息學(xué)分析和不同機(jī)器學(xué)習(xí)算法相結(jié)合，用于復(fù)雜疾病的生物標(biāo)志物篩選、診斷預(yù)測(cè)和預(yù)后評(píng)估已成為各學(xué)科熱點(diǎn)，計(jì)算生物學(xué)方法也為進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供范圍和依據(jù)［6-7］。

本研究利用生物信息學(xué)聯(lián)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選出UC病理過程中潛在的生物標(biāo)志物并對(duì)其診斷效能進(jìn)行驗(yàn)證，通過核心基因預(yù)測(cè)靶向中藥，根據(jù)藥物性味歸經(jīng)拓展中醫(yī)理論，同時(shí)挖掘疾病相關(guān)生物過程、信號(hào)通路以及遠(yuǎn)期并發(fā)癥，探討其免疫浸潤(rùn)機(jī)制。研究流程參見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集選取與注釋

芯片數(shù)據(jù)來源于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）中的GSE179285［8］、GSE206285［9］和GSE87466［10］數(shù)據(jù)集，共包含692個(gè)UC樣本和70個(gè)健康對(duì)照樣本。下載數(shù)據(jù)集探針矩陣和平臺(tái)文件，根據(jù)平臺(tái)文件信息，確定探針名稱與基因名稱的對(duì)應(yīng)關(guān)系，將探針矩陣轉(zhuǎn)化為基因矩陣。

1.2 數(shù)據(jù)合并與差異分析

將GSE179285和GSE206285兩個(gè)數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)矩陣進(jìn)行合并作后續(xù)差異分析。引用R語言limma軟件包，設(shè)定|log2FC|＞1且矯正后P＜0.05以獲取差異表達(dá)基因（DEGs），引用ggplot2和pheatmap軟件包進(jìn)行火山圖及熱圖繪制。

1.3 DEGs功能注釋和富集分析

對(duì)1.2所得DEGs通過R語言clusterProfiler軟件包進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，引用DOSE軟件包進(jìn)行疾病本體論（disease ontology，DO）富集分析。設(shè)定P＜0.05為過濾閾值，篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、信號(hào)通路以及相關(guān)疾病。采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）方法，以從分子特征數(shù)據(jù)庫（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb）下載所得的c5.go.v7.4.symbols.gmt和c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt基因集作參考，引用limma、org.Hs.eg.db、clusterProfiler和enrichplot軟件包對(duì)合并芯片數(shù)據(jù)集中UC患者的校正基因表達(dá)矩陣進(jìn)行富集分析，以獲取活躍的生物功能和信號(hào)通路。

1.4 機(jī)器學(xué)習(xí)篩選核心基因

通過R語言glmnet軟件包進(jìn)行最小絕對(duì)值收斂和選擇算子（LASSO）回歸分析，引用e1071、kernlab和caret軟件包進(jìn)行支持向量機(jī)-遞歸特征消除（SVM-RFE）算法構(gòu)建，最后引用Venn軟件包將兩種算法所識(shí)別得到的基因繪制維恩圖，取交集作為核心基因。

1.5 核心基因驗(yàn)證及診斷價(jià)值分析

引用R語言limma和ggpubr軟件包，使用獨(dú)立數(shù)據(jù)集GSE87466對(duì)核心基因在UC和健康對(duì)照組之間的表達(dá)差異進(jìn)行驗(yàn)證。引用pROC軟件包建立受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計(jì)算ROC曲線下面積（area under curve，AUC），評(píng)估核心基因在合并數(shù)據(jù)集（GSE179285和GSE206285）及獨(dú)立驗(yàn)證數(shù)據(jù)集（GSE87466）的診斷效能。

1.6 免疫浸潤(rùn)分析

引用R語言e1071軟件包對(duì)合并芯片數(shù)據(jù)集的校正基因表達(dá)矩陣進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析，過濾免疫浸潤(rùn)結(jié)果。用CIBERSORT計(jì)算UC基因表達(dá)譜中22種免疫細(xì)胞的相對(duì)比例。引用corrplot和vioplot軟件包繪制免疫細(xì)胞共表達(dá)熱圖和免疫浸潤(rùn)差異小提琴圖。

1.7 核心基因與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析

引用R語言limma、reshape2和ggpubr軟件包，讀取核心基因在合并芯片數(shù)據(jù)集校正基因表達(dá)矩陣中的表達(dá)量，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析探討核心基因表達(dá)量與免疫細(xì)胞數(shù)量之間的相關(guān)性并繪制棒棒糖圖。

1.8 UC靶向治療中藥預(yù)測(cè)

HERB（http：//herb.ac.cn/）是集高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和科研文獻(xiàn)數(shù)據(jù)于一體的天然藥物數(shù)據(jù)庫平臺(tái)［11］。將篩選所得核心基因依次輸入HERB數(shù)據(jù)庫，檢索得到其靶向藥物，通過查閱《中華本草》［12］和《中藥大辭典》［13］篩選出相關(guān)中藥，并對(duì)其性味歸經(jīng)繪制雷達(dá)圖進(jìn)行可視化總結(jié)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算均采用R 4.2.1及相關(guān)軟件包完成。q value為矯正后的P值，表示P值產(chǎn)生假陽性的概率。相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UC相關(guān)DEGs識(shí)別

篩選出157個(gè)UC相關(guān)DEGs，其中上調(diào)基因102個(gè)，下調(diào)基因55個(gè)，見火山圖（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2），其中上調(diào)基因用紅色表示，下調(diào)基因以藍(lán)色表示。熱圖（見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖3）展示了疾病試驗(yàn)組與健康對(duì)照組樣本中DEGs，顏色由紅到藍(lán)，表達(dá)量由高到低，分別展示30個(gè)上調(diào)和下調(diào)基因。

2.2 富集分析結(jié)果

GO富集分析篩選出BP條目218個(gè)、CC條目26個(gè)、MF條目61個(gè)，由OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4可知，BP主要涉及體液免疫反應(yīng)、抗微生物體液反應(yīng)、中性粒細(xì)胞趨化和遷移等；CC主要富集在含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、膠原三聚體、分泌顆粒管腔和胞漿囊泡管腔等；MF主要包括CXCR趨化因子受體結(jié)合、趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成等。由OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖5可知，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)富集通路主要有IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和趨化因子信號(hào)通路等。DO富集分析得到447種疾病，如OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖6所示，主要有間質(zhì)性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、阻塞性肺疾病、肺纖維化和腸道疾病等。對(duì)UC樣本表達(dá)矩陣進(jìn)行GSEA富集分析，由OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖7（a）可知，活躍的GO富集條目有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、體液免疫、細(xì)胞對(duì)干擾素-γ的反應(yīng)、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分。如OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖7（b）所示，活躍的KEGG富集通路有補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作、ECM-受體互作、利什曼原蟲感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。

2.3 機(jī)器學(xué)習(xí)篩選核心基因

如圖1～2所示，通過LASSO（least absolute shrinkage and selection operator）回歸分析篩選得到特征基因51個(gè)，SVM-RFE算法篩選得到特征基因6個(gè)，將兩種機(jī)器學(xué)習(xí)算法所得特征基因結(jié)果繪制維恩圖（見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖8），取交集得到4個(gè)核心特征基因，分別為L(zhǎng)OC389023、OLFM4、AQP8和CWH43。

2.4 核心基因和診斷能力驗(yàn)證

在外部獨(dú)立數(shù)據(jù)集GSE87466中驗(yàn)證上述步驟得出的4個(gè)核心基因（LOC389023、OLFM4、AQP8和CWH43），結(jié)果表明（圖3），相較于健康對(duì)照者，AQP8、CWH43和LOC389023在UC患者中的基因表達(dá)顯著下調(diào)，而OLFM4則顯著上調(diào)。后續(xù)診斷價(jià)值分析結(jié)果也表明，機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選出來的4個(gè)核心基因無論是在內(nèi)部合并數(shù)據(jù)集（見圖4）或是外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集（見圖5）中，ROC曲線下面積AUC均大于0.7，對(duì)于區(qū)分健康對(duì)照者和UC患者具有較高診斷效能。

2.5 免疫浸潤(rùn)分析

由免疫細(xì)胞相關(guān)性分析結(jié)果（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖9）可知，活化肥大細(xì)胞與靜息肥大細(xì)胞相互作用最顯著且兩者呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.59）。有7種免疫細(xì)胞在健康對(duì)照者和UC患者中的浸潤(rùn)差異顯著（P值＜0.05），相較于健康對(duì)照者，記憶B細(xì)胞、CD4+記憶靜息T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和靜息樹突狀細(xì)胞在UC患者中下調(diào)，而CD4+記憶活化T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞則上調(diào)，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖10。

2.6 核心基因與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析

由OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖11～14可知，4個(gè)核心基因LOC389023、OLFM4、AQP8和CWH43的表達(dá)量均與靜息肥大細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)，與活化肥大細(xì)胞數(shù)目呈負(fù)相關(guān)。

2.7 UC靶向治療中藥預(yù)測(cè)

在HERB數(shù)據(jù)庫依次檢索4個(gè)核心基因LOC389023、OLFM4、AQP8和CWH43，除LOC389023暫無相關(guān)藥物數(shù)據(jù)，其余3個(gè)核心基因均能檢索到相關(guān)靶向藥物，通過《中華本草》和《中藥大辭典》篩選整理得到核心基因靶向中藥7味（表1），分別為淡豆豉、牡荊子、骨節(jié)草、酒、苦豆子、鹿茸和紫河車。對(duì)以上藥物進(jìn)行性味歸經(jīng)總結(jié)，并繪制雷達(dá)圖進(jìn)行可視化展示，由圖6～7可知，靶向中藥大多藥性偏溫，藥味偏苦，歸經(jīng)入肺。

3 討論與結(jié)論

UC作為一種病因尚未明確的炎癥性腸道疾病，未經(jīng)及時(shí)治療可能會(huì)導(dǎo)致腸梗阻、腸穿孔等并發(fā)癥，甚至癌變。迄今尚無有效的預(yù)防和治療方法，在國(guó)際醫(yī)學(xué)領(lǐng)域仍是一個(gè)亟待解決的難題。因此，對(duì)其發(fā)病機(jī)制及診療方案的研究顯得尤為重要。

運(yùn)用LASSO和SVM-RFE算法對(duì)157個(gè)DEGs進(jìn)行篩選得到LOC389023、OLFM4、AQP8和CWH43四個(gè)UC核心生物標(biāo)志物。LOC389023（也稱作BC0329133）由位于人類2號(hào)染色體上的DPP10-AS1轉(zhuǎn)錄而來。Shulha等［14］研究發(fā)現(xiàn)，LOC389023作為一種新型順式反義RNA，在胎兒和成人前額葉皮質(zhì)提取的核RNA組分中高度富集，其在人體中通過順式作用招募PRC2等轉(zhuǎn)錄抑制因子來抑制正義轉(zhuǎn)錄物DPP10的表達(dá)。Allen等［15］研究發(fā)現(xiàn)DPP10通過切割細(xì)胞因子和趨化因子的末端二肽來調(diào)節(jié)炎癥。DPP10水平的改變可以調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［16］。由此推測(cè)，LOC389023在UC病理過程中可能通過抑制DPP10的表達(dá)來參與炎癥調(diào)節(jié)。嗅覺介導(dǎo)素4（OLFM4）是一種促進(jìn)細(xì)胞黏附的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，最初從人成髓細(xì)胞克隆而來［17］，其編碼蛋白是促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的抗凋亡因子。相關(guān)研究表明，OLFM4在人小腸和結(jié)腸的隱窩基柱狀細(xì)胞中高表達(dá)［18］。作為IL-22誘導(dǎo)的腫瘤干性基因，OLFM4在原發(fā)硬化性膽管炎相關(guān)UC中的表達(dá)量明顯升高［19］。脂多糖（LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)［20］，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過LPS處理的Raw264.7細(xì)胞中，OLFM4和DPP10的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)［21］。此外，與正常組相比，葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)腸組織中OLFM4的表達(dá)明顯升高，與本研究分析結(jié)果一致。因此，OLFM4的高表達(dá)可能與UC炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)。水通道蛋白8（AQP8）存在于胰腺和結(jié)腸中，在腸道吸收水分中起重要作用，其可能參與細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)和黏膜液通量的過程［22］。相關(guān)研究表明，液體通量可能在黏膜防御中起重要作用［23-24］。據(jù)報(bào)道，荊芥、防風(fēng)可明顯改善UC模型大鼠的癥狀和組織病理學(xué)，加快腸黏膜愈合，其機(jī)制可能與上調(diào)結(jié)腸黏膜AQP4和AQP8表達(dá)水平有關(guān)［25］。細(xì)胞壁生物合成43C末端同源物（CWH43）是一種進(jìn)化保守的多位內(nèi)核膜蛋白，CWH43缺失可降低小鼠大腦中L1細(xì)胞黏附分子（L1CAM）蛋白的表達(dá)［26-27］。結(jié)腸活檢的免疫組織化學(xué)顯示，相較于正常結(jié)腸組織，L1CAM在慢性炎癥性腸病患者組織的腸上皮細(xì)胞中高表達(dá)［28］。因此，CWH43可能通過調(diào)節(jié)L1CAM的表達(dá)來參與UC的病理過程。

GO和KEGG通路富集分析結(jié)果表明，DEGs大多富集于與免疫應(yīng)答相關(guān)的生物學(xué)過程及通路，包括IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、趨化因子信號(hào)通路、體液免疫反應(yīng)、中性粒細(xì)胞趨化和遷移等，以上表明免疫因子在UC病理生理過程中起著至關(guān)重要的作用。也有相關(guān)研究［29-32］表明UC中失調(diào)的基因主要集中在免疫過程，而且粒細(xì)胞浸潤(rùn)和IL-17信號(hào)傳導(dǎo)可導(dǎo)致結(jié)腸組織損傷和炎癥。對(duì)于UC等炎癥性疾病，趨化因子可募集白細(xì)胞進(jìn)入腸黏膜，引發(fā)各種炎癥效應(yīng)，包括白細(xì)胞活化、顆粒外滲、產(chǎn)生金屬蛋白酶降解基質(zhì)等［33］。目前已有研究通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和臨床病例證實(shí)趨化因子與結(jié)腸炎的機(jī)制有關(guān)，表明趨化因子在UC病因中可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［34］。GSEA富集分析結(jié)果表明，來自UC樣本表達(dá)矩陣的差異基因主要活躍富集在體液免疫、細(xì)胞對(duì)干擾素-γ的反應(yīng)、補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫相關(guān)信號(hào)，進(jìn)一步肯定了免疫應(yīng)答在UC發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)性及重要性。

通過CIBERSORT算法分析發(fā)現(xiàn)，健康對(duì)照者和UC患者中的浸潤(rùn)差異顯著，記憶B細(xì)胞、CD4+記憶靜息T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和靜息樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞亞型與UC的生物學(xué)過程密切相關(guān)。據(jù)以往研究［35-36］報(bào)道，上述免疫細(xì)胞大多在UC中處于異常狀態(tài)?；罨腡細(xì)胞可以分化成調(diào)節(jié)性和效應(yīng)性T細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥性腸?。?7-38］。此外，濾泡輔助性T細(xì)胞和濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的失衡也與UC相關(guān)［39］。CD4+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞能夠增加Th2相關(guān)細(xì)胞因子和Th17相關(guān)促炎細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)腸黏膜炎癥［40-41］。通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選出來的4個(gè)核心基因表達(dá)量均與肥大細(xì)胞顯著相關(guān)，已有研究證實(shí)肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞在功能上參與UC的過程，UC患者在緩解期出現(xiàn)的直腸高敏感性及腸易激綜合征樣癥狀與肥大細(xì)胞的活性相關(guān)［42-43］。另有實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑色甘酸鈉灌胃可減輕小鼠UC炎癥反應(yīng)，間接表明肥大細(xì)胞參與了UC的發(fā)病［44］。近年對(duì)UC免疫因素的研究主要集中在T細(xì)胞、自身抗體、下游損傷免疫因子、纖維化和固有免疫系統(tǒng)、過氧化物酶體增殖體激活受體和其他細(xì)胞因子［45］。本研究結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)結(jié)論一致，同時(shí)還注意到肥大細(xì)胞在UC免疫微環(huán)境中的作用和機(jī)制，其與LOC389023、OLFM4、AQP8和CWH43四個(gè)潛在診斷免疫相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)和調(diào)控可能是UC發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，可作為后續(xù)研究的關(guān)注點(diǎn)和切入點(diǎn)，以期為疾病的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)，開發(fā)更為有效的臨床治療手段。

根據(jù)病因、病機(jī)及臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將UC歸類于“久痢”“休息痢”“腸澼”“大瘕泄”等范疇［46］。本研究通過在HERB數(shù)據(jù)庫對(duì)UC核心基因進(jìn)行檢索，找到其對(duì)應(yīng)的靶向中藥，并查閱《中華本草》和《中藥大辭典》對(duì)中藥的性味歸經(jīng)進(jìn)行歸納總結(jié)，整理得到淡豆豉、牡荊子、骨節(jié)草、酒、苦豆子、鹿茸和紫河車7味靶向中藥，上述藥物大多藥性偏溫，藥味偏苦，歸經(jīng)入肺。藥理研究表明，淡豆豉對(duì)人體腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和脆弱擬桿菌6種人體腸道常駐菌具有不同程度的調(diào)節(jié)作用［47］。而腸道菌群紊亂在UC的病理上起重要作用，中藥與腸道菌群的相互作用是UC治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［48］。已有研究證實(shí)牡荊子脂質(zhì)能擴(kuò)張小鼠氣道平滑肌，延長(zhǎng)由Ach和組胺介導(dǎo)的豚鼠喘息潛伏期［49］。凌緯緯［50］發(fā)現(xiàn)牡荊粗提物對(duì)枯草桿菌、大腸埃希菌、四聯(lián)球菌、熒光假單胞菌都有一定的抑制作用。骨節(jié)草，又名節(jié)節(jié)草，實(shí)驗(yàn)證明其總生物堿對(duì)大腸桿菌、藤黃微球菌、奇異變形桿菌、枯草桿菌、黑曲霉菌、產(chǎn)氣桿菌6個(gè)菌種均具有較好的抑菌效果［51］。由此推斷，淡豆豉、牡荊子和骨節(jié)草3味中藥可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群在UC病理過程中發(fā)揮療效。繁體字“醫(yī)”由3部分組成：“醫(yī)”意為外部受到創(chuàng)傷，“殳”指針灸推拿等治療手段，“酉”則意為酒。即在受傷后通過按摩、針刺等治療，再配合酒的飲用，最后達(dá)到治療效果，如此一來方可稱之為“醫(yī)”［52］。可見古人早已意識(shí)到酒的醫(yī)用價(jià)值?！侗静菥V目》有云：“唯米酒入藥用”。米酒，今稱黃酒，現(xiàn)代藥理研究表明其有降血壓、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效［53］?？喽棺踊瘜W(xué)成分以生物堿類為主，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明其具有抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，而且是以免疫抑制為主的中草藥［54］。鹿茸具有較好的抗炎及增強(qiáng)免疫作用，其成分鹿茸多肽能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞相關(guān)因子，抑制多種慢性炎癥的發(fā)生［55］。紫河車為健康產(chǎn)婦娩出的胎盤，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為胎盤含蛋白質(zhì)、糖、鈣、維生素、免疫因子等成分，能增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，同時(shí)胎盤γ-球蛋白含有干擾素，可用于預(yù)防和控制病毒感染［56］。因此，酒、苦豆子、鹿茸和紫河車4味中藥對(duì)UC的藥理作用或主要體現(xiàn)在抗炎及調(diào)節(jié)免疫。上述7味中藥大多性溫味苦，歸肺經(jīng)。劉曉燕等［57］通過探討四氣五味與臟腑補(bǔ)瀉的關(guān)系，總結(jié)出“苦溫瀉寒濕”及“苦溫瀉肺燥”等治法規(guī)律。此外，本研究DO富集分析結(jié)果表明，DEGs主要富集在肺和腸道疾病，結(jié)合靶向中藥的主要性味歸經(jīng)，皆與“肺與大腸相表里”理論不謀而合。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就已提出“肺與大腸相表里”的思想。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的興起，多組學(xué)方法的應(yīng)用，學(xué)者們將微生物研究和免疫研究等結(jié)合在一起，提出了“腸-肺軸”的概念，將“肺與大腸相表里”的機(jī)制研究過渡到新階段［58-59］。羅瑞娟等［60］通過“肺-腸軸”概念闡述了肺-腸聯(lián)系，詮釋了“肺與大腸相表里”理論的科學(xué)性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥能夠從調(diào)節(jié)肺腸菌群、影響炎癥通路、調(diào)節(jié)免疫等多方面發(fā)揮對(duì)UC的治療作用。

綜上所述，LOC389023、OLFM4、AQP8和CWH43可能作為UC的診斷生物標(biāo)志物，然而這些生物標(biāo)志物能否區(qū)分不同的內(nèi)表型尚未清楚。因此，未來有必要進(jìn)一步研究這些基因?qū)Σ煌瑑?nèi)表型的區(qū)分效能。此外，淡豆豉、牡荊子、骨節(jié)草、酒、苦豆子、鹿茸和紫河車7味中藥可能通過調(diào)節(jié)肺腸菌群、影響炎癥通路、調(diào)節(jié)免疫等方面干預(yù)UC的病理進(jìn)程，這也為其臨床治療用藥提供了參考和方向。

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