危 瀟，黎妍妍，姚經(jīng)武，曹春霞，黃大野

（1.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心/國家生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生物農(nóng)藥創(chuàng)制重點實驗室，武漢 430064；2.湖北工業(yè)大學(xué)，武漢 430068；3.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030）

木霉菌（Trichodermasp.）作為一類重要的生防真菌，廣泛存在于自然界中，通常定居在腐爛的木材和其他形式的有機基質(zhì)中，具有分布廣、適應(yīng)性強、繁殖快等特點［1，2］。木霉屬包括多個菌種，有超過400 多個種類［3］。在農(nóng)業(yè)防治上，常用的有綠木霉（T.virens）、長枝木霉（T.longibrachiatum）、綠色木霉（T.viride）、康寧木霉（T.koningii）、哈茨木霉（T.harzianum）、棘孢木霉（T.asperellum）、深綠木霉（T.atroviride）、蓋姆斯木霉（T.gamsii）等［3］。它既可以作為生物防治劑，也可以作為生物促進劑。木霉可以使用多種復(fù)雜的直接和間接生物防治機制［4］來防治多種植物病害，既可以對抗生物脅迫如廣譜病原微生物（真菌、細菌、昆蟲和線蟲）等，也可以對抗非生物脅迫如惡劣的環(huán)境條件等。對病原體的直接影響包括細胞壁降解酶（CWDEs）的產(chǎn)生、抗生素的合成、對空間和營養(yǎng)物質(zhì)（主要是碳、氮和鐵）的競爭以及與真菌病原體建立直接的寄生關(guān)系［4］。

煙草是中國重要的經(jīng)濟作物，但煙葉生產(chǎn)主要依賴化學(xué)農(nóng)藥防治土傳病害，長期使用化學(xué)農(nóng)藥易導(dǎo)致病原菌抗藥性增強，同時還會造成環(huán)境污染［5］。因此，需探索出綠色、有效的煙草土傳病害防治方法。與化學(xué)農(nóng)藥相比，生物農(nóng)藥具有高效、選擇性強、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點。在環(huán)境保護、綠色發(fā)展等理念的支持下，生物農(nóng)藥已成為生物防治領(lǐng)域的研究熱點［5］。

本研究從湖北省五峰縣煙田土壤中分離獲得1株木霉，通過生物學(xué)特征分析和分子生物學(xué)手段鑒定其種類，并采用對峙試驗和活體盆栽試驗測定其對煙草黑脛病菌和煙草根腐病菌，即煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的生防效果，為利用綠色環(huán)保的生物農(nóng)藥防治煙草病害提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及培養(yǎng)基

供試木霉菌株WF2 分離自湖北省五峰縣煙田土壤樣品。供試病原真菌煙草疫霉和尖孢鐮刀菌由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心提供。供試煙草為云煙87。培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L、pH 自然；馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDB）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L、pH 自然；V8培養(yǎng)基：V8 汁220 mL、碳酸鈣2 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L，pH 自然；發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮50 g、蒸餾水50 g、pH 自然。

1.2 哈茨木霉的分離純化培養(yǎng)

稱取10 g 土壤樣品，加入90 mL 無菌水，室溫下150 r/min 振蕩培養(yǎng)30 min。吸取上清液，采用10 倍梯度稀釋法分離木霉［6］，每個PDA 培養(yǎng)基平板上均勻涂布100 μL 土壤稀釋液。培養(yǎng)4～5 d，在稀釋液平板上挑取單菌落在PDA 培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)，重復(fù)3～4 次后得到純化菌株，編號WF2。

1.3 哈茨木霉的系統(tǒng)分類學(xué)鑒定

1.3.1 木霉菌株的形態(tài)學(xué)觀察 將分離純化后的菌株WF2 接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫避光培養(yǎng)7 d，每24 h 觀察菌落形態(tài)（包括顏色、質(zhì)地等）［7］。

1.3.2 木霉菌株的分子生物學(xué)鑒定 對分離到的菌株進行ITS-PCR 擴增，所用引物為通用引物ITS1（5'TCCGTAGGTGAACCTGCCG3'）和ITS4（5'TCCT CCGCTTATTGATATGC3'）。PCR 擴增體系為：DNA模板1 μL、2×PCR Master Mix 25 μL、引物ITS1 和ITS4 各1 μL、ddH2O 22 μL。擴增條件為：94 ℃預(yù)熱5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃復(fù)性10 min，擴增產(chǎn)物在4 ℃條件下保存。取5 μL擴增產(chǎn)物與1 μL Loading buffer混勻，加入1%瓊脂糖凝膠孔中，用DNA Marker 作對照，在1×TAE 電泳緩沖液中電泳，以凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR 擴增產(chǎn)物，委托測序公司測序。運用MEGA 11 軟件，使用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時計算遺傳距離。

1.4 哈茨木霉WF2 離體抑菌活性測定

參考田淼等［8］的研究方法，使用無菌打孔器（直徑5 mm）在WF2 菌株和病原真菌的菌落邊緣打取菌餅，用于對峙培養(yǎng)。處理組，將菌株WF2 的菌餅和病原真菌的菌餅分別接種至PDA 平板（直徑90 mm）上，二者之間的距離為45 mm。對照組，只接種病原真菌。28 ℃恒溫避光培養(yǎng)，每組3 次重復(fù)。10 d 時觀察并用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率，計算式如下。

競爭作用測定。使用覆蓋度表示木霉菌株對目標(biāo)病原真菌的寄生能力，參照陳書華等［9］的方法對木霉拮抗系數(shù)進行分級，Ⅰ級：木霉菌菌絲覆蓋率100%；Ⅱ級：木霉菌菌絲覆蓋率≥2/3；Ⅲ級：1/3≤木霉菌絲覆蓋率＜2/3；Ⅳ級：木霉菌菌絲覆蓋率＜1/3；Ⅴ級：病原菌菌絲覆蓋率100%。

1.5 木霉對煙草疫霉的盆栽防效試驗

1.5.1 木霉菌劑的制備 使用無菌打孔器（直徑5 mm）在WF2 菌株的菌落邊緣打取菌餅，在每瓶PDB 培養(yǎng)基中放置1 塊菌餅，于28 ℃、150 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)48 h，獲得WF2 種子液。以10%的接種量將WF2 種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d。將發(fā)酵完成的培養(yǎng)基于45 ℃烘箱烘干水分后，粉碎機打碎成粉劑備用，即得WF2 菌劑。

1.5.2 病原真菌菌懸液的制備 將活化好的煙草疫霉菌餅轉(zhuǎn)接于V8 培養(yǎng)基平板中，光照培養(yǎng)14 d，用無菌水將病原菌菌絲及孢子從平板上洗脫下來，按照李小杰等［10］的方法，放入4 ℃冰箱中處理30 min，再在常溫下放置20 min，促進菌絲釋放孢子，調(diào)節(jié)成1×106CFU/mL 孢子懸浮液備用。

1.5.3 煙草黑脛病防治試驗設(shè)計 將煙草種子（云煙87）播種于裝有基質(zhì)（草炭∶蛭石=3∶1，質(zhì)量比）的育苗缽中［11］，待生長至6 葉期備用。挑選長勢一致的煙苗分為4 個處理組，每處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)15 株煙苗。即CK，清水；T1，WF2 菌劑稀釋150 倍；T2，WF2 菌劑稀釋300 倍；T3，太抗木每靈水分散粒劑稀釋300 倍。采用生防菌菌液灌根處理的方式測定其對煙草黑脛病的防效，處理前先將每株煙苗接種20 mL 菌液。施藥24 h 后，接種煙草疫霉孢子懸浮液5 mL/缽。14 d 后調(diào)查病情指數(shù)與防治效果。

1.5.4 病情指數(shù)與防治效果 煙草黑脛病分級標(biāo)準(zhǔn)參照《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》［12］（GB/T 23222—2008），0 級，全株無??；1 級，莖部病斑不超過莖圍的1/3，或1/3 以下葉片凋萎；3 級，莖部病斑環(huán)繞莖圍1/3～1/2，或1/3～1/2 葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；5 級，莖部病斑超過莖圍的1/2但未全部環(huán)繞莖圍，或1/2～2/3 葉片凋萎；7 級，莖部病斑全部環(huán)繞莖圍，或2/3 以上葉片凋萎；9 級，病株基本枯死。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，在0.05 水平上采用LSD法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗。使用MEGA 11 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌株的形態(tài)學(xué)觀察

菌株在PDA 培養(yǎng)基上生長迅速，培養(yǎng)3 d 時出現(xiàn)白色絮狀菌絲且鋪滿整個平板，之后菌絲逐漸變?yōu)榫G色，培養(yǎng)7 d 時菌絲變?yōu)榘稻G色，無明顯氣味，菌落形態(tài)特征與哈茨木霉菌株基本一致（圖1）。

圖1 菌落的形態(tài)學(xué)觀察

2.2 木霉菌株的分子生物學(xué)鑒定

將WF2 的測序結(jié)果經(jīng)過BLAST 后，ITS 片段與Trichoderma harzianumQT2209（KY225652.1）序列相似度達99.85%。應(yīng)用MEGA 11 軟件與BLAST 比對相近菌株的序列，利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，WF2 與Trichoderma harzianumQT2209（KY225652.1）為同一個分支（圖2）。綜合形態(tài)學(xué)觀察和系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，確定菌株WF2 為哈茨木霉。

圖2 菌株WF2 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 哈茨木霉WF2 離體抑菌活性測定

哈茨木霉WF2 與兩種病原真菌的對峙培養(yǎng)結(jié)果表明，WF2 在PDA 平板上生長迅速，培養(yǎng)3 d 時即對兩種病原真菌產(chǎn)生明顯抑制效果，培養(yǎng)10 d 時，WF2 的菌絲已完全覆蓋在病原真菌的菌絲上，對兩種病原真菌的覆蓋度均為Ⅲ級（圖3、表1）。

表1 木霉菌株WF2 對兩種煙草病原真菌的抑制效果

圖3 哈茨木霉WF2 與兩種病原真菌的對峙培養(yǎng)

通過測量培養(yǎng)10 d 時各處理的菌落直徑，計算出木霉菌株WF2 對兩種煙草病菌的抑制率和覆蓋度。通過表1 可以看出，WF2 對煙草疫霉和尖孢鐮刀菌具有較強的抑制效果。對煙草疫霉的平均抑制率達到86.75%，對尖孢鐮刀菌的平均抑制率達到75.00%。

2.4 木霉對煙草疫霉的盆栽防效試驗

室內(nèi)盆栽結(jié)果表明，與CK 相比，WF2 菌株和商品菌劑太抗木每靈均能顯著降低煙草黑脛病的病情指數(shù)，使用WF2 菌株處理過的煙苗生長情況良好（圖4）。T1 的煙草黑脛病病情指數(shù)僅為12.28%，防效達到80.23%；T2 的煙草黑脛病病情指數(shù)為19.40%，防效達到68.77%；T3 的煙草黑脛病病情指數(shù)僅為6.25%，防效達到89.94%。商品菌劑太抗木每靈防治效果優(yōu)于木霉菌株WF2，但兩者均具有明顯的防治煙草黑脛病的能力（表2）。

表2 木霉菌株WF2 對煙草疫霉的盆栽防治效果（單位：%）

圖4 木霉菌株WF2 對煙草疫霉盆栽防治效果

3 小結(jié)與討論

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于化肥農(nóng)藥的大量使用，導(dǎo)致環(huán)境污染、生態(tài)失衡、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降及農(nóng)殘超標(biāo)等問題日益嚴(yán)重。木霉菌因其應(yīng)用廣泛、防病效果顯著被越來越多地應(yīng)用在生物防治中。木霉對多種植物病原真菌都有防治效果。據(jù)統(tǒng)計，木霉至少對18 個屬29 個種的植物病原真菌有拮抗作用。包括水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）［13］、鐮刀菌屬（Fusariumspp.）［14］、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）［15］、黃曲霉（Aspergillus flavus）［16］、炭疽菌屬（Colletotrichum）［17］等。它能夠通過直接作用機制（真菌寄生、產(chǎn)生裂解酶、抗生物質(zhì)、爭奪空間或養(yǎng)分）或間接作用機制（誘導(dǎo)植物防御）來減少病原體引起的植物疾病。

本研究從湖北省五峰煙田土壤中分離獲得1 株木霉WF2，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子學(xué)（ITS 序列）比對，鑒定為哈茨木霉。通過對峙試驗分析，發(fā)現(xiàn)該菌株對煙草病原菌（煙草疫霉、尖孢鐮刀菌）具有顯著抑制效果。抑制率分別達到86.75%和75.00%，且對兩種病菌的覆蓋度均達到Ⅲ級，寄生效果優(yōu)良，可完全抑制病原真菌的生長。后續(xù)進行了盆栽試驗，發(fā)現(xiàn)該菌株對煙草黑脛病防治效果顯著，其150 倍孢子稀釋液（T1）防治效果達到80.23%，接近商品菌劑太抗木每靈的防治效果。后續(xù)將利用該菌株進行田間病害的相關(guān)研究，進一步驗證該菌株對煙草病害的防治效果。