王飛，李亞楠，張小蕾，胡夢(mèng)妮，李含章，馬駿*

1.武漢市第一醫(yī)院中醫(yī)部，武漢 430022； 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢 430022

帕金森病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多發(fā)于老年人，近年來該疾病趨于年輕化，成為影響中老年人健康的主要疾病之一[1]。深部腦刺激（deep brain stimulation，DBS）手術(shù)可以改善晚期帕金森患者的運(yùn)動(dòng)癥狀和生活質(zhì)量[2]。然而，該手術(shù)僅用于藥物不能充分控制癥狀的患者，大多數(shù)患者術(shù)后仍需服藥。因此，亟需開發(fā)特異性的治療手段、輔助藥物。已知多條通路參與調(diào)控該疾病，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路的激活參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的多個(gè)生理活動(dòng)，如抑制細(xì)胞死亡、緩解細(xì)胞自噬等[3]。該通路可加速神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化，過度激活則會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)傳遞異常，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，引發(fā)阿爾茲海默癥[4]。通過調(diào)控該通路，抑制通路蛋白表達(dá)和激活，可顯著促進(jìn)細(xì)胞自噬反應(yīng)，提升酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）含量，降解多余α-突觸核蛋白（αsynuclein，α-syn），從而保護(hù)神經(jīng)元，緩解帕金森病[5]。針灸作為傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的重要治療手段，可延緩神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，緩解神經(jīng)疼痛，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)疼痛治療，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有良好的治療效果，越來越成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)[6,7]。針灸對(duì)于帕金森病具有良好療效，但作用機(jī)理有待明確[8]。本研究構(gòu)建帕金森大鼠模型，探究電針治療通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路影響帕金森大鼠腦組織的自噬和行為學(xué)反應(yīng)作用機(jī)制，為帕金森病的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 主要試劑與儀器 魚藤酮（貨號(hào)ST80190120）購于詩丹德（上海）標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，西羅莫司（批準(zhǔn)文號(hào)H20130698）購于輝瑞愛爾蘭藥品公司，線粒體提取試劑盒（貨號(hào)MP-007）購于英文特生物技術(shù)有限公司，檸檬酸抗原修復(fù)液（貨號(hào)SJH0712）購于如吉生物（上海）科技有限公司，H2O2（貨號(hào)H112520）購于aladdin 公司，兔抗鼠GAPDH 抗體（貨號(hào)ab9485）、兔抗鼠TH 抗體（貨號(hào)ab137869）、兔抗鼠α-syn 抗體（貨號(hào)ab212184）、兔抗鼠PI3K 抗體（貨號(hào)ab133595）、兔抗鼠AKT 抗體（貨號(hào)ab38449）、兔抗鼠mTOR 抗體（貨 號(hào)ab134903）、兔 抗 鼠p-PI3K 抗 體（貨 號(hào)ab207484）、兔抗鼠p-mTOR 抗體（貨號(hào)ab109268）、兔抗鼠微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）B-II/LC3B-I 抗體（貨號(hào)ab63817）、兔抗鼠Beclin1 抗體（貨號(hào)ab207612）購于Abcam 公司，兔抗鼠p-AKT 抗體（貨號(hào)9271T）購于CST 公司，電針治療儀（6805-A，武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技有限公司），線粒體呼吸檢測(cè)儀（Oxytherm，漢莎科學(xué)儀器有限公司），熒光定量PCR 儀（7500，ABI 公司），凝膠成像系統(tǒng)（CA-268，上海精密儀器儀表有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及建模 由華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購得清潔級(jí)SD 大鼠60 只，6 周齡，體質(zhì)量（200±25）g，SCXK（鄂）2021-0009。麻醉所有大鼠，配置魚藤酮溶液（2 g/L，葵花油溶解）[9]，隨機(jī)選取48 只于頸背部皮下注射魚藤酮溶液1 mL，余12 只作為對(duì)照組注射等劑量葵花油，每日1 次，連續(xù)注射4 周。末次注射12 h 后，觀察大鼠行動(dòng)能力，行動(dòng)偏向一側(cè)、身體持續(xù)震顫、動(dòng)作遲緩且活動(dòng)能力較弱判定為構(gòu)模成功。將帕金森大鼠模型分為帕金森組、電針組、西羅莫司組、電針+PI3K 激活組，每組12 只。電針組、電針+PI3K 激活組大鼠選取穴位“太沖”、“風(fēng)府”進(jìn)行電針治療，選用0.5 寸毫針，針灸深約5 mm，接通正負(fù)極，電流強(qiáng)度1 mA，持續(xù)通電15 min，1 次/日；西羅莫司組大鼠腹腔注射西羅莫司1 mg/kg；電針+PI3K 激活組腹腔注射PI3K 激活劑Recilisib 5 mg/kg；對(duì)照組、帕金森組、電針組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水。持續(xù)處理14 d。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物行為學(xué)評(píng)定 各組大鼠末次治療12 h 后通過斜板實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)定。斜板實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備一塊平整的木板，木板上放置橡膠墊（厚約0.5 cm），依次將大鼠置于橡膠墊中心位置，確保大鼠不抓撓依附木板邊緣，將木板傾斜角緩慢提升至30°，隨后逐漸增大傾斜角，如果大鼠能在木板上停留5 s以上，則再次提升角度，直至大鼠停留時(shí)間短于5 s，記錄此刻的斜板角度，每只大鼠連續(xù)重復(fù)3 次，取平均值作為斜板停留最大角度。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：利用特制的曠場(chǎng)分析箱進(jìn)行試驗(yàn)，箱底部區(qū)域?yàn)闄M五排豎五排的方格，每個(gè)方格大小25 cm×25 cm。將大鼠放置于箱底中央格子中，記錄3 min 內(nèi)大鼠跨越格子數(shù)（3 爪以上跨入即算）和站立次數(shù)（前肢離地1 cm 以上）[10]。

1.2.2 腦組織線粒體活性檢測(cè) 各組隨機(jī)選取6 只大鼠，麻醉后迅速處死，剖開腦部，分離腦組織，勻漿器打磨至勻漿狀態(tài)，按照線粒體提取試劑盒說明書提取線粒體，線粒體呼吸檢測(cè)儀檢測(cè)state3、state4 呼吸速率，計(jì)算線粒體呼吸控制比（mitochondrial respiration controlling rate，RCR），RCR=state3 呼吸速率/state4 呼吸速率×100%。采用熒光素酶標(biāo)記法檢測(cè)ATP 合成酶活性，配置反應(yīng)體系，ADP 激活反應(yīng)，記錄發(fā)光強(qiáng)度，確定ATP 合成量。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)腦黑質(zhì)TH、α-syn 蛋白表達(dá) 各組剩余6 只大鼠麻醉后迅速處死，剝離腦組織分離黑質(zhì)區(qū)，部分切下經(jīng)液氮處理后研磨至粉凍存?zhèn)溆茫糠种糜?%多聚甲醛中固定。固定24 h 后，常規(guī)脫水包埋制作石蠟切片，脫蠟至水，檸檬酸抗原修復(fù)液加熱處理修復(fù)組織抗原，滴加H2O2室溫孵育5 min，PBS清洗3 次，山羊血清封閉液封閉10 min，滴加一抗（TH抗體、α-syn 抗體，1：200），4 ℃孵育過夜，PBS 清洗3次，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育15 min，PBS 清洗3 次，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育15 min，PBS 清洗3 次，滴加DAB 溶液，完全顯色后清水洗凈，蘇木素染色復(fù)染，PBS 清洗直至返藍(lán)，酒精梯度脫水后封片置于顯微鏡下觀察。

1.2.4 Western blot 檢 測(cè) 自 噬 及PI3K/AKT/mTOR 通 路相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化 取出1.2.3 中凍存的腦組織粉末，滴加蛋白裂解液后充分混合，使蛋白充分裂解提取總蛋白，按照試劑盒說明書檢測(cè)提取蛋白質(zhì)量，取定量與上樣緩沖溶液混合加熱變性，加入凝膠孔道中，進(jìn)行電泳跑膠，轉(zhuǎn)膜后脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（GAPDH 抗體、PI3K 抗體、p-PI3K 抗體、AKT 抗體、p-AKT 抗體、mTOR 抗體、p-mTOR 抗體、LC3B 抗體、Beclin1 抗體，1：1000），4 ℃孵育過夜。TBST 清洗3次，加入羊抗兔二抗（1：800），室溫孵育45 min，TBST清洗3 次，將發(fā)光試劑A 液和B 液混合均勻，倒于膜上，靜置1 min 后吸干多余水分，利用光密度掃描系統(tǒng)（Syngene）分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 電針治療對(duì)帕金森大鼠行為學(xué)反應(yīng)影響

斜板停留最大角度、跨格次數(shù)、站立次數(shù)統(tǒng)計(jì)，與對(duì)照組相比，帕金森組大鼠顯著降低（P＜0.05）；與帕金森組相比，電針組、西羅莫司組大鼠顯著升高（P＜0.05）；與電針組相比，電針+PI3K 激活組大鼠顯著降低（P＜0.05）；西羅莫司組與電針組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠斜板停留最大角度（A）、跨格次數(shù)（B）、站立次數(shù)（C）統(tǒng)計(jì)圖* P＜0.05，與對(duì)照組相比 #P＜0.05，與帕金森組相比 ※P＜0.05，與電針組相比n=12Fig.1 Comparison of maximum angle of sloping plate stay (A), times of crossing lattice (B), and times of standing (C) of rats in each group Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Parkinson group, #P＜0.05; Compared with electropuncture group, ※P＜0.05 n=12

2.2 電針治療對(duì)帕金森大鼠腦組織病理學(xué)影響

大鼠腦組織RCR、ATP 合成酶活性、黑質(zhì)內(nèi)TH 平均光密度檢測(cè)，與對(duì)照組相比，帕金森組大鼠顯著降低，α-syn 平均光密度顯著升高（P＜0.05）；與帕金森組相比，電針組、西羅莫司組大鼠顯著升高，α-syn 平均光密度顯著降低（P＜0.05）；與電針組相比，電針+PI3K激活組大鼠顯著降低，α-syn 平均光密度顯著升高（P＜0.05）；西羅莫司組與電針組大鼠相比無顯著差異（P＞0.05），見圖2～3。

圖2 各組大鼠腦組織RCR、ATP 合成酶活性統(tǒng)計(jì)圖* P＜0.05，與對(duì)照組相比 #P＜0.05，與帕金森組相比 ※P＜0.05，與電針組相比n=6Fig.2 Comparison of RCR and ATP synthase activity in brain tissue of rats in each group Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Parkinson group, #P＜0.05; Compared with electropuncture group, ※P＜0.05 n=6

圖3 各組大鼠黑質(zhì)TH、α-syn 表達(dá)A：TH 免疫組化染色結(jié)果B：TH 平均光密度統(tǒng)計(jì)圖C：α-syn 免疫組化染色結(jié)果D：α-syn 平均光密度統(tǒng)計(jì)圖*P＜0.05，與對(duì)照組相比 #P＜0.05，與帕金森組相比 ※P＜0.05，與電針組相比n=6Fig.3 Expression of TH and α-syn in substantia nigra of rats in each group A: Results of TH immunohistochemical staining; B: Statistical diagram of TH average optical density value; C: Results of α-syn immunohistochemical staining; D: Statistical diagram of average optical density values of α-syn Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Parkinson group, #P＜0.05; Compared with electropuncture group, ※P＜0.05 n=6

2.3 電針治療對(duì)帕金森大鼠腦組織自噬反應(yīng)影響

大鼠腦組織Beclin1 蛋白表達(dá)量、LC3B-II/LC3B-I檢測(cè)，與對(duì)照組相比，帕金森組大鼠顯著升高（P＜0.05）；與帕金森組相比，電針組、西羅莫司組大鼠顯著升高（P＜0.05）；與電針組相比，電針+PI3K 激活組大鼠顯著降低（P＜0.05）；西羅莫司組與電針組大鼠相比無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠腦組織LC3B-I、LC3B-II、Beclin1 蛋白表達(dá)量*P＜0.05，與對(duì)照組相比 #P＜0.05，與帕金森組相比 ※P＜0.05，與電針組相比n=6Fig.4 Protein expressions of LC3B-I, LC3B-II and Beclin1 in brain tissue of rats in each group Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Parkinson group, #P＜0.05; Compared with electropuncture group, ※P＜0.05 n=6

2.4 電針治療對(duì)帕金森大鼠腦組織PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白磷酸化影響

大鼠腦組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 值檢測(cè)，與對(duì)照組相比，帕金森組大鼠顯著升高（P＜0.05）；與帕金森組相比，電針組、西羅莫司組大鼠顯著降低（P＜0.05）；與電針組相比，電針+PI3K 激活組大鼠顯著升高（P＜0.05）；西羅莫司組與電針組大鼠相比無顯著差異（P＞0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白表達(dá)量*P＜0.05，與對(duì)照組相比 #P＜0.05，與帕金森組相比 ※P＜0.05，與電針組相比n=6Fig.5 Protein expressions of PI3K,AKT, mTOR, p-PI3K, p-AKT and p-mTOR in brain tissue of rats in each group Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Parkinson group, #P＜0.05; Compared with electropuncture group, ※P＜0.05 n=6

3 討論

帕金森病的發(fā)作受遺傳和多種環(huán)境因素影響，患者腦組織內(nèi)線粒體代謝異常，細(xì)胞自噬不足，導(dǎo)致αsyn 大量積累，破壞神經(jīng)功能，使患者產(chǎn)生強(qiáng)烈的震顫，造成肌強(qiáng)直，嚴(yán)重者肢體扭曲，生活不能自理[11]。了解帕金森病的發(fā)展機(jī)制、尋找有效的治療措施至關(guān)重要。檢測(cè)行為學(xué)功能是評(píng)估該病的重要指標(biāo)。本研究應(yīng)用斜板實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證大鼠模型構(gòu)建成功，帕金森大鼠產(chǎn)生行為學(xué)障礙，斜板停留最大角度、跨格次數(shù)、站立次數(shù)顯著降低，具有帕金森病的典型癥狀[12]。

電針治療為常見中醫(yī)藥治療手段，在緩解疼痛方面具有良好的療效，專家推測(cè)其對(duì)于帕金森病具有一定的治療效果[13]。研究發(fā)現(xiàn)，電針治療可緩解帕金森大鼠的神經(jīng)功能障礙，改善大鼠的認(rèn)知功能[14]。藥物配合電針治療被臨床驗(yàn)證具有良好的效果[15]。但電針治療的作用機(jī)理有待進(jìn)一步明確。本研究選用對(duì)于帕金森具有良好緩解效果的西羅莫司作為陽性對(duì)照[16]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針治療和西羅莫司處理后，大鼠的斜板停留最大角度、跨格次數(shù)、站立次數(shù)顯著升高，表明電針治療后帕金森大鼠的行為學(xué)功能得到改善，但作用途徑有待明確。

帕金森是由腦組織線粒體活性異常，引發(fā)ATP 合成受阻，自噬活性降低，TH 含量減低，造成α-syn 蛋白沉積，導(dǎo)致神經(jīng)元受損[17]。通過該途徑相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，帕金森大鼠腦組織內(nèi)RCR、ATP 合成酶活性、TH含量顯著降低，α-syn、Beclin1 蛋白表達(dá)量、LC3B-II/LC3B-I 顯著升高，與既往研究一致。電針治療和西羅莫司處理后，RCR、ATP 合成酶活性、TH 含量、Beclin1 蛋白表達(dá)量、LC3B-II/LC3B-I 顯著升高，α-syn蛋白表達(dá)量顯著降低，表明電針治療可顯著改善腦組織線粒體活性，激活自噬，提高TH 表達(dá)，加速降解αsyn，從而緩解帕金森，但作用機(jī)理有待進(jìn)一步明確。

PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路激活可加速細(xì)胞因子生長(zhǎng)，抑制自噬，是常見的自噬調(diào)控通路。川芎嗪可通過抑制該通路相關(guān)蛋白激活，從而加速自噬，緩解糖尿病大鼠的腎損傷[18]。PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路在帕金森病中同樣發(fā)揮作用。姜黃素可通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路，激活自噬的同時(shí)改善帕金森病[19]。研究發(fā)現(xiàn)，電針治療可抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白激活，緩解骨骼肌萎縮大鼠的神經(jīng)損傷[20]，推測(cè)電針治療影響帕金森大鼠病情與調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，帕金森組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化程度顯著升高，電針治療和西羅莫司處理后，大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化程度顯著降低，證實(shí)電針治療很可能通過調(diào)控PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化影響帕金森病情。為進(jìn)一步驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)在電針治療的同時(shí)激活PI3K，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化程度顯著升高，同時(shí)大鼠腦組織內(nèi)RCR、ATP 合成酶活性、TH 含量、Beclin1 蛋白表達(dá)量、LC3B-II/LC3B-I 顯著降低，α-syn 蛋白表達(dá)量顯著升高，斜板停留最大角度、跨格次數(shù)、站立次數(shù)顯著降低，進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)假設(shè)。

綜上所述，電針治療可通過抑制PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化，增強(qiáng)線粒體活性，增加TH 含量，激活腦組織自噬，緩解α-syn 蛋白沉積，從而改善帕金森大鼠運(yùn)動(dòng)行為功能。但電針治療是否通過其他通路間接參與調(diào)控帕金森病，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以明確。