李 顯，石 艷，李 軍，李常挺，譚奕舟，譚文寶，彭 昊*

（1.廣西壯族自治區(qū)百朋種畜場545102；2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院530004；3.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室 530001；4.大化瑤族自治縣七百弄雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心530800）

產(chǎn)氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共患致病菌，是中國疾病預(yù)防控制中心列出的五種常見食源性感染或中毒的病原體之一[1]，其具有芽孢，屬于革蘭氏陽性桿菌。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌能產(chǎn)生許多細胞外的強效蛋白質(zhì)毒素，引起許多不同的組織毒性和人類及動物的腸道毒性疾病?；谒鼈兛僧a(chǎn)生四種類型毒素組合的能力-α 毒素、β 毒素、ε 毒素及ι 毒素，將產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株分為A、B、C、D、E 五個血清型。最近根據(jù)新型毒素分型系統(tǒng)又分為F(cpe）型和G(net B）型。產(chǎn)氣莢膜梭菌F 型的菌株作為攜帶α 毒素基因和cpe基因并在孢子形成時產(chǎn)生cpe 的分離株，不攜帶β 毒素、ε 毒素或ι-毒素。而產(chǎn)氣莢膜梭菌G 型的菌株則被定義作為產(chǎn)生α 毒素和net B 毒素但不產(chǎn)生β 毒素、ε毒素或ι-毒素[2]。這些菌株已被證明是人類食物中毒和非食源性產(chǎn)氣莢膜梭菌介導(dǎo)的腹瀉的罪魁禍首，包括一些抗生素相關(guān)性腹瀉[2]。值得關(guān)注的是產(chǎn)氣莢膜A 型菌株的定義已發(fā)生變化，現(xiàn)在被定義為產(chǎn)生α 毒素，但不產(chǎn)生β 毒素，ε 毒素，ι-毒素，cpe 或netB[3]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌介導(dǎo)的腹瀉，包括一些抗生素相關(guān)性腹瀉可廣泛存在于人類和動物腸道以及食物、河流和土壤等多種自然環(huán)境中[4]。作為一種常見的條件性致病菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌能引起大多數(shù)哺乳動物胃腸道感染，產(chǎn)生腸毒血癥，還可以引起皮膚和軟組織氣性壞疽或惡性水腫。產(chǎn)氣莢膜梭菌的血清型不同，其感染引發(fā)的傳染性疾病也不同，如羊腸毒血癥、羊快役及羔羊痢疾，無論哪一種疾病都具有極高的致死率。不僅如此，還會導(dǎo)致屠宰加工環(huán)節(jié)的污染，增加人類食物中毒和消化道疾病的風(fēng)險[5]。腸毒血癥是由產(chǎn)氣莢膜梭菌當中的某些特定血清型的細菌感染引發(fā)的一種急性腸道疾病，傳播速度較快，大多以暴發(fā)病為主。從易感群體來講，任何年齡品種的羊群都可能受到病原的入侵，尤其是采食欲望較為旺盛、膘情較好的青壯年羊群更容易感染，6 月齡至2 歲的羊是腸毒血癥暴發(fā)流行的高峰期。該疾病的發(fā)生具有一定的條件性和季節(jié)性。羊腸毒血癥是一種急性致死性的細菌傳染性疾病，其潛伏周期相對較短。大多數(shù)羊群在受到病原入侵之后，短時間內(nèi)會出現(xiàn)典型的臨床癥狀，倒地不起，全身痙攣，持續(xù)數(shù)分鐘之后就會死亡。某些抵抗能力較強的羊群受到病原入侵之后，發(fā)病相對較為緩慢，主要表現(xiàn)為行動遲緩，離群獨居，單獨站立或者臥地不起，結(jié)膜蒼白，失去光澤，精神狀態(tài)差?；疾⊙虿粩嗄パ?、空嚼、角弓反張，同時伴隨嚴重的腹痛腫脹癥狀，排出的糞便呈現(xiàn)黑褐色或者黃褐色，部分患病羊排出的糞便當中會夾雜有大量的新鮮血液，但患病羊的體溫不會出現(xiàn)升高的現(xiàn)象。急性發(fā)病的患病羊從出現(xiàn)癥狀到死亡一般小于3 h，病情緩慢的羊群從發(fā)病到死亡能夠持續(xù)3 d 左右[6]。羊腸毒血癥是由D 型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的病羊腹瀉，胃腸功能紊亂，甚至死亡的一種急性致死性傳染病，患病羊死亡后剖解可見其腎組織軟化，故又稱軟腎病[7]。該病多在春、夏兩季發(fā)生，呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性，可能與春夏兩季氣溫多變，雨水較多，有利于該菌的繁殖，更多的飲水和多汁綠葉受到污染有關(guān)。此外，該病在英國、印度等國家均有發(fā)生，在我國東北和內(nèi)蒙古地區(qū)常有該病的流行。給養(yǎng)羊業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失。通過對南寧市隆安縣某黑山羊養(yǎng)殖場病羊的發(fā)病情況以及從該病病原、臨床癥狀、實驗室檢驗等方面進行分析，確診后提出了合理的疫病防控措施?，F(xiàn)報告如下，供同行們參考。

1 發(fā)病情況

2022 年8 月份，南寧市隆安縣某黑山羊養(yǎng)殖場有羊只發(fā)病，該場存欄200 多只。據(jù)畜主反映，該場近期才開始由圈養(yǎng)改為放牧模式，夏季雨水較多，羊群到附近山上放牧采食，牧草水分含量較大，回來后晚上只補充精料而沒有飼喂干草等粗飼料。病羊主要是5～6 月齡羊只，累計發(fā)病10 余只，死亡2 只。剖解病羊并采集其病變組織做實驗室檢查。

2 臨床癥狀及病理變化

突然發(fā)病，健壯或者膘情好的羊只先發(fā)病，病羊步態(tài)不穩(wěn)，流涎，腹瀉并有黑色稀糞，體溫不高，病程短促、有的病羊數(shù)小時后死亡。解剖病羊發(fā)現(xiàn)，心包液體增多，心肌出血，肺臟充血，小腸黏膜充血、出血，腸壁呈血紅色，腎臟腫大，腎實質(zhì)松軟，泥狀，擠壓碎爛，肝臟、膽囊腫大，淋巴結(jié)腫大出血。

3 實驗室診斷

3.1 分離培養(yǎng)

無菌操作下，用接種環(huán)在肝、腸道等病變組織接種于血瓊脂平板上進行“Z”字形劃線，采用焦性沒食子酸厭氧方法培養(yǎng)18 h[8]。取干凈的載玻片，表面用點燃的酒精棉進行擦拭消毒，再用血平板上的菌落進行革蘭氏染色鏡檢。革蘭氏染色結(jié)果為：革蘭氏陽性，兩端鈍圓，粗大桿菌，無鞭毛。挑取單個菌落接種厭氣肉肝湯進行液體擴大培養(yǎng)。

3.2 生化鑒定

用無菌移液器吸取培養(yǎng)的分離菌液接種于石蕊牛奶試劑溶液，置于37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在石蕊牛奶培養(yǎng)基中呈現(xiàn)“爆乳發(fā)酵”現(xiàn)象。生化試驗結(jié)果表明，分離菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化特性一致。通過分離株的鏡檢結(jié)果結(jié)合生化鑒定的“爆乳發(fā)酵”現(xiàn)象，初步診斷該病是由產(chǎn)氣莢膜梭菌侵入羊只體內(nèi)所致。

3.3 16S rDNA 測序及序列分析

取分離菌液，利用16S rDNA 通用引物進行分離菌的PCR 擴增。PCR 擴增體系(總體積為50 μL)：2× ES Tap Master Mix 25 μL，模板DNA4 μL，上下游引物各2μL，ddH2O 17 μL。PCR 擴增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并對有條帶的PCR 產(chǎn)物進行測序。結(jié)果顯示擴增出約1428 bp 的片段，與目的條帶大小一致。將所得序列與BLAST 上比對，發(fā)現(xiàn)與NCBI 上參考菌株的產(chǎn)氣莢膜梭菌相似度在97%以上。

綜上，根據(jù)羊只的發(fā)病情況、臨床癥狀、病理變化、分離株的分離培養(yǎng)、鏡檢、生化試驗及16S rDNA 測序方法，最終診斷該病是由產(chǎn)氣莢膜梭菌D 型感染所致的羊腸毒血癥。

4 治療和預(yù)防措施

4.1 治療措施

羊腸毒血癥發(fā)病速度快，發(fā)病周期短，為了提高治愈成功率，應(yīng)該大劑量地使用磺胺類藥物進行針對性的治療。首先給患病羊灌服10%生石灰水以加速毒素的中和及盲腸糞便轉(zhuǎn)化從而最大化的減少毒素在機體內(nèi)的擴散。成年羊200 mL/次，幼齡羊80 mL/次，均連續(xù)使用2～3 次。此外，急性病例羊群已無治療意義，但其他患病羊可以灌服大劑量的磺胺脒?；疾⊙蛎恐还喾前冯?～12 g，第一天1 次灌服，第二天分2 次灌服；內(nèi)服硫酸鎂從而排除病羊胃腸道內(nèi)的有毒物質(zhì)；肌肉注射青霉素，每只羊3 支160 萬IU 青霉素，2 次/d，連用3 d。對于病程較長的患病羊注射產(chǎn)氣莢膜梭菌的血清，進行毒素中和，并選擇使用20%安鈉咖注射液10 mL，5%葡萄糖生理鹽水注射液500 mL 靜脈注射，強化補液。此外，為了防止病情進一步擴散，采取隔離病羊，單獨飼養(yǎng)措施。增加羊群的運動量。通知該場使羊群盡量避免群體接觸，并用消毒威等消毒藥（成分為二氯異氰脲酸鈉1∶300 倍稀釋）對所有羊舍、場地進行全面消毒，每天2 次，連續(xù)7 d。此外，對該場所有健康羊群使用羊快疫、猝狙、腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗或羊快疫、猝疽、羔羊痢疾、腸毒血癥四聯(lián)干粉滅活疫苗（吉林正業(yè)生物制品股份公司）進行預(yù)防接種，肌肉或皮下注射，用20%氫氧化鋁膠生理鹽水溶液溶解，每只羊注射1 mL。

4.2 預(yù)防措施

4.2.1 加強飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)環(huán)境的好壞與羊腸毒血癥的發(fā)病率有直接聯(lián)系，潮濕污濁的環(huán)境也會引發(fā)該病。加之，該病發(fā)病急，無足夠的時間救治。因此，注重日常預(yù)防措施、加強飼養(yǎng)管理是防控該病的重要措施。對于圈養(yǎng)養(yǎng)殖模式，必須加強羊場的環(huán)境衛(wèi)生管理，改善飼養(yǎng)環(huán)境，杜絕環(huán)境受到該菌的污染，防止飼料和飲水受到污染，保證舍內(nèi)環(huán)境溫濕度適宜，羊舍夏天要注意降溫，及時消滅蚊蠅，保證圈舍的清潔衛(wèi)生，注意飼養(yǎng)密度，防止病原微生物的滋生。其次，定期做好日常消毒工作，尤其是受到污染的羊舍要徹底清洗消毒。一周消毒2 次，場內(nèi)一月消毒1 次，消毒過程中切記交替使用消毒液；針對水源及飲水槽等進行消毒，避免水源污染，同時，定期對羊只的飲用水進行細菌學(xué)檢測，觀察是否存在水質(zhì)超標。再次，注意飼料營養(yǎng)均衡，杜絕突然更換飼料造成應(yīng)激，根據(jù)天氣情況，提前做好通風(fēng)和保溫工作，避免溫差過大。對于放牧飼養(yǎng)模式，應(yīng)注意要選擇地勢高的草地，防止羊群接觸可能含產(chǎn)氣莢膜梭菌的飼草、飲水和土壤，從而切斷羊群與傳染源的接觸機會，降低疾病發(fā)生概率。

4.2.2 免疫接種

鑒于產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛存在于自然界，其具有極強的傳染力，感染此病有發(fā)病急、病程短、高死亡率等特點，發(fā)病之后會在很大程度上影響到羊群的正常生長和生存。因此控制和預(yù)防羊腸毒血癥的最佳措施是給羊群接種含有D 型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素的疫苗。每年各給羊群預(yù)防接種2 次，于春秋兩季進行，可以有效預(yù)防該病的發(fā)生。我國目前預(yù)防該病的常用疫苗主要為羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥四聯(lián)干粉滅活疫苗及羊快疫、猝狙、腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗。此外，規(guī)模化養(yǎng)羊場的疫病監(jiān)控工作是預(yù)防該病的重要措施，需要加強其監(jiān)控工作，根據(jù)本地區(qū)和周邊地區(qū)的疫情，結(jié)合羊群抗體水平及抗體消長規(guī)律，建立適合的科學(xué)免疫制度，是預(yù)防該病的重要措施之一。

5 結(jié)語

產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)病一般呈急性經(jīng)過，而且傳染性較強，留給治療的時間比較短，給養(yǎng)殖戶帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。羊腸毒血癥是一類腸道消化道疾病，是羊群的常見疫病之一，其病原菌為D 型產(chǎn)氣莢膜梭菌，該菌在羊腸道內(nèi)大量繁殖，并產(chǎn)生毒素引起病羊腹瀉，胃腸功能紊亂，毒素中毒，甚至死亡。該病在養(yǎng)殖場發(fā)生流行率較高，具有發(fā)病急、病程短、死亡率高、傳染性強等特點，若防治措施不當，一旦出現(xiàn)羊只發(fā)病就會造成疾病的迅速蔓延，導(dǎo)致羊群大批死亡，給養(yǎng)羊戶造成嚴重的經(jīng)濟損失。此病主要以預(yù)防為主，治療為輔。因此，要制定科學(xué)的飼養(yǎng)管理制度，日常管理期間做好預(yù)防，加強羊只免疫接種，使羊群的抗體水平達標，有效防御產(chǎn)氣莢膜梭菌的入侵。本次診斷提出了相應(yīng)的治療及預(yù)防措施，希望對降低該種疾病的發(fā)生流行概率，保證養(yǎng)殖戶羊群的安全有一定作用。此外，羊群的飼養(yǎng)管理尤為重要，應(yīng)飼喂配比合理的飼料，避免突然換料或者改變飼養(yǎng)條件，飼料改變要逐步過渡，定期進行消毒，做好免疫接種工作，降低此病的發(fā)病率，促進養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。