徐海，李秀坤,2，蘆佳浩，姜愷，馬玥，徐正進(jìn)，徐銓

秈型血緣滲入對北方粳稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

徐海1，李秀坤1,2，蘆佳浩1，姜愷1，馬玥1，徐正進(jìn)1，徐銓1

1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，沈陽 110866；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/華北作物改良與調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000

【目的】分析秈型血緣滲入對粳稻品種產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，為優(yōu)化秈型血緣利用的北方粳稻育種方案提供理論基礎(chǔ)和基因組資源?！痉椒ā恳远i粳交重組自交系（RIL）及從黑龍江省、遼寧省、山東省和江蘇省收集的74份不同年代粳稻主栽品種為試材，結(jié)合基于Illumina HiSeq2500平臺的全基因組高通量測序和多地表型調(diào)查，分析秈型血緣對北方粳稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，并使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對秈型血緣滲入所引入的不利基因進(jìn)行基因敲除。【結(jié)果】分析RIL發(fā)現(xiàn)秈型血緣與穗長、粒長呈顯著正相關(guān)，與碾磨品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，其中，與整精米率達(dá)到顯著水平。秈型血緣在江蘇省與直鏈淀粉含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與粗蛋白含量呈顯著正相關(guān)。秈型頻率與粒形的相關(guān)性隨著緯度的增加而增強(qiáng)，而與穗長和整精米率的相關(guān)性隨著緯度的增加而減弱。通過調(diào)查粳稻主要稻區(qū)不同年代主栽品種，發(fā)現(xiàn)秈型血緣滲入位置和比例并不是均勻分布在12條染色體上，在第1、10、11和12染色體上，秈型血緣分布較多。江蘇省和遼寧省主栽品種的秈型血緣顯著高于黑龍江省和山東省，而且2000年后育成的品種秈型血緣顯著高于2000年之前的品種。各粳稻區(qū)不同年代主栽品種秈型血緣滲入顯著增加了每穗粒數(shù)，秈型血緣滲入?yún)^(qū)域中包含多個(gè)抗性和育性相關(guān)基因。在鹽豐47的第5染色體上有一段秈型血緣滲入片段，包含秈型粒型調(diào)控基因和秈型堊白調(diào)控基因，增加了鹽豐47的千粒重，但影響了其堊白性狀。應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除鹽豐47的，純合基因編輯植株的粒形與鹽豐47相似，其堊白性狀得到了顯著改善。【結(jié)論】秈型血緣滲入主要通過增加每穗粒數(shù)增加粳稻產(chǎn)量潛力，但對碾磨品質(zhì)有負(fù)面影響。通過全基因組高通量測序挖掘品種不良等位基因，結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯打破秈粳雜交育種中的遺傳累贅是一種高效的育種輔助手段，可以針對目標(biāo)性狀進(jìn)行快速準(zhǔn)確的改良。

水稻；粳稻育種；秈型血緣滲入；產(chǎn)量；品質(zhì)；分子設(shè)計(jì)育種

0 引言

【研究意義】秈粳稻雜交育種是中國特別是北方粳型超級稻育種的總體技術(shù)路線，分析秈型血緣滲入在粳稻育種中的作用，可以最大限度地避開亞種間雜交產(chǎn)生的負(fù)面影響，將為進(jìn)一步聚合亞種間優(yōu)勢性狀、擴(kuò)寬粳型栽培稻的遺傳多樣性、在更高水平上平衡粳稻產(chǎn)量和品質(zhì)及突破粳稻育種瓶頸提供理論基礎(chǔ)和種質(zhì)資源。【前人研究進(jìn)展】水稻是世界重要糧食作物，為全球約一半人口提供主食，其中90%以上集中在亞洲。亞洲栽培稻分為秈（Xian，XI）和粳（Geng，GJ）2個(gè)亞種，在長期自然選擇和人工選擇過程中，秈粳稻基因組不斷分化，生態(tài)適應(yīng)性等生物學(xué)特性產(chǎn)生顯著差異，農(nóng)藝性狀各有利弊[1-4]。秈稻約占亞洲栽培稻的90%，廣泛分布在印度、中國、東南亞，粳稻主要在中國、日本、韓國等國家種植[5]。我國秈粳并重，其中2/3為秈稻，主要在緯度和海拔較低地區(qū)種植，粳稻主要在緯度和海拔較高地區(qū)種植，中部地區(qū)秈粳交錯。我國是世界上唯一同時(shí)大面積種植秈稻和粳稻的國家，促使相關(guān)遺傳基礎(chǔ)研究成為得天獨(dú)厚且成果卓著的優(yōu)勢研究領(lǐng)域[6-8]。早在1959年楊守仁先生率先提出秈粳稻雜交育種新思路[9]，在此基礎(chǔ)上，陳溫福院士團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了理想株型與綜合秈粳亞種有利性狀相結(jié)合的育種理論體系，成為我國北方粳型超級稻育種的總體技術(shù)路線[10]。通過對20世紀(jì)80年代以來我國北方稻區(qū)推廣的優(yōu)良品種進(jìn)行系譜分析，發(fā)現(xiàn)其中絕大部分都是由秈粳稻雜交所育成。秈粳雜交所引入的秈型血緣顯著增加了我國粳稻產(chǎn)量潛力，但是這些品種一般不是直接通過秈稻與粳稻品種雜交，而是以秈粳交育成品種（系）或衍生后代雜交育成，由于親本繁多，系譜和育種過程復(fù)雜，育種家并不清楚究竟利用了另一亞種的哪些優(yōu)異基因?？傊?，隨著秈型血緣的引入，北方粳稻的品質(zhì)有所下降，但是課題組前期發(fā)現(xiàn)一些秈型血緣較高的粳型超級稻品種，不但產(chǎn)量潛力顯著高于傳統(tǒng)日本粳稻品種，外觀品質(zhì)和加工品質(zhì)也毫不遜色，只是食味值與傳統(tǒng)日本粳稻品種相比還有待提高[11]【本研究切入點(diǎn)】秈型血緣的引入在提高產(chǎn)量潛力的同時(shí)是否對品質(zhì)性狀有直接負(fù)面影響，迄今研究還不能圓滿回答這個(gè)問題，相關(guān)基因組層面研究滯后是限制秈粳稻雜交育種效率的主要瓶頸?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究圍繞秈型血緣在粳稻育種中的作用這一關(guān)鍵科學(xué)問題，對秈粳交重組自交系和我國不同年代育成粳稻品種進(jìn)行全基因組測序，明確秈型血緣對我國粳稻重要農(nóng)藝性狀的影響，為通過秈粳雜交聚合亞種有利基因?qū)崿F(xiàn)精準(zhǔn)育種提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以秈型恢復(fù)系材料瀘恢99（R99）和粳型超級稻品種沈農(nóng)265（SN265）雜交后自交10代，隨機(jī)選取151個(gè)株系構(gòu)建秈粳交重組自交系（recombinant inbred lines，RIL）。于2021年將試驗(yàn)材料分別種植于廣東?。℅D）中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所試驗(yàn)田（22°N，114°E）、江蘇?。↗S）淮安市盱眙縣古桑鄉(xiāng)原種場試驗(yàn)田（32°N，120°E）、四川省（SC）農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所試驗(yàn)基地（32°N，104°E）和遼寧?。↙N）沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所試驗(yàn)田（41°N，123°E）。試驗(yàn)選擇完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，田間種植3次生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)株系種植4行，每行10株，行株距為30.0 cm×15.0 cm，單苗移植，4個(gè)生態(tài)環(huán)境下均在植株抽穗后45 d進(jìn)行收獲。

試驗(yàn)進(jìn)行大范圍的粳稻品種收集，其中，包括黑龍江省（HLJ）、遼寧?。↙N）、山東省（SD）、江蘇?。↗S）不同年代的74份粳稻主栽品種，品種按育成年代可分為1980年之前育成、1980—1990年育成、1990—2000年育成和2000年后育成4個(gè)時(shí)間段。于2021年將74份主栽品種分別種植于江蘇省（JS）淮安市盱眙縣古桑鄉(xiāng)原種場試驗(yàn)田（32°N，120°E）、山東?。⊿D）青島農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗(yàn)田（37°N，119°E）、遼寧?。↙N）沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所試驗(yàn)田（41°N，123°E）、黑龍江?。℉LJ）農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所（45°N，126°E），4個(gè)試驗(yàn)地點(diǎn)基本包含了主要粳稻種植區(qū)的緯度跨度，種植方式與RIL相同。

1.2 產(chǎn)量和品質(zhì)性狀調(diào)查

植株抽穗后45 d，在各小區(qū)中部隨機(jī)選取長勢中等的5株調(diào)查有效穗數(shù)和株高，取長勢均勻的10穗調(diào)查每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重。稻谷在收獲曬干后存放3個(gè)月，待理化特性穩(wěn)定后進(jìn)行品質(zhì)測定。檢測指標(biāo)有糙米率、精米率、整精米率、堊白度、堊白粒率、蛋白質(zhì)含量、膠稠度、堿消值、直鏈淀粉含量和蛋白含量，具體測定方法參照Li等[12]。

使用Microsoft Excel 2016整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析和顯著性分析，LSD（＜0.05）方法用于檢驗(yàn)品種間差異的顯著性，并用Graphpad 8.0進(jìn)行作圖。

1.3 高通量測序

在人工氣候箱中播種SN265、R99和151個(gè)RIL，以及74份主栽品種。播種四周后取嫩葉，采用CTAB法提取基因組DNA，用于構(gòu)建文庫，隨后在Illumina HiSeq2500平臺進(jìn)行全基因組高通量測序。經(jīng)過質(zhì)量控制和過濾后，R99和SN265分別得到13.04和13.38 Gb的Clean data；151個(gè)子代共得到414.37 Gb的Clean data，平均每個(gè)材料2.74 Gb的Clean data。74份主栽品種共獲得約1 638.72 Gb的Clean data，Q30平均達(dá)到92.51%。SN265和R99的測序深度分別為30×和32×；子代的平均測序深度為6.25×。利用SOAP2軟件將序列與參考基因組日本晴（Nipponbare，http:// rapdb.dna.affrc.go.jp/download/irgsp1.html/）進(jìn)行比對，利用GATK軟件進(jìn)行SNP檢測，共得到1 456 445個(gè)SNP。74份主栽品種的平均測序深度為53.34×，篩選后得到11 952 151個(gè)SNP。

1.4 秈型血緣計(jì)算

秈粳特異性SNP數(shù)據(jù)來自517份水稻種質(zhì)資源的測序結(jié)果[2]，將517份水稻種質(zhì)資源中粳型種質(zhì)資源基因型一致，且秈型種質(zhì)資源為另一種基因型的SNP定義為秈粳特異SNP，共得到100 528個(gè)秈粳特異SNP，其中，第1染色體有15 961個(gè)；第2染色體有23 282個(gè)；第3染色體有12 450個(gè)；第4染色體有3 637個(gè)；第5染色體有5 333個(gè)；第6染色體有4 741個(gè)；第7染色體有4 107個(gè)；第8染色體有7 347個(gè)；第9染色體有8 443個(gè)；第10染色體有7 701個(gè)；第11染色體有3 944個(gè)；第12染色體有3 582個(gè)。RIL和主栽品種中秈型SNP數(shù)值與全部秈粳特異SNP的比值定義為秈型血緣滲入比例。

1.5 CRISPR/Cas9基因編輯

以鹽豐47為遺傳背景材料進(jìn)行CRISPR基因編輯。使用華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉耀光院士團(tuán)隊(duì)開發(fā)的基因編輯工具包CRISPR-GE（http://skl.scau.edu.cn/）進(jìn)行靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，應(yīng)用BLAST比對日本晴參考基因組確認(rèn)靶點(diǎn)的特異性（https://rapdb.dna.affrc.go.jp/tools/ blast）。基因編輯靶點(diǎn)序列和引物合成，以及測序服務(wù)均由華大基因完成。參照Li等[12]方法進(jìn)行基因編輯載體構(gòu)建及基因編輯植株的遺傳轉(zhuǎn)化和篩選。

2 結(jié)果

2.1 RIL群體的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀

將SN265和R99雜交構(gòu)建的RIL群體分別種植于遼寧?。↙N）、四川省（SC）、江蘇?。↗S）和廣東?。℅D），并對主要產(chǎn)量和品質(zhì)性狀展開調(diào)查。結(jié)果顯示，JS和LN的穗數(shù)顯著高于SC和GD（圖1-a），SC和JS的每穗粒數(shù)顯著高于LN和GD（圖1-b），千粒重在4個(gè)地區(qū)沒有顯著差異（圖1-c），LN和SC的結(jié)實(shí)率顯著高于JS和GD（圖1-d）。SC和JS的穗長顯著長于LN和GD（圖1-e），著粒密度為SC＞JS＞LN＞GD，且地區(qū)間差異均達(dá)到顯著水平（圖1-f），SC和JS的株高顯著高于LN和GD（圖1-g），抽穗期在4個(gè)地區(qū)間差異顯著，依次為LN＞SC＞JS＞GD（圖1-h）。RIL在SC展現(xiàn)出較好的碾磨品質(zhì)，其糙米率、精米率和整精米率都顯著高于其他3個(gè)地區(qū)（圖1-i—k）。RIL的外觀品質(zhì)在4個(gè)地區(qū)展現(xiàn)出較大差異，LN堊白粒率顯著高于其他3個(gè)地區(qū)（圖1-i），LN和SC的堊白度顯著高于JS（圖1-m）。粒形一度被認(rèn)為主要受遺傳因素調(diào)控，受環(huán)境因素影響較小，發(fā)現(xiàn)RIL的粒形在不同地區(qū)也體現(xiàn)出顯著性差異，JS和GD的籽粒顯著長于LN和SC（圖1-n），其中，LN和SC的粒寬顯著大于JS和GD（圖1-o），而GD的粒長顯著長于其他3個(gè)地區(qū)（圖1-p）。進(jìn)一步調(diào)查RIL在各地區(qū)的食味相關(guān)品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)LN和GD的堿消值顯著高于SC和JS（圖1-q）。LN、SC和GD之間膠稠度沒有顯著性差異，均顯著高于JS（圖1-r），LN的直鏈淀粉含量顯著高于SC和JS，SC和JS顯著高于GD（圖1-s）。粗蛋白含量展現(xiàn)出隨著維度降低而增加的趨勢，且4個(gè)地區(qū)間差異均達(dá)到顯著水平（圖1-t）。

LN：遼寧??；SC：四川省；JS：江蘇省；GD：廣東省。不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著。下同

2.2 RIL群體中秈型血緣對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

利用高通量測序數(shù)據(jù)和秈粳特異SNP確定了每個(gè)RIL自交系的秈型血緣比例，結(jié)果顯示，RIL群體的秈型血緣比例呈正態(tài)分布（圖2-a），說明RIL的構(gòu)建理想，滿足后續(xù)試驗(yàn)分析需求。分別在4個(gè)地區(qū)對秈型血緣與重要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，秈型血緣在4個(gè)地區(qū)都與穗長呈正相關(guān)，在LN、JS和GD達(dá)到顯著水平，秈型血緣與每穗粒數(shù)為正相關(guān)，其中，在SC、LN和JS達(dá)到顯著水平。秈型血緣與結(jié)實(shí)率和著粒密度呈正相關(guān)，與千粒重和穗數(shù)呈負(fù)相關(guān)，4個(gè)地區(qū)均未達(dá)到顯著水平。秈型血緣與理論產(chǎn)量呈正相關(guān)，在GD達(dá)到顯著水平。秈型血緣與株高呈負(fù)相關(guān)，其中，在SC和LN達(dá)到顯著水平。秈型血緣與糙米率、精米率和整精米率呈負(fù)相關(guān)，其中，與糙米率和精米率在GD和JS達(dá)到顯著水平，與整精米率在4個(gè)地區(qū)均為顯著負(fù)相關(guān)。秈型血緣與堊白粒率和堊白度為正相關(guān)，在4個(gè)地區(qū)均未達(dá)到顯著水平。秈型血緣與粒長和籽粒長寬比在4個(gè)地區(qū)均顯著正相關(guān)，與粒寬顯著負(fù)相關(guān)。秈型血緣與堿消值和膠稠度呈正相關(guān)，在4個(gè)地區(qū)均未達(dá)到顯著水平。秈型血緣與直鏈淀粉含量呈負(fù)相關(guān)，在SC和JS達(dá)到顯著水平。秈型血緣與粗蛋白含量呈正相關(guān)，在JS達(dá)到顯著水平（圖2-b）。

a：RIL群體的秈型血緣比例分布；b：RIL群體中秈型血緣和產(chǎn)量與品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析。虛線范圍外表示在0.05水平差異顯著。下同

2.3 主栽品種的產(chǎn)量相關(guān)性狀

為了分析秈型血緣對粳稻主栽品種產(chǎn)量性狀的影響，從黑龍江省（HLJ）、遼寧?。↙N）、山東?。⊿D）和江蘇省（JS）4個(gè)粳稻稻區(qū)收集了74份主栽品種，收集品種的育成年代可分為1980年之前、1980—1990年、1990—2000年和2000年之后4組。將74份品種分別種植于HLJ、LN、SD和JS，并在這4個(gè)地區(qū)對74份品種的產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，74份品種在JS穗數(shù)顯著高于HLJ、LN和SD，HLJ穗數(shù)顯著高于LN，HLJ和SD之間以及LN和SD之間均沒有顯著性差異（圖3-a）。4個(gè)地區(qū)的每穗粒數(shù)和結(jié)實(shí)率相近，地區(qū)間沒有顯著性差異（圖3-b—c）。JS和LN的千粒重顯著高于HLJ，HLJ顯著高于SD（圖3-d）。74份品種在LN株高顯著高于HLJ、SD和JS，SD株高顯著高于HLJ，HLJ和JS及SD和JS之間株高沒有顯著性差異（圖3-e）。進(jìn)一步分析不同育成年代株高和產(chǎn)量構(gòu)成因素的特點(diǎn)和規(guī)律發(fā)現(xiàn)穗數(shù)和每穗粒數(shù)這一對負(fù)相關(guān)的性狀體現(xiàn)出年代變化規(guī)律，其中，2000年以后育成品種穗數(shù)顯著少于之前3個(gè)時(shí)期的育成品種。相反，2000年后育成品種的每穗粒數(shù)顯著多于之前3個(gè)時(shí)期的育成品種（圖3-f—g）。結(jié)實(shí)率也表現(xiàn)出改善的趨勢，其中，2000年后育成品種結(jié)實(shí)率顯著高于1980年前育成品種（圖3-h）。千粒重和株高在不同年代間沒有顯著性差異（圖3-i—j）。

2.4 秈型血緣對主栽品種產(chǎn)量性狀的影響

為了進(jìn)一步分析秈型血緣對重要農(nóng)藝性狀的影響，繪制了74份品種全基因組秈型血緣滲入比例和位置示意圖（圖4-a—b）。不同品種的秈型血緣滲入比例和位置展現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，且秈型血緣滲入位置和比例并不是均勻分布在12條染色體上，在第1、10、11和12染色體上，秈型血緣分布較多（圖4-a）。統(tǒng)計(jì)不同育成年代品種的秈型血緣滲入比例，發(fā)現(xiàn)2000年之前育成的品種秈型血緣較低，普遍低于2.0%，其中1980年以前育成品種的秈型血緣滲入比例小于0.5%。2000年后育成品種的秈型血緣滲入比例顯著增加，超過5.0%（圖4-c）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)秈型血緣滲入比例在不同地區(qū)間存在差異，其中，HLJ和SD秈型血緣滲入比例較低，SD品種秈型血緣滲入比例小于1.0%，HLJ品種秈型血緣滲入比例在1.1%左右。LN和JS品種的秈型血緣滲入比例較高，其中，遼寧省品種達(dá)到3.0%，JS品種的秈型血緣滲入比例超過4.5%（圖4-d）。結(jié)合高通量測序獲得的秈型血緣滲入比例和4個(gè)地區(qū)種植獲得的產(chǎn)量構(gòu)成因素?cái)?shù)據(jù)，分析秈型血緣對主栽品種產(chǎn)量的影響。結(jié)果顯示，秈型血緣滲入比例與株高、千粒重和結(jié)實(shí)率呈正相關(guān)，與穗數(shù)均呈負(fù)相關(guān)，在4個(gè)地區(qū)均未達(dá)到顯著水平。秈型血緣滲入比例與每穗粒數(shù)在4個(gè)地區(qū)均呈顯著正相關(guān)（圖4-e）。

綜上所述，秈型血緣滲入主要增加了粳稻品種的每穗粒數(shù)。發(fā)現(xiàn)很多品種的特定染色體區(qū)域有大量秈型血緣滲入，其中，第1染色體短臂端是每穗粒數(shù)基因所在區(qū)域，在秈粳之間存在差異，秈型第1個(gè)外顯子處6 bp的缺失和2個(gè)SNP（C/G和G/A），以及第4個(gè)外顯子處的1個(gè)SNP（G/T），導(dǎo)致其蛋白產(chǎn)物與粳稻品種產(chǎn)生差異，引起花序分裂組織中細(xì)胞分裂素的積累，進(jìn)而增加每穗粒數(shù)[13]。通過分析74份粳稻主栽品種中的基因型，發(fā)現(xiàn)絕大部分粳稻主栽品種的基因型均與日本晴和SN265相同，暗示秈型等位基因還沒有廣泛應(yīng)用到粳稻育種中。但是黑龍江省大面積推廣的粳稻品種龍粳31的位點(diǎn)基因型與R99相同，均為典型秈型等位基因（圖4-f）。進(jìn)一步比對目前已經(jīng)公布的基于長讀長測序的155份水稻基因組[14-16]，發(fā)現(xiàn)秈型等位基因廣泛分布于熱帶粳稻種質(zhì)資源當(dāng)中，溫帶粳稻中僅有來自韓國的MAEKJO、來自馬來西亞的MR19和中國的安農(nóng)晚粳B與龍粳31攜帶秈型基因型。

a—e：四地區(qū)主栽品種；f—j：不同時(shí)期育成品種。HLJ：黑龍江?。籗D：山東省。下同

為了進(jìn)一步揭示秈型血緣滲入所引入的關(guān)鍵農(nóng)藝性狀調(diào)控基因，篩選了在74份粳稻品種中超過20%的品種為秈型的SNP，并分析與這些高頻秈型SNP位置重合的已知功能基因，共發(fā)現(xiàn)11個(gè)已知功能基因（圖4-g），其中4個(gè)為抗逆性基因[17]、[18]、[19]和[20]，2個(gè)抗病性基因[21]和[22]，3個(gè)育性基因[23]、[24]和[25]，1個(gè)水稻株型調(diào)控基因[26]和1個(gè)水稻抽穗期基因[27]，暗示粳稻品種中的秈型血緣滲入主要引入了抗性和育性相關(guān)基因。

a：主栽品種中的秈型血緣滲入位置；b：主栽品種中秈型血緣滲入比例；c：不同年代育成品種中的秈型血緣滲入；d：不同地區(qū)主栽品種中的秈型血緣；e：秈型血緣與產(chǎn)量性狀的相關(guān)性分析；f：沈農(nóng)265（SN265）、R99、日本晴（Nipponbare）和龍粳31（LG31）Gn1a位點(diǎn)的基因型對比；g：秈型血緣滲入所引入的重要功能基因

2.5 基因編輯打破秈粳雜交育種中的遺傳累贅

調(diào)控重要農(nóng)藝性狀的功能位點(diǎn)在基因組上的分布并不均勻，許多功能位點(diǎn)集中分布在2 cM區(qū)間內(nèi)，這種現(xiàn)象可能導(dǎo)致引入優(yōu)異等位基因的育種過程中，因?yàn)檫z傳累贅（genetic drag）也引入了不良性狀調(diào)控基因[6]。分析主栽品種中秈型血緣滲入?yún)^(qū)域內(nèi)的重要農(nóng)藝性狀調(diào)控基因。以鹽豐47為例，鹽豐47為遼寧省、山東省等地區(qū)的主栽品種，其產(chǎn)量潛力高，千粒重達(dá)到26.2 g，高于大部分粳稻品種，但是堊白性狀有待提高。發(fā)現(xiàn)鹽豐47的第5染色體短臂端有一段秈型血緣滲入，該區(qū)間內(nèi)包含了重要粒形調(diào)控基因和堊白調(diào)控基因（圖5-a）。編碼一個(gè)絲氨酸羧肽酶，其優(yōu)勢等位基因（ZS97型）顯著增加水稻籽粒大小[28]。在上游的為液泡膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)焦磷酸酶，具有無機(jī)焦磷酸水解活性和質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)活性，影響水稻籽粒堊白的形成和精米率等品質(zhì)性狀，其ZS97型等位基因顯著增加籽粒堊白度和堊白粒率[29]。通過序列比對，發(fā)現(xiàn)鹽豐47的和均與秈稻品種ZS97相同（圖5-b）。

綜上所述，推測鹽豐47在育種過程中為了追求高產(chǎn)而引入了秈型等位基因以期增加千粒重，與相鄰的秈型也隨之滲入到鹽豐47基因組，導(dǎo)致堊白性狀惡化。為了保留鹽豐47的千粒重優(yōu)勢，改良其堊白性狀，對鹽豐47的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)基因敲除。在T2代篩選到2個(gè)無Cas9的純合突變系CR-1和CR-2，其中CR-1缺失了一個(gè)堿基（A），CR-2缺失2個(gè)堿基（TA），二者都造成移碼突變，提前產(chǎn)生終止子（圖5-c）。突變體CR-1和CR-2與鹽豐47在粒形上無顯著差異（圖5-d），其堊白性狀顯著改善（圖5-e—f）。

a：Chalk5和GS5的位置；b：鹽豐47中Chalk5和GS5的基因型；c：CRISPR/Cas9基因編輯的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和突變體序列比對；d：野生型和突變體的粒形比較；e：野生型和突變體的堊白性狀比較；f：野生型和突變體的堊白粒率

3 討論

3.1 秈粳雜交育種顯著提高北方粳稻產(chǎn)量潛力

目前，全球粳稻種植面積超過1 478萬hm2，主要分布在中國東北、日本和韓國。早在1959年，楊守仁先生率先提出秈粳稻雜交育種新思路，在此基礎(chǔ)上，陳溫福院士團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了理想株型與秈粳優(yōu)勢互補(bǔ)相結(jié)合的理論體系，即“利用秈粳稻雜交創(chuàng)造新株型和強(qiáng)優(yōu)勢，通過復(fù)交優(yōu)化性狀組配聚合有利基因，選育理想株型與秈粳優(yōu)勢互補(bǔ)相結(jié)合的超級稻”，成為中國特別是北方粳型超級稻育種的總體技術(shù)路線，在此路線的指導(dǎo)下東北粳稻產(chǎn)量水平顯著提高，為中國乃至世界糧食安全作出了巨大貢獻(xiàn)。截至2014年，東北三省育成超級稻品種22個(gè)，覆蓋率達(dá)到60%以上，促進(jìn)東北水稻單產(chǎn)由21世紀(jì)初平均的6.60 t·hm-2（2000—2004年）提高到近年的7.56 t·hm-2（2010— 2014年），增產(chǎn)幅度達(dá)到12.62%，顯著高于同期全國平均增產(chǎn)水平（6.20 t·hm-2、6.71 t·hm-2、6.42%）[10]。本研究發(fā)現(xiàn)2000年后育成品種秈型血緣顯著增加，與我國東北水稻21世紀(jì)初開始單產(chǎn)增幅顯著提高相吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證秈粳雜交引入秈型血緣可以增加我國粳稻產(chǎn)量潛力，因此，從基因組層面揭示秈型血緣在東北水稻育種中的作用是未來在更高水平上突破粳稻育種瓶頸的關(guān)鍵之一。

3.2 全基因組高通量測序加速粳稻基因組相關(guān)研究

高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)為解決粳稻基因組研究瓶頸提供了有效方法，應(yīng)用高通量測序技術(shù)獲得的高密度標(biāo)記，成功追蹤了亞洲栽培稻的馴化起源和水稻育種過程中的基因組印記[30-31]。幾項(xiàng)大規(guī)模水稻群體的深度測序和表型觀測為水稻研究和育種提供了寶貴的基因組信息和種質(zhì)資源[3, 32]。3 000份水稻（3K-RGP）項(xiàng)目廣泛收集和測序了世界主要水稻產(chǎn)區(qū)的種質(zhì)資源，成為水稻群體遺傳研究的一個(gè)里程碑[5]。對我國不同時(shí)期代表性的816份和546份粳稻品種進(jìn)行二代重測序發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)80年代以來粳稻品種的秈型血緣持續(xù)增加，生育期、低溫結(jié)實(shí)率、稻瘟病抗性和粒形上表現(xiàn)出顯著的年代差異，使粳稻的重要農(nóng)藝性狀發(fā)生了顯著變化[33-34]。雖然基于高通量測序技術(shù)的水稻基因組研究已經(jīng)廣泛開展，但是對于秈型血緣在我國粳稻育種中的作用還有待探討。本研究通過對秈粳交重組自交系和我國不同年代粳稻主栽品種的分析發(fā)現(xiàn)，秈型血緣的引入主要增加了粒長和每穗粒數(shù)，而且2000年后推廣的品種秈型血緣顯著高于2000年之前。這與基于2004—2018年全國水稻區(qū)試試驗(yàn)的結(jié)果相吻合，我國北方粳稻2004—2018年的增產(chǎn)主要得益于每穗粒數(shù)的增加[35]。2000年后育成品種秈型血緣增加顯著提高了北方粳稻的每穗粒數(shù)，進(jìn)而提升了北方粳稻的產(chǎn)量潛力。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著秈型血緣滲入，我國北方粳稻品種中引入了秈型的抗性、育性、株型和抽穗期相關(guān)基因。

3.3 基因編輯技術(shù)改善秈粳雜交育種的遺傳累贅現(xiàn)象

CRISPR基因編輯技術(shù)自2013年首次應(yīng)用于水稻之后發(fā)展迅速[36]，應(yīng)用CRISPR技術(shù)成功鑒定了大量水稻基因功能[37-38]，并構(gòu)建了大量CRISPR基因敲除突變體庫[39]。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控，對水稻Wx等位基因的啟動子區(qū)域、非編碼區(qū)和內(nèi)含子剪接點(diǎn)進(jìn)行基因編輯，成功得到了多個(gè)新等位基因，新等位基因可產(chǎn)生不同直鏈淀粉含量的秈稻新種質(zhì)資源[40]。揚(yáng)州大學(xué)劉巧泉團(tuán)隊(duì)通過CRISPR/Cas9技術(shù)編輯水稻啟動子上的關(guān)鍵順式作用元件，得到了一個(gè)溫和調(diào)節(jié)表達(dá)的啟動子靶位點(diǎn)，獲得了6種農(nóng)藝性狀良好的新等位基因及其新種質(zhì)資源，有潛力應(yīng)用于稻米品質(zhì)改良育種[41]。李家洋院士團(tuán)隊(duì)通過基于平鋪刪除策略的CRISPR/ Cas9技術(shù)，創(chuàng)制了在啟動子中含有54 bp缺失的等位基因，該區(qū)域可以與結(jié)合以抑制穗中的表達(dá)，導(dǎo)致次級和小穗分生組織受到抑制，進(jìn)而同時(shí)增加穗數(shù)和每穗粒數(shù)，從而提高水稻產(chǎn)量，說明平鋪缺失篩選方法可以用來平衡植物育種中的基因多效性[42]。本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對鹽豐47的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)基因敲除，在不改變鹽豐47其他農(nóng)藝性狀的同時(shí)改善其堊白性狀。

4 結(jié)論

秈粳稻雜交育種中，秈型血緣滲入主要通過增加每穗粒數(shù)增加粳稻產(chǎn)量潛力，同時(shí)對粳稻碾磨品質(zhì)有負(fù)面影響。通過全基因組高通量測序挖掘秈粳雜交育種過程中因遺傳累贅?biāo)氲牟涣嫉任换?，?yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對不良等位基因進(jìn)行快速準(zhǔn)確的改良，是一種高效的育種輔助手段。

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The effect of/Xian pedigree introgression in/Geng rice breeding in China

Xu Hai1, Li Xiukun1,2, Lu Jiahao1, Jiang Kai1, Ma Yue1, Xu Zhengjin1, Xu Quan1

1Rice Research Institute, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866;2College of Agronomy, Hebei Agricultural University/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Hebei, Baoding 071001, Hebei

【Objective】To demonstrate the impact of(XI) pedigree introgression on the yield and quality of(GJ) rice varieties, providing a theoretical basis and genomic resources for optimizing XI pedigree introgression breeding programs in northern GJ rice.【Method】In this study, the whole genome sequence on Illumina platform was employed to elucidate the effects of XI pedigree introgression on the yield and quality of rice in Northeast China were analyzed using recombinant inbred lines (RIL) derived from the cross between XI and GJ varieties, and 74 major GJ varieties grown from Heilongjiang, Liaoning, Shandong, and Jiangsu provinces as test materials. Using CRISPR/Cas9 gene editing technology to knock out the unfavorable genes introduced by XI pedigree introgression. 【Result】Analysis of RIL revealed a significant positive correlation between XI pedigree introgression and panicle length, grain length, and a negative correlation with head rice ratio. XI pedigree introgression was significantly negatively correlated with Amylose content, and significantly positively correlated with protein content in Jiangsu. With the increase of latitude, the correlation efficiency between XI pedigree introgression and grain shape increased, while the correlation between XI pedigree introgression and panicle length and head rice ratio decreased. The genomic fragments of XI pedigree introgression are unevenly distributed across different chromosomes and are more abundantly present on chromosomes 1, 10, 11, and 12. The XI pedigree introgression of the major cultivars in Jiangsu and Liaoning provinces is significantly higher than that in Heilongjiang and Shandong provinces, and the XI pedigree introgression of the cultivars after 2000 is significantly higher than that before 2000. The XI pedigree introgression includes multiple resistance and fertility-related genes. The project identified an XI pedigree introgression fragment on chromosome 5 of YF47, including the XI type grain regulatory geneand XI type chalkiness regulatory gene, which increased the 1000 grain weight of YF47 but affected its chalkiness-related traits. The project uses CRISPR/Cas9 technology to knock out thegene of YF47. The grain shape of the homozygous gene editing plants is similar to those of YF47, and its chalkiness character has been significantly improved. 【Conclusion】The XI pedigree introgression mainly increases the yield potential of GJ rice by increasing the number of grains per panicle, but has a negative impact on milling quality. Exploring the unfavorable alleles in varieties through high-throughput genome sequencing, combined with CRISPR/Cas9 gene editing, to break the genetic drag in breeding using the cross between XI and GJ, is an efficient breeding strategy that can quickly and accurately improve target traits.

rice;/Geng breeding;/Xian pedigree introgression; yield; quality; molecular design breeding

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.22.001

2023-05-19；

2023-06-16

國家自然科學(xué)基金（32071982）

徐海，E-mail：chinaxuhai@163.com。通信作者徐銓，E-mail：kobexu34@syau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）