蔣文鴻，王潤崢，王 勇，劉素穩(wěn)*，常學東

（1.中糧長城葡萄酒（寧夏）有限公司，寧夏銀川 750000；2.河北科技師范學院食品科技學院，河北秦皇島 066604）

果酒是以植物的果實作為原料，經(jīng)發(fā)酵釀造而成的低酒精度飲料。隨著近年來人民生活水平的逐步提高和消費品味的豐富多樣化，營養(yǎng)豐富和口感柔和的果酒受到越來越多消費者的喜愛，逐漸成為人們居家旅行和宴會接待的必備飲品。

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge），又名山里果、山里紅，薔薇科落葉小喬木植物山里紅的果實[1]，果實外觀呈球形，成熟后為深紅色，表面呈現(xiàn)淡色小斑點。果實酸甜可口，含豐富的維生素、山楂酸、檸檬酸、黃酮類等，具有生津止渴的良好效果，也可入藥使用，入藥歸脾、胃、肝經(jīng)，有消食化積、降血壓、活血散瘀的良好功效[2-3]。將其開發(fā)成具有高附加值的山楂酒，不僅可保留山楂的大部分營養(yǎng)成分，還能提升產(chǎn)品的附加值，促進山楂產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]，并且符合糧食酒向果酒轉變的國家酒類行業(yè)政策。以鮮山楂為主要原料釀制的山楂酒，是除獼猴桃酒外擁有行業(yè)標準的果酒[5]，符合消費者追求純天然無污染、含糖量少、酒精度低且有益于健康的果酒消費潮流。

山楂酒是以新鮮山楂為原料，經(jīng)清洗、破碎、發(fā)酵、穩(wěn)定等工藝精心釀制而成的，酒質溫和爽口，果香味濃，較好保留了山楂鮮果中的天然營養(yǎng)成分和總酚、黃酮等保健成分，是一種天然健康的生物飲品。色香味是消費者對食品的基本需求，香氣成分也是果酒中十分重要的質量指標，香氣和其他特性決定果酒的檔次和品味[6]。山楂酒發(fā)酵過程中其香氣成分和酚類物質會發(fā)生變化，為了更多保留有益成分，對山楂酒進行預處理可以保留更多的香氣成分和抗氧化物質，增加山楂酒的香氣并增強其抗氧化性，提高山楂酒的品質。本文通過GC-MS 和SPME 技術對預處理后山楂酒的香氣成分進行分析，對比空白對照、水浴、微波等3 種不同處理的山楂在發(fā)酵后香氣成分和抗氧化性的變化趨勢，從而進一步研究預處理對山楂酒香氣成分和抗氧化性的影響，為釀造高品質山楂酒提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原材料：紫肉山楂，采摘于2021 年興隆縣；果膠酶，美國Sigma 公司；白砂糖，超市；干酵母，超市；沒食子酸，原花青素，香草醛；碳酸鈉、乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、鹽酸、氯化鉀、過硫酸鉀，均為分析純。

儀器設備：7890-5975 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；實驗室pH 計(FE20)，梅特勒-托利多儀器有限公司；微波爐，LG 燒烤型微波爐WD800（MG-5530S），樂金電子電器有限公司；顯數(shù)恒溫水浴鍋(HH-4)，金壇市杰瑞爾電器有限公司；低速離心機(TDZ5-WS)，長沙湘儀離心機儀器有限公司；紫外分光光度(U2910)，雙光束紫外分光光度計；鼓風干燥箱(DHG-9245A 型)，上?；厶﹥x器制造有限公司；電子分析天平(AL104)，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山楂酒樣品預處理

挑選無破損、病蟲害、霉變，顆粒飽滿的山楂，去核，去梗，做前期處理，每個處理選取1 kg山楂。

（1）對照組：每50 g 破碎的山楂中加入75 mL水，不做其他處理。

（2）水浴組：每50 g 破碎的山楂中加入75 mL水，在50 ℃的水浴中水浴1 h。

（3）微波組：每50 g 破碎的山楂中加入75 mL水，在540 W微波下處理50 s。

1.2.2 山楂酒釀造工藝流程

山楂→分選→洗滌→破碎→預處理→山楂汁的制備→添加果膠酶→加糖、酵母→發(fā)酵→分離→后發(fā)酵→補加SO2→貯存→下膠→過濾→冷凍→過濾→裝瓶→成品

1.2.3 發(fā)酵過程

采用1∶2 的山楂酒料水比進行料液添加，再加入75 mg/L 的二氧化硫并在25 ℃的培養(yǎng)箱中放置24 h。為使山楂汁中有效物質充分溶解，還要加入110 mg/L 的果膠酶，在37 ℃下放置6 h。果膠酶處理結束后，及時加入白砂糖以補充糖分。隨后加入活化酵母，二次加糖，將調好的山楂汁在25 ℃培養(yǎng)箱中放置發(fā)酵。每天攪拌一次，測酒精度，第12 d發(fā)酵結束。

1.2.4 檢測指標與方法

1.2.4.1 固相萃取儀萃取香氣

將100 μm PDMS 萃取頭在氣相色譜進樣口老化2 h，老化溫度250 ℃。選取不同山楂酒樣品置于15 mL 頂空瓶中，上部留有2 cm 左右的空間，封口。將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于45 ℃吸附40 min，將吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行測定分析。

1.2.4.2 山楂酒香氣的GC-MS分析

色譜柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm DB—225MS甲基硅氧環(huán)毛細管柱；GC/MS 條件：升溫程序為40 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升溫至100 ℃，再以5 ℃/min 升溫至220 ℃；載氣：氦氣，流量：1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度230 ℃。

質譜條件：EI 源，離子源溫度230 ℃，電離方式為電子轟擊（Electron Impact，EI），電子能量70 eV，掃描質量范圍：10～425 amu[7]。

1.2.4.3 總酚測定

取釀造好的山楂酒，離心機4000 r/min 離心10 min，取上清液備用。

采用福林酚法[8]，精密稱取沒食子酸0.1 g 定容至100 mL容量瓶中，制成1 mg/mL的沒食子酸標準溶液。分別準確量取上述標準液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL 于100 mL 容量瓶中定容，取1 mL 上述標準溶液，加5 mL 經(jīng)稀釋10 倍的福林肖卡試劑，搖勻。1 min 之后加入7.5%碳酸鈉溶液4 mL，充分混勻，蒸餾水定容至10 mL，在75 ℃下反應10 min，于765 nm 波長比色，測定吸光度，繪制標準曲線(y=0.6513x+0.0913，R2=0.9992)。

按照標準曲線方法取山楂酒，測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算總酚的含量（以每100 mL 酒中所含沒食子酸mg數(shù)表示）。

1.2.4.4 花色苷測定

采用pH 示差法[9]，制備pH1.0 和pH4.5 的緩沖溶液。

取測總酚處理好的山楂酒1 mL，分別用pH1.0和pH4.5的緩沖溶液定容至10 mL，分別在520 nm、700 nm 處測其吸光度，每個樣品重復測定3 次，取平均值。

式 中：A=（A520 nm-A700 nm）pH1.0-（A520 nm-A700 nm）pH4.5；MW 為矢車菊-3-葡萄糖苷的分子質量449.2；DF 為稀釋倍數(shù)10；B 為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)26900；L為比色皿光程（1 cm）。

1.2.4.5 抗氧化性測定

（1）DPPH：取1 mL 山楂酒與3 mL DPPH 溶液充分搖勻避光，37 ℃水浴30 min 后在517 nm 處測定其吸光值，同時以蒸餾水代替樣品做空白對照實驗，以樣品和無水乙醇混合液作為樣品調零，以蒸餾水和無水乙醇混合液作為空白對照調零。

（2）ABTS：取1 mL 山楂酒液與3 mL ABTS 工作液，混合10 s 后在暗處準確反應6 min，在734 nm波長下測定吸光度。同時以蒸餾水代替樣品做空白對照實驗，以樣品和蒸餾水混合液作為樣品調零，以4 mL的蒸餾水為空白作為空白對照調零[10]。

（3）總抗氧化能力的測定（T-AOC）：利用總抗氧化能力測定試劑盒測定，將釀造好的山楂酒，用離心機4000 r/min離心10 min，取上清液，作為待測樣品，按照樣品與雙蒸水1∶9 處理，按照試劑盒說明書操作。

單位定義及計算公式：

1.2.5 統(tǒng)計分析

文中實驗數(shù)據(jù)為三次試驗數(shù)據(jù)的平均值；使用DPS統(tǒng)計分析軟件進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 山楂酒香氣成分的GC-MS總體檢測結果

表1 為香氣成分的GC-MS 分析結果。成分鑒定根據(jù)質譜圖經(jīng)計算機檢索同時與NIST11.L 質譜庫相對比，并結合人工圖譜解析及資料分析，確認揮發(fā)性物質的各化學成分，按峰面積歸一化法求得各組分相對質量百分含量[11]。

表1 山楂酒香氣成分的GC-MS檢測結果

酒體香氣成分主要由酯類、醇類、酸類、醛類等化合物構成，這些不僅是酒體質量的重要組成部分，還對酒的感官特征有重要影響[12]。本實驗共鑒定出77種芳香成分，用SPME技術萃取果酒香氣和GC-MS 技術可檢測鑒定山楂酒預處理后88 %以上的香氣成分，主要香氣種類及含量見表1。山楂酒的香氣成分中醇類物質相對含量最高。對照組山楂酒鑒定到的香氣有57 種，其中醇類物質18 種，相對含量為50.14 %；酯類物質16 種，相對含量為32.24 %；酸類物質11 種，相對含量為6.95 %；醛類物質6 種，相對含量為1.81 %；酚類物質2 種，相對含量為2.65 %；其他物質4 種，相對含量為0.91%。水浴組山楂酒鑒定到的香氣只有51種，其中醇類物質17 種，相對含量為56.87 %；酯類物質16 種，相對含量為16.69 %；酸類物質7 種，相對含量為9.42 %；醛類物質7 種，相對含量為2.26%；酚類物質3 種，相對含量為3.2%；其他物質1 種，相對含量為0.58 %。微波組山楂酒鑒定到的香氣為55種，其中醇類物質17 種，相對含量為55.22%；酯類物質15 種，相對含量為18.3%；酸類物質9 種，相對含量為9.09%；醛類物質8 種，相對含量為1.15%；酚類物質2 種，相對含量為4.3%；其他物質4 種，相對含量為0.64%。

2.2 醇類組分比較分析

山楂酒中的主要香氣成分是醇類物質，是酵母細胞分解氨基酸或糖類物質產(chǎn)生的次級產(chǎn)物，在果酒香氣中起到十分重要的作用[13]。由表2 可知，上述3 種方法中，醇類物質含量最高，其中對照組的醇類相對含量為50.14 %，水浴組醇類相對含量為56.87%，微波組醇類相對含量為55.22%。

表2 三組山楂酒中香氣組成及含量

2.3 酯類組分比較分析

酯類化合物是構成酒體果香和酒香的重要物質，主要有3 種來源：一是存在于水果原料中構成果香的酯；二是在發(fā)酵過程中酵母菌細菌活動形成的酯；三是來源于貯存過程中的酯化反應[14]。本實驗在山楂酒揮發(fā)性物質中對照組檢出16 種，水浴組檢出16 種，微波組檢出15 種。對照組山楂酒中乙酸異戊酯15.22 %，辛酸乙酯8.49 %，己酸乙酯2.23 %；水浴組山楂酒中辛酸乙酯9.36 %，己酸乙酯3.57 %；微波組山楂酒中辛酸乙酯8.39 %，己酸乙酯2.66%，乙酸己酯2.39%等。各酯類含量相差不大，但對果酒的香味具有十分重要的影響。

2.4 酸類組分比較分析

適量的有機酸使果酒口感清爽，若缺乏酸類，果酒就會顯得黏稠，而過量的酸會使口感粗糙、不柔和、不協(xié)調，合適的糖酸比對酒體平衡以及滋味起著重要作用。有機酸能抑制大部分引起果酒腐敗變質的有害微生物的繁殖[15]。表2 顯示，本實驗在山楂酒揮發(fā)性物質中對照組檢出11 種，水浴組檢出7 種，微波組檢出9 種。對照組山楂酒中辛酸3.56 %，3-乙烯乙酸1.71 %；水浴組山楂酒中3-乙烯乙酸4.55 %，辛酸3.77 %；微波組山楂酒中辛酸3.53%，4-乙烯乙酸3.45%。

2.5 其他種類組分比較分析

山楂酒中的揮發(fā)性成分除去已經(jīng)檢出的醇類化合物、酯類化合物和酸類化合物外，還檢測出少量醛類物質、酚類物質以及其他種類香氣成分，如1-Octanal 辛醛、Asparagine 天冬酰胺等。這些物質含量較低，閾值相對較低，但對山楂酒的獨特香氣具有十分重要的影響[16]。

2.6 預處理對總酚和花色苷含量的影響

經(jīng)過不同處理后的山楂酒中總酚含量如圖1所示。從圖1 可看出，與未處理的山楂酒相比，不同處理方法對山楂酒中總酚含量均有顯著的影響(P＜0.05)。酚類物質也會影響木瓜酒的品質，改變其口感、風味、色澤等[17]。由于山楂酒中酚類化合物的存在，使山楂酒具有抗氧化性，這些物質含量的多少直接影響山楂酒抗氧化性的強弱。在發(fā)酵過程中，總酚和黃酮的含量先上升后下降，是因為酵母所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物與酒中的總酚和黃酮物質發(fā)生反應[18]；酚類物質被微生物產(chǎn)生的酶降解而沉淀，也導致其含量的減少。由圖1 可知，發(fā)酵結束后，對照組中總酚含量為234.92 mg/100 mL，水浴組中總酚含量為297.44 mg/100 mL，微波組中總酚含量為214.40 mg/100 mL。相比之下，經(jīng)水浴處理的山楂酒中總酚含量相對較高。

圖1 山楂酒發(fā)酵及貯藏期間酚類物質變化

山楂酒經(jīng)過不同處理后的花色苷含量如圖1所示。從圖1 可以看出，山楂酒中花色苷含量變化趨勢與總酚變化規(guī)律一致，與未處理的山楂酒相比，不同處理方式對其花色苷含量均有顯著的影響(P＜0.05)[19]?；ㄉ諡樗苄晕镔|，更易被山楂酒中的酒精溶解，在發(fā)酵過程中，山楂果實中的花色苷轉移到發(fā)酵液中，使得山楂酒中花色苷的含量急劇上升，達到最高花色苷含量?；ㄉ找资艿焦?、pH 值、溫度等影響分解，所以，花色苷的含量在發(fā)酵結束后有所減少。由圖1 可知，當發(fā)酵結束后，對照組中花色苷含量為5.71 mg/L，水浴組中花色苷含量為7.03 mg/L，微波組中花色苷含量為5.81 mg/L。相比之下，經(jīng)水浴處理的山楂酒中花色苷含量相對較高。

2.7 不同預處理對山楂酒抗氧化性的影響

2.7.1 自由基清除率的比較

經(jīng)過不同預處理的山楂酒DPPH 自由基清除活性結果及ABTS自由基的清除能力如圖2所示。

圖2 不同處理方式后山楂酒DPPH法、ABTS法自由基清除率

從圖2 可以看出，未處理山楂酒及不同預處理后山楂酒對DPPH 自由基均具有很好的清除活性，不同處理方式也均具有很好的ABTS 自由基清除能力。Hanula 等[20]的研究結果表明，微波技術的應用縮短了時間，保證了總酚類化合物的高含量和強的抗氧化活性。發(fā)酵結束時，三組DPPH 法自由基清除率均為84 %，利用ABTS 法得出自由基清除率，對照組和微波組組均為69 %，水浴組為70 %，利用T-AOC 法得出總抗氧化能力對照組為146 unit/mg，微波組為153 unit/mg，水浴組161 unit/mg；當發(fā)酵結束后貯藏4 個月時，利用DPPH 法得出自由基清除率，對照組為69 %，水浴和微波組均為79%，利用ABTS 法得出自由基清除率，對照組和微波組組均為75 %，水浴組為77 %，利用T-AOC 法得出總抗氧化能力為對照組142 unit/mg，微波組134 unit/mg，水浴組148 unit/mg。根據(jù)以上數(shù)據(jù)可知，經(jīng)水浴處理的山楂釀造的山楂酒對自由基具有較好的清除能力，微波以及未處理的山楂酒對自由基的清除能力較弱。

2.7.2 總抗氧化能力分析

由圖3 可知，不同預處理后的山楂酒在發(fā)酵及貯藏期間的抗氧化能力存在明顯差異。水浴組山楂酒的抗氧化能力整體強于微波組和對照組山楂酒的抗氧化能力，具有較強的抗氧化性。這是由于水浴處理的山楂，經(jīng)發(fā)酵釀造而成的山楂酒中總酚和花色苷的含量相對較高?？偡雍突ㄉ帐巧介浦兄饕目寡趸镔|，山楂酒中抗氧化物質的含量較高，對氧自由基的清除能力有所加強，氧自由基的清除率也相對較高，與2.7.1 中結論一致。所以，水浴組山楂酒的抗氧化能性相對最強。

圖3 山楂酒發(fā)酵及貯藏期間總抗氧化能力變化

利用T-AOC 法測定三組山楂酒發(fā)酵及貯藏期間的抗氧化能力，并對山楂酒的抗氧化能力與其總酚含量的相關性進行分析。從圖4 可以看出，對照組山楂酒的抗氧化能力與其總酚含量(r=0.835，P＜0.05)，水浴組山楂酒的抗氧化能力與其總酚含量(r=0.947，P＜0.01)和微波組山楂酒的抗氧化能力與其總酚含量(r=0.781，P＜0.05)均具有顯著相關性，說明山楂酒中的總酚是其發(fā)揮抗氧化性的主要活性物質。Wojdylo 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，微波和水浴處理的葡萄酒多酚含量整體高于對照組，具有更強的抗氧化能力。

圖4 山楂酒中總酚含量與抗氧化能力之間關系

3 結論

不同方法對山楂進行預處理，GC-MS 檢測到的香氣成分種類和相對含量均不同，預處理后部分香氣種類減少，但主要呈香物質得以保留。山楂酒的主要呈香物質為醇類，且經(jīng)水浴處理后的山楂酒中醇類物質最多，香味最濃。在相同發(fā)酵情況下，水浴處理的山楂酒總酚含量較高，具有較強的抗氧化性。經(jīng)水浴處理的山楂酒在4 個月貯藏期間酚類物質變化較小，抗氧化性相對較好。因此，經(jīng)過水浴處理的山楂酒比對照、微波處理的山楂酒品質更高，后期需進一步研究其營養(yǎng)成分的變化規(guī)律，以綜合評判預處理在果酒中的適用性。