劉暢,崔子旭，左周，贠紅梅，牛瑾，楊陽(yáng)，郭曉紅，李步高，高鵬飛，趙燕，曹果清

飼糧纖維水平對(duì)豬腸道屏障功能、結(jié)腸微生物及代謝產(chǎn)物的影響

劉暢1,崔子旭1，左周1，贠紅梅2，牛瑾1，楊陽(yáng)1，郭曉紅1，李步高1，高鵬飛1，趙燕1，曹果清1

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801；2山西省畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，太原 030001

【目的】添加纖維原料是降低飼料成本的有效方法之一，通過(guò)探討不同纖維水平飼糧對(duì)馬身豬和杜長(zhǎng)大豬腸道健康的影響，為纖維的合理利用提供依據(jù)?！痉椒ā砍跏俭w重為（20±0.5）kg的馬身豬（MS）和杜×長(zhǎng)×大三元雜交豬（DLY）各80頭，品種內(nèi)隨機(jī)分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭豬（公母各半）。試驗(yàn)飼糧分別在玉米-豆粕基礎(chǔ)日糧中添加0%、9.35%、18.64%和28.03%的大豆皮，日糧中中性洗滌纖維（NDF）含量分別為9% (9N)、13.5% (13.5N)、18% (18N)和22.5% (22.5N)。試驗(yàn)期30 d?！窘Y(jié)果】對(duì)于馬身豬，18N組回腸IL-10含量、13.5N和22.5N組盲腸TNF-α含量均顯著降低（＜0.05）；空腸、回腸、盲腸杯狀細(xì)胞數(shù)目隨纖維水平的提高而增加，結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量和表達(dá)水平在13.5N和18N組均顯著增加（＜0.05）；18N和22.5N組、、、的表達(dá)量顯著增加（＜0.05）；13.5N、18N和22.5N組的大腸桿菌志賀氏菌豐度顯著降低（＜0.05）；13.5N組的乳酸桿菌屬、18N組的普雷沃氏菌科_NK3B31屬、22.5N組的甲烷桿菌屬的豐度均顯著提高（＜0.05）；13.5N、18N和22.5N組的棕櫚酸、硬脂酸、月桂酸、癸酸均顯著上調(diào)（＜0.05），石膽酸、膽酸均顯著下調(diào)（＜0.05）；差異代謝物主要富集在脂質(zhì)代謝和碳水化合物消化吸收相關(guān)通路上。對(duì)于杜長(zhǎng)大豬，22.5N組盲腸TNF-α含量顯著提高（＜0.05）；13.5N、18N、22.5N組的各腸段的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于9N組（＜0.05），結(jié)腸表達(dá)水平在13.5N、18N組顯著增加（＜0.05），在22.5N組則顯著下降（＜0.05）；18N、22.5N組的、、表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；13.5N的甲烷桿菌屬、18N組的鏈球菌屬、22.5N組的毛螺菌屬豐度均顯著提高（＜0.05）；L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、苯丙氨酸等羧酸及其衍生物在13.5N、18N組中顯著上調(diào)，而在22.5N組中顯著下調(diào)；差異代謝產(chǎn)物主要富集在氨基酸代謝通路上。馬身豬和杜長(zhǎng)大豬的微生物區(qū)系與腸道屏障相關(guān)基因及色氨酸和膽汁酸代謝產(chǎn)物之間均表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性?！窘Y(jié)論】提高飼糧纖維水平能夠增強(qiáng)豬腸道屏障功能，提高有益菌的豐度，降低有害菌豐度，調(diào)節(jié)結(jié)腸脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝，通過(guò)微生物途徑影響短鏈脂肪酸、色氨酸和膽汁酸代謝，可促進(jìn)腸道健康。

飼糧纖維水平；腸道屏障；微生物；代謝產(chǎn)物；豬

0 引言

【研究意義】為了降低飼料成本和拓寬飼料來(lái)源，越來(lái)越多富含纖維的農(nóng)副產(chǎn)品被應(yīng)用到豬飼料生產(chǎn)中。飼糧纖維無(wú)法被體內(nèi)消化酶消化，最終由后腸中的微生物發(fā)酵，產(chǎn)生包括短鏈脂肪酸（SCFAs）在內(nèi)的代謝產(chǎn)物[1]。纖維來(lái)源、纖維含量、品種等因素都會(huì)影響豬腸道對(duì)纖維的發(fā)酵[2]。與其他谷物副產(chǎn)品或植物性飼料成分相比，大豆皮含有大量的纖維素和半纖維素且木質(zhì)素含量較少，能夠在腸道內(nèi)得到充分發(fā)酵，是一種良好的纖維原料[3]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)飼糧纖維除了能提高生產(chǎn)性能和營(yíng)養(yǎng)消化率，還具有在一定程度上增強(qiáng)動(dòng)物免疫能力和改善腸道健康的積極作用[4-6]。通過(guò)營(yíng)養(yǎng)手段調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道健康是無(wú)抗時(shí)代預(yù)防疾病的重要措施，合理利用纖維對(duì)豬養(yǎng)殖過(guò)程中降本增效具有重大意義。探究改善豬免疫力和腸道健康的最適飼糧纖維含量，可為纖維高效利用提供科學(xué)依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】腸黏膜中的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子通過(guò)參與固有和適應(yīng)性免疫來(lái)維持局部和全身的穩(wěn)態(tài)[7-8]。有研究表明，燕麥麩皮能夠提高豬回腸免疫因子IL-10的含量，在一定程度上提高了腸道的抗炎能力[9]；共發(fā)酵脫脂米糠也提高了豬血清中IgG、抗炎細(xì)胞因子（IL-22、IL-23）的水平，降低了促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β和INF-γ）的水平[10]。補(bǔ)充大麥不溶性膳食纖維能夠提高小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白（occludin）的基因表達(dá)，有效緩解小鼠的結(jié)腸炎[11]。麥麩和豌豆殼纖維通過(guò)增加杯狀細(xì)胞數(shù)量來(lái)提高豬遠(yuǎn)端小腸黏蛋白基因的表達(dá)和黏蛋白的分泌[12]。研究表明飼糧纖維水平的提高能夠增加空腸及盲腸中的螺旋體門(mén)、纖維菌門(mén)及普雷沃氏菌屬的豐度，證明纖維成分能夠提高纖維發(fā)酵菌的繁殖率[13]。腸道微生物能夠發(fā)酵纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸，從而降低腸腔內(nèi)的pH來(lái)抑制有害菌的生長(zhǎng)[14]。高纖維飲食會(huì)間接影響能量、氨基酸和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝。研究表明在高纖維處理組中，琥珀酸、高龍膽酸等代謝物的濃度均有所提高，證明了飼糧纖維能夠提高機(jī)體的能量代謝和氨基酸代謝[14-16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，人們大多采用單一品種豬或單一飼糧纖維水平來(lái)研究纖維對(duì)豬的影響，運(yùn)用梯度飼糧纖維水平研究纖維對(duì)不同豬種的影響仍較為少見(jiàn)。本研究利用微生物組及非靶代謝組學(xué)來(lái)進(jìn)一步探究飼糧纖維對(duì)豬腸道微生物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的影響，并通過(guò)關(guān)聯(lián)分析研究豬營(yíng)養(yǎng)代謝的微生物途徑及其作用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以我國(guó)地方品種馬身豬與商品豬杜長(zhǎng)大豬為研究對(duì)象，探究不同飼糧纖維水平對(duì)豬腸道屏障功能、腸道微生物及代謝產(chǎn)物的影響，闡明纖維對(duì)腸道健康的積極作用，為飼糧中纖維的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年12月5日至2021年1月5日在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)豬場(chǎng)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取初始體重為（20±0.5）kg的80頭馬身豬（MS）和80頭杜×長(zhǎng)×大三元雜交豬（DLY）為試驗(yàn)動(dòng)物，品種內(nèi)隨機(jī)分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭（公母各半，公豬已去勢(shì)）。不同組別分別飼喂在基礎(chǔ)日糧中添加不同含量大豆皮部分替代玉米和豆粕的試驗(yàn)日糧，即9N組（9%NDF，不添加大豆皮），13.5N組（13.5%NDF，添加9.35%大豆皮）、18N組（18%NDF，添加18.64%大豆皮）和22.5N組（22.5%NDF，添加28.03%大豆皮）。預(yù)試期7 d，試驗(yàn)期30 d。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)前所有個(gè)體按常規(guī)程序進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)，每天7：00、12：00、17：00各飼喂一次，每次加料1 h后清除剩料，自由飲水。飼養(yǎng)期間各組飼喂方式、試驗(yàn)環(huán)境及管理模式均相同。

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)處理組隨機(jī)挑選3頭接近該處理組平均體重的個(gè)體進(jìn)行前腔靜脈采血，靜置30 min后，3 000 r/min，4℃離心15 min分離血清，分裝后置于-80℃保存。屠宰后立即分離腸道，各腸段取2—3 cm中段樣品，固定在4%多聚甲醛中備用；采集各腸段組織樣品及結(jié)腸內(nèi)容物，置于凍存管中，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 腸道免疫指標(biāo)的檢測(cè) 腸道組織中白介素10（IL-10）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、分泌性免疫球蛋白A（sIgA）均采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定。將回腸、盲腸、結(jié)腸組織剪碎，加入預(yù)冷的1×PBS緩沖液，使用勻漿機(jī)充分勻漿后5 000 r/min低溫離心10 min，取上清進(jìn)行檢測(cè)。所有試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，通過(guò)全功能微孔板檢測(cè)儀（BioTek, Vermont, USA）進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 腸道屏障基因mRNA表達(dá)量的測(cè)定 使用TRIzol RNA提取試劑（Thermo Scientific, Wilmington, USA）提取結(jié)腸組織樣品的總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度。用TransScript? Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR，20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用NCBI Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。以為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR方法檢測(cè)腸道黏液蛋白基因及緊密連接蛋白基因、、和的相對(duì)表達(dá)量。采用2-ΔΔCt方法對(duì)qRT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4.3 腸道杯狀細(xì)胞染色及緊密連接蛋白免疫組化分析 腸道組織在4%多聚甲醛中固定24 h后，用乙醇和二甲苯梯度脫水，石蠟包埋后用切片機(jī)（Leica，M60，Germany）制作切片。切片進(jìn)行AB-PAS染色后檢測(cè)杯狀細(xì)胞數(shù)量。切片使用EVOS FL Auto成像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝。每組切片在高倍鏡下選擇15根長(zhǎng)度相近的小腸絨毛或大腸腺，使用Image-Pro Plus 6.0統(tǒng)計(jì)小腸絨毛和大腸腺的杯狀細(xì)胞數(shù)目。

使用ZO-1兔多克隆抗體（1﹕200，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）或Occludin兔多克隆抗體（1﹕200，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），進(jìn)行免疫組化切片染色，具體方法參照即用型SABC-POD（兔IgG）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。切片用蘇木精染色、酒精梯度脫水、封片。使用ImageJ軟件的IHC Profiler插件評(píng)估染色強(qiáng)度和每種強(qiáng)度下染色細(xì)胞的百分比。評(píng)分方法參照J(rèn)IN的研究[17]，免疫染色強(qiáng)度從0（無(wú)染色）到3（最強(qiáng)強(qiáng)度），將細(xì)胞百分比（0至100）乘以相應(yīng)的染色強(qiáng)度（0至3）以獲得免疫組化分?jǐn)?shù)。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供: VA 9000 IU，VB1 5 mg，VB210 mg，VB6 6 mg，VB12 0.05 mg，VD3 2000 IU，VE 50 IU，VK 6 mg, 生物素0.4 mg，泛酸鈣15 mg，煙酸30 mg，Cu 30 mg，F(xiàn)e 70 mg，Mn 30 mg，Zn 65 mg，I 0.5 mg，Se 0.3 mg。2)營(yíng)養(yǎng)水平為計(jì)算值，即某一營(yíng)養(yǎng)成分水平為各原料所占比例與該原料中這種營(yíng)養(yǎng)成分的乘積之和

1)The premix provided the following per kg of the diet: VA 9000 IU, VB1 5 mg, VB210 mg, VB6 6 mg, VB12 0.05 mg, VD3 2000 IU, VE 50 IU, VK 6 mg, Biotin 0.4 mg, Calcium pantothenate 15 mg, Nicotinic acid 30 mg, Cu 30 mg, Fe 70 mg, Mn 30 mg, Zn 65 mg, I 0.5 mg, and Se 0.3 mg.2)Nutrient levels were calculated values. The level of a certain nutrient component in diet was the sum of the product of the proportion of each raw material in diet and its certain nutrient component in the raw material

1.4.4 結(jié)腸內(nèi)容物微生物組分析 使用TIANamp細(xì)菌DNA試劑盒對(duì)結(jié)腸內(nèi)容物進(jìn)行總DNA的提取。PCR擴(kuò)增16S rRNA基因V3—V4區(qū)，引物為341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′- GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′）。使用AMPure XP Beads試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收并純化，在Illumina Hiseq2500平臺(tái)上進(jìn)行16S擴(kuò)增子測(cè)序。使用FASTP（version 0.18.0）對(duì)微生物組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，使用UPARSE（version 9.2.64）在97%水平下進(jìn)行OUT聚類(lèi)，使用UCHIME算法去除所有嵌合標(biāo)簽?；赨NITE數(shù)據(jù)庫(kù)（version 8.0），使用RDPclassifier（version 2.2）進(jìn)行物種注釋?zhuān)眯砰撝禐?.8。利用R語(yǔ)言包（psych，version 1.8.4)計(jì)算微生物豐度和基因表達(dá)量之間的spearman相關(guān)系數(shù)，使用Omicsmart在線平臺(tái)生成熱圖（http://www. omicsmart.com）。

1.4.5 結(jié)腸內(nèi)容物代謝組分析 使用Vanquish UHPLC系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific Inc., Germany）和Orbitrap Q ExactiveTM HF-X質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific Inc., Germany）對(duì)結(jié)腸內(nèi)容物進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。使用Compound Discoverer 3.1（Thermo Fisher Scientific Inc., Germany）處理UHPLC-MS/MS生成的原始數(shù)據(jù)文件，對(duì)每種代謝物進(jìn)行峰對(duì)齊、峰拾取，同時(shí)對(duì)峰面積進(jìn)行定量，再整合目標(biāo)離子。通過(guò)分子離子峰和碎片離子進(jìn)行分子式的預(yù)測(cè)并與mzCloud（https://www.mzcloud. org/）、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，用blank樣本去除背景離子，并對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化，最后得到數(shù)據(jù)的鑒定和定量結(jié)果。正離子模式和負(fù)離子模式下的代謝產(chǎn)物根據(jù)目標(biāo)代謝物篩選后組合成一組新的混合模式代謝集，然后進(jìn)行下一步分析。利用R語(yǔ)言包（psych，version 1.8.4）計(jì)算物種豐度和代謝物豐度之間的spearman相關(guān)系數(shù)，并繪制相關(guān)性熱圖。

表2 基因引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

腸道免疫因子及杯狀細(xì)胞數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件中的一般線性模型（GLM）進(jìn)行兩因素方差分析，分析模型包括品種、飼糧纖維水平及二者之間的互作效應(yīng)；腸道屏障指標(biāo)、微生物及代謝物豐度數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析。各處理組間利用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，＜0.01表示差異極顯著，＜0.05表示差異顯著，0.05＜＜0.10表示有差異顯著趨勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 腸道免疫因子含量

回腸、盲腸和結(jié)腸組織的IL-10、TNF-α、sIgA濃度如表3所示。對(duì)于MS豬，回腸IL-10含量在18N組顯著低于9N組，盲腸TNF-α含量在13.5N和22.5N組中顯著降低（＜0.05）；對(duì)于DLY豬，盲腸TNF-α含量在13.5N組顯著降低（＜0.05），但在22.5N組則顯著增加（＜0.05）。結(jié)腸免疫指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)顯著變化。盲腸TNF-α的飼糧主效應(yīng)、品種主效應(yīng)及其交互效應(yīng)顯著（＜0.01）。

2.2 腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量

十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量如表4所示。對(duì)于MS豬，空腸、回腸、盲腸中13.5N、18N、22.5N組的杯狀細(xì)胞數(shù)量均顯著高于9N組（＜0.01），結(jié)腸中13.5N、18N組的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于9N組（＜0.01）；對(duì)于DLY豬，十二指腸、空腸、盲腸中各處理組的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于9N組（＜0.01），回腸、結(jié)腸中18N、22.5N組杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于9N組（＜0.01）。各腸段的杯狀細(xì)胞數(shù)量的品種效應(yīng)顯著（＜0.01）。飼糧和品種的互作效應(yīng)對(duì)回腸和結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量影響顯著（＜0.01）。

2.3 腸道黏蛋白基因及緊密連接蛋白基因mRNA表達(dá)

由圖1可知，在MS豬和DLY豬中，與9N相比，13.5N和18N組結(jié)腸表達(dá)水平顯著提高，而22.5N組顯著降低了DLY的表達(dá)水平（＜0.05），MS豬和DLY豬均在18N組表達(dá)水平最高。對(duì)于MS豬，與9N組相比，各大豆皮處理組顯著提升了結(jié)腸的、、、表達(dá)水平（＜0.05），18N、22.5N組顯著提高了表達(dá)水平（＜0.05）。對(duì)于DLY豬，與9N組相比，、的表達(dá)水平在18N、22.5N組顯著降低，表達(dá)水平在大豆皮處理組中均顯著降低（＜0.05），表達(dá)水平僅在22.5N組顯著降低（＜0.05）。對(duì)于MS豬，18N、22.5N組的緊密連接蛋白基因表達(dá)水平相對(duì)較高；對(duì)于DLY豬，9N和13.5N組的緊密連接蛋白基因表達(dá)水平相對(duì)較高。

表3 飼糧纖維水平對(duì)豬腸道黏膜免疫因子含量的影響

同行數(shù)據(jù)標(biāo)字母相同或無(wú)字母表示差異不顯著(0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(＜0.05)。下同

In the same row, values without letter or with the same letters meant no significant difference (＞0.05), while with different small letters meant significant difference (＜0.05). The same as below

表4 飼糧纖維水平對(duì)豬腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

免疫組化結(jié)果顯示了Occludin和ZO-1蛋白在MS和DLY結(jié)腸中的分布（圖2-A，B），免疫組化評(píng)分反映了該蛋白的表達(dá)情況（圖2-C，D）。由圖可見(jiàn)，MS豬在18N和22.5N組免疫評(píng)分顯著升高，而DLY豬在18N和22.5N組免疫評(píng)分顯著降低。

2.4 結(jié)腸內(nèi)容物微生物組分析

2.4.1 物種組成分析 在保留至少1個(gè)樣本中物種豐度大于0.1%的條件下，MS和DLY豬分別篩選出90和86個(gè)屬分類(lèi)水平下的物種，在MS豬和DLY豬不同纖維水平處理中豐度排名前20的屬水平物種如表5、6所示。對(duì)于MS豬，與MS_9N組相比，MS_13.5N、MS_18N、MS_22.5N組的大腸埃希菌-志賀氏菌屬豐度顯著降低（＜0.05），分別降低了98.28%、98.18%、82.20%；MS_13.5N組中乳酸桿菌屬、MS_18N組中的普雷沃氏菌科_NK3B31屬、MS_22.5N組中的甲烷短桿菌屬的豐度顯著提高（＜0.05），且均成為該組的優(yōu)勢(shì)菌屬。對(duì)于DLY豬，與DLY_9N組相比，DLY_13.5N組的甲烷短桿菌屬、密螺旋體_2屬豐度顯著提高（＜0.05）；DLY_18N組的鏈球菌屬、瘤胃菌科UCG-014屬、擬普雷沃菌屬豐度均顯著提高（＜0.05）；DLY_22.5N組的毛螺菌屬豐度顯著提高（＜0.05）；4個(gè)纖維水平組的優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳酸桿菌屬。

不同小寫(xiě)字母表示不同纖維水平組差異顯著（P＜0.05）。下同

2.4.2 結(jié)腸微生物與腸道屏障基因表達(dá)量關(guān)聯(lián)分析 由圖3-A可知，對(duì)于MS豬來(lái)說(shuō)，普雷沃氏菌科_NK3B31屬、糞桿菌屬、毛螺菌屬、罕見(jiàn)小球菌屬、瘤胃菌科UCG-014屬、鏈球菌屬與表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（＜0.05）；考拉桿菌屬與表達(dá)量、毛螺菌屬與表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（＜0.05）；而大腸埃希菌-志賀氏菌屬、甲烷短桿菌屬、土孢桿菌屬與的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）；真桿菌屬、克里斯滕森菌科_R-7屬、密螺旋體_2屬乳酸桿菌屬、與緊密連接蛋白基因表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。由圖3-B可知，對(duì)于DLY來(lái)說(shuō)，鏈球菌屬、真桿菌屬、密螺旋體_2屬、克里斯滕森菌科_R-7屬與表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（＜0.05），而乳酸桿菌屬、瘤胃菌科UCG-005屬、巨型球菌與MUC2表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）；瘤胃菌科UCG-002屬、甲烷桿菌屬、梭狀芽孢桿菌科_sensu_stricto_1屬、毛螺菌科_XPB1014屬、艾克曼菌屬與緊密連接蛋白基因呈顯著正相關(guān)（＜0.05），毛螺菌屬、糞桿菌屬、瘤胃菌科UCG-014屬、擬普雷沃菌屬、瘤胃球菌_1屬與緊密連接蛋白基因呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。

表5 馬身豬不同纖維水平組豐度排名前20的屬

表6 杜長(zhǎng)大豬不同纖維水平組豐度排名前20的屬

2.5 結(jié)腸內(nèi)容物代謝組學(xué)分析

2.5.1 PLS-DA分析 筆者將正、負(fù)離子模式下的代謝物合并生成了新的代謝集，對(duì)所有代謝物進(jìn)行了PLS-DA分析。由圖4可知，在MS豬和DLY豬中，13.5N、18N、22.5N均與9N之間有明顯分離，各比較組的R2Y值和Q值均接近于1，表示模型具有良好的解釋能力和預(yù)測(cè)能力。

2.5.2 差異代謝物分析 筆者以PLS-DA模型中VIP＞1和T檢驗(yàn)＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選不同比較組間的差異代謝物。結(jié)果表明，MS_13.5N-vs-MS_9N、MS_18N-vs-MS_9N、MS_22.5N-vs-MS_9N比較組中分別有49、44、118種顯著上調(diào)的差異代謝物，有109、105、78種顯著下調(diào)的差異代謝物；DLY_13.5N-vs-DLY_9N、DLY_18N-vs-DLY_9N、DLY_22.5N-vs-DLY_9N比較組中分別有50、42、71種差異代謝物顯著上調(diào)，有72、135、68種差異代謝物顯著下調(diào)。差異代謝物主要包括脂肪?；?lèi)、類(lèi)固醇和類(lèi)固醇衍生物、羧酸及其衍生物等物質(zhì)。

MS豬和DLY豬不同比較組部分差異代謝物及差異倍數(shù)如表7、8所示。對(duì)于MS豬，與MS_9N組相比，棕櫚酸、硬脂酸、月桂酸、癸酸等脂肪酰類(lèi)物質(zhì)在MS_13.5N、MS_18N、MS_22.5N組中均顯著上調(diào)，其中月桂酸、癸酸在MS_18N組中上調(diào)倍數(shù)達(dá)到了16.22和24.33倍；石膽酸、膽酸在MS_13.5N、MS_18N、MS_22.5N組中均顯著下調(diào)；熊去氧膽酸、脫氧膽酸、甘膽酸在MS_13.5N、MS_18N組中均顯著下調(diào)，但在MS_22.5N組中顯著上調(diào)；L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、5-氧代脯氨酸在3個(gè)處理組中均顯著上調(diào)，L-谷氨酸、N6-乙酰-L-賴(lài)氨酸、L-焦谷氨酸在MS_13.5N、MS_18N組中均顯著上調(diào)，但在MS_22.5N組中顯著下調(diào)。對(duì)于DLY豬，與DLY_9N組相比，石膽酸在DLY_13.5N、DLY_18N、DLY_22.5N組中均顯著上調(diào)；脫氧膽酸、膽酸在DLY_13.5N、DLY_18N組中顯著下調(diào)；L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、苯丙氨酸、5-氧代脯氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-哌啶酸、N-乙酰-L-谷氨酸在DLY_13.5N、DLY_18N組中顯著上調(diào)，而在DLY_22.5N組中顯著下調(diào)。

圖3 結(jié)腸微生物豐度與腸道屏障相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

圖4 不同纖維水平組間的偏最小二乘判別分析（PLS-DA）

2.5.3 KEGG富集通路分析 圖5展示了各比較組的差異顯著的代謝通路（＜0.05）。對(duì)于MS豬，在MS_13.5N-vs-MS_9N中發(fā)現(xiàn)的差異代謝物顯著富集在脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、脂肪酸代謝等通路；在MS_18N-vs-MS_9N比較組中，不飽和脂肪酸的生物合成是差異代謝物主要富集的通路；在MS_22.5N- vs-MS_9N比較組中，膽汁分泌和碳水化合物消化和吸收這兩個(gè)通路顯著富集。對(duì)于DLY豬，苯丙氨酸代謝是DLY_13.5N-vs-DLY_9N比較組富集的代謝途徑；在DLY_18N-vs-DLY_9N比較組中，差異代謝物富集在唾液分泌和脂肪酸生物合成；碳水化合物消化和吸收是DLY_22.5N-vs-DLY_9N比較組代謝物顯著富集的通路。

免疫系統(tǒng)和免疫疾病通路上的差異代謝產(chǎn)物如表9所示，不同纖維水平組的代謝物的豐度如圖6所示。結(jié)果表明MS豬的環(huán)化GMP、花生四烯酸在MS_18N組的豐度最高，而膽鈣化醇在MS_18N組的豐度最低，這些代謝物主要富集在血小板活化、FcγR介導(dǎo)的吞噬作用、FcεRI信號(hào)通路、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎代謝通路上；對(duì)于DLY豬，環(huán)化GMP和前列腺素H2均在DLY_18N豐度最高。

2.5.4 微生物組與代謝組關(guān)聯(lián)分析 圖7展示了馬身豬和杜長(zhǎng)大豬前20個(gè)微生物菌屬與差異代謝產(chǎn)物的Spearman相關(guān)分析結(jié)果。在MS豬中，石膽酸與梭狀芽孢桿菌科_sensu_stricto_1屬和克里斯滕森菌科_R-7屬呈顯著正相關(guān)，脫氧膽酸、熊去氧膽酸和甘膽酸與土孢桿菌屬、大腸埃希菌-志賀氏菌屬呈顯著正相關(guān)，吲哚-3-乙酸與梭狀芽孢桿菌科_sensu_ stricto_1屬和大腸埃希菌-志賀氏菌屬呈顯著正相關(guān)。對(duì)于DLY豬，脫氧膽酸和膽酸與乳酸桿菌屬、瘤胃菌科UCG-005屬呈顯著正相關(guān)，3-（2-羥乙基）吲哚[3-(2-Hydroxyethyl)indole]與梭狀芽孢桿菌科_sensu_stricto_1屬呈顯著正相關(guān)。

3 討論

3.1 飼糧纖維水平對(duì)豬腸道屏障功能的影響

在無(wú)抗養(yǎng)殖的大環(huán)境下，維持畜禽的腸道健康是提高其生產(chǎn)性能及自身免疫力的關(guān)鍵。由腸道上皮、黏液層、腸道微生物等組成的腸道屏障能夠防止腸內(nèi)的有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素穿過(guò)腸黏膜進(jìn)入體內(nèi)，緊密連接蛋白是決定腸黏膜通透性和物理屏障功能的關(guān)鍵性因素[18]。腸道屏障受損會(huì)影響動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，造成微生物失調(diào)，腸道通透增強(qiáng)，致病菌入侵體內(nèi)的概率增大，容易引起腸道炎癥[19]。膳食纖維在預(yù)防腸道疾?。ǜ篂a、便秘和腸易激綜合征）和改善人類(lèi)和動(dòng)物的腸道健康方面發(fā)揮了重要作用[20]。對(duì)于高精料飼糧造成的結(jié)腸上皮屏障功能破壞的山羊模型來(lái)說(shuō)，飼喂大豆皮能夠促進(jìn)結(jié)腸上皮中、、和等的表達(dá)，說(shuō)明大豆皮纖維能夠逆轉(zhuǎn)高精料飲食對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞的損傷[21]。飼糧中添加燕麥麩皮明顯改善了豬回腸IL-10等免疫相關(guān)指標(biāo)，促進(jìn)了結(jié)腸黏蛋白等基因表達(dá)[9]。本研究中MS豬的腸道免疫因子水平基本保持在平衡狀態(tài)，13.5N、18N組的結(jié)腸表達(dá)水平均顯著提高，緊密連接蛋白的表達(dá)水平也在各纖維添加組有所提高，說(shuō)明飼糧纖維對(duì)MS豬腸道屏障功能起到促進(jìn)作用。DLY豬盲腸TNF-α含量在22.5N組顯著升高，這表明22.5N組盲腸上皮可能發(fā)生了輕微炎癥，這與前人研究中飼喂高谷物飼料造成山羊胃腸道上皮損傷，促炎細(xì)胞因子TNF-a、IL-1β和IL-6的基因表達(dá)水平上調(diào)的結(jié)果相似[22-24]，這說(shuō)明過(guò)高的纖維水平可能會(huì)導(dǎo)致胃腸道內(nèi)出現(xiàn)炎癥。此外DLY豬結(jié)腸緊密連接蛋白在18N和22.5N組表達(dá)降低，表明高纖維飼糧可能導(dǎo)致DLY豬結(jié)腸緊密連接屏障功能受損及通透性增加，其原因可能是由于高纖維日糧在DLY腸道內(nèi)發(fā)酵不充分，為DLY豬提供的能量及養(yǎng)分不足，造成了腸道營(yíng)養(yǎng)攝入異常，這與LI等[25]研究中提到的高纖維水平飼糧對(duì)豬腸道屏障功能造成的負(fù)面影響一致，因此利用纖維調(diào)節(jié)豬腸道健康時(shí)要注意纖維含量及豬品種等因素。

表7 馬身豬不同比較組部分差異代謝物及差異倍數(shù)

表8 杜長(zhǎng)大豬不同比較組差異代謝產(chǎn)物及差異倍數(shù)

表9 馬身豬和杜長(zhǎng)大豬富集在免疫系統(tǒng)通路上的差異代謝產(chǎn)物

圖5 不同纖維水平組的差異KEGG富集通路分析

圖6 免疫通路相關(guān)代謝物在不同纖維水平組的豐度值

3.2 飼糧纖維水平對(duì)結(jié)腸微生物的影響

腸道內(nèi)的微生物區(qū)系通過(guò)發(fā)酵利用飼糧中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，協(xié)助宿主進(jìn)行消化代謝，為腸道上皮細(xì)胞提供充足的能量和營(yíng)養(yǎng)[26]。飼糧纖維能夠優(yōu)化微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益菌的增殖，抑制有害菌的生長(zhǎng)。MS_13.5N、MS_18N和MS_22.5N組有害菌大腸埃希菌-志賀氏菌屬和梭狀芽孢桿菌科_sensu_stricto_1屬的豐度顯著降低。大腸埃希菌-志賀氏菌屬可引起動(dòng)物的嚴(yán)重腹瀉，NDF水平提高到13.5%和18%時(shí)，能夠有效降低致病菌的豐度。梭狀芽孢桿菌科_sensu_ stricto_1屬是偽膜性腸炎和抗生素相關(guān)性腹瀉的致病菌，在腸道內(nèi)過(guò)多繁殖并釋放毒素，導(dǎo)致腸道感染[27]。MS_18N組的普雷沃氏菌科_NK3B31屬、MS_22.5N組和DLY_13.5N組的甲烷短桿菌屬、理研氏菌科_RC9屬、DLY_13.5N組的克里斯滕森菌科_R-7屬的豐度均顯著升高。瘤胃菌科UCG-005屬、理研氏菌科_RC9屬、普雷沃氏菌科_NK3B31屬均是與纖維發(fā)酵有關(guān)的菌群，有益菌克里斯滕森菌科_R-7屬?gòu)V泛存在于腸道中，對(duì)維護(hù)腸道健康起重要作用[28-29]。甲烷短桿菌屬是氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷生成途徑中最重要的產(chǎn)甲烷菌，飼糧纖維可增加豬后腸甲烷短桿菌，細(xì)菌產(chǎn)生的氫被甲烷細(xì)菌消耗，進(jìn)而促進(jìn)纖維的降解[30]。宿主與腸道微生物的相互作用對(duì)腸道健康具有重要意義。本研究中在結(jié)腸微生物與結(jié)腸屏障相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)部分腸道菌群與腸屏障相關(guān)基因呈現(xiàn)正相關(guān)。MS豬的瘤胃菌科UCG-014屬及糞桿菌屬、DLY豬的理研氏菌科_RC9屬均與表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。研究表明瘤胃菌科，糞桿菌屬及理研氏菌科_RC9屬均可通過(guò)促進(jìn)丁酸的產(chǎn)生[31]，進(jìn)而促進(jìn)黏蛋白的分泌來(lái)維持黏液屏障[32]。

3.3 飼糧纖維水平對(duì)結(jié)腸代謝產(chǎn)物的影響

不同纖維水平處理對(duì)結(jié)腸代謝產(chǎn)物有較大的影響。對(duì)于MS豬，13.5N、18N、22.5N與9N相比，差異代謝物大多為脂肪?；?lèi)、類(lèi)固醇和類(lèi)固醇衍生物、羧酸及其衍生類(lèi)物質(zhì)，主要富集到的代謝通路也大多在脂肪酸代謝通路上。這與前人研究中膳食纖維調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的結(jié)果是一致的[13,33]。其次在MS豬各處理組中2-羥基苯丙氨酸、D-半乳糖均發(fā)生富集，這兩種物質(zhì)均參與碳水化合物消化和吸收。碳水化合物的消化和吸收對(duì)機(jī)體能量代謝具有重要意義[34]，因此飼糧中添加纖維能夠促進(jìn)MS豬機(jī)體的能量代謝。對(duì)于DLY豬，差異代謝物大多富集在苯丙氨酸代謝、唾液分泌、脂肪酸生物合成、碳水化合物消化和吸收通路。甲基咪唑乙酸和氫化肉桂酸分別是組氨酸和苯丙氨酸代謝的主要代謝產(chǎn)物[35-36]，說(shuō)明在高纖維組中DLY豬的氨基酸代謝較為活躍。與免疫系統(tǒng)相關(guān)的代謝通路上發(fā)現(xiàn)了環(huán)化GMP、花生四烯酸及前列腺素H2等3種差異代謝產(chǎn)物，且這3種代謝產(chǎn)物在18N組豐度最高。研究表明血小板除止血作用外，也是免疫系統(tǒng)的組成部分，活化的血小板產(chǎn)生可溶性因子并直接與免疫細(xì)胞相互作用，進(jìn)而調(diào)控炎癥與免疫反應(yīng)[37]。由FcγR產(chǎn)生的刺激或抑制信號(hào)會(huì)導(dǎo)致共刺激分子和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)對(duì)抗原的反應(yīng)[38]。以上結(jié)果表明MS和DLY豬均在18N組的免疫反應(yīng)較強(qiáng)。

宿主與腸道微生物的相互作用對(duì)腸道健康具有重要意義，腸道微生物參與腸道代謝物的合成、消化、發(fā)酵和次級(jí)代謝過(guò)程[39]。已有研究表明除了由腸道菌群發(fā)酵纖維產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，膽汁酸和色氨酸在被腸道微生物轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的代謝物也在腸道健康中發(fā)揮著重要作用[40-41]，因此筆者在代謝組學(xué)中篩選了色氨酸代謝和膽汁酸代謝通路上富集到的代謝產(chǎn)物，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)這些代謝物與結(jié)腸微生物之間均存在很強(qiáng)的相關(guān)性。MS豬的色氨酸代謝產(chǎn)物吲哚-3-乙酸與梭狀芽孢桿菌科_sensu_stricto_1屬和大腸埃希菌-志賀氏菌屬呈正相關(guān)，DLY豬的3-（2-羥乙基）吲哚也與梭狀芽孢桿菌屬呈正相關(guān)。研究表明梭狀芽孢桿菌在氧化還原過(guò)程中生成吲哚乙酸[42]，大腸桿菌表達(dá)的色氨酸酶可以將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚[43]，而吲哚-3-乙酸和吲哚作為芳香烴受體的配體，以芳香烴受體依賴(lài)性方式調(diào)節(jié)腸道屏障完整性[44-45]，說(shuō)明腸道菌群能夠參與色氨酸代謝的吲哚途徑進(jìn)而維持腸道穩(wěn)態(tài)。對(duì)于MS豬和DLY豬的膽汁酸代謝產(chǎn)物，如石膽酸、脫氧膽酸、甘膽酸和膽酸等，與擬桿菌屬、乳酸菌屬、大腸桿菌屬、消化性鏈球菌屬及瘤胃球菌呈顯著正相關(guān)。擬桿菌、乳酸菌等參與膽汁酸去結(jié)合過(guò)程，梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌、消化性鏈球菌屬及瘤胃球菌參與C3、C7和C12羥基的氧化和差向異構(gòu)化等生物轉(zhuǎn)化過(guò)程[46]，通過(guò)水解脫羥作用將?；悄懰徂D(zhuǎn)化為脫氧膽酸，將甘氨鵝脫氧膽酸脫羥轉(zhuǎn)化成石膽酸，結(jié)合已發(fā)表的研究中膽汁酸及其受體對(duì)腸屏障功能的改善作用[47]，表明微生物可能會(huì)通過(guò)參與膽汁酸代謝來(lái)影響腸道屏障功能。本試驗(yàn)結(jié)果提示改變飼糧纖維水平能夠通過(guò)微生物途徑調(diào)節(jié)腸道內(nèi)色氨酸及膽汁酸代謝進(jìn)而影響腸道免疫屏障功能，但具體的作用效果及調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

飼糧纖維能夠改善腸道健康，18% NDF和13.5% NDF飼糧分別對(duì)馬身豬和杜×長(zhǎng)×大三元雜交豬的腸道免疫功能和腸道屏障功能有促進(jìn)作用。對(duì)于馬身豬，18N組的腸道免疫因子含量降低，及緊密連接蛋白基因表達(dá)量升高，普雷沃氏菌科_NK3B31屬等有益菌豐度提高，大腸埃希菌-志賀氏菌屬等有害菌豐度降低。對(duì)于杜長(zhǎng)大豬，13.5N組的促炎因子TNF-α含量降低，表達(dá)量升高，克里斯滕森菌科_R-7屬等有益菌豐度提高。其次，腸道微生物豐度與腸道屏障基因表達(dá)量以及與膽汁酸和色氨酸代謝通路上的關(guān)鍵代謝物豐度之間均表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，說(shuō)明飼糧纖維水平通過(guò)影響腸道微生物對(duì)短鏈脂肪酸、膽汁酸及色氨酸代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)來(lái)增強(qiáng)腸道屏障功能。因此，飼糧中纖維的添加量應(yīng)根據(jù)豬品種及特性進(jìn)行調(diào)整，才能充分發(fā)揮纖維對(duì)腸道的積極作用。

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Effects of Dietary Fiber Level on Intestinal Barrier Function, Colonic Microbiota and Metabolites in Pigs

LIU Chang1, CUI ZiXu1, ZUO Zhou1, YUN HongMei2, NIU Jin1, YANG Yang1, GUO XiaoHong1, LI BuGao1, GAO PengFei1, ZHAO Yan1, CAO GuoQing1

1College of Animal Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Shanxi Animal Husbandry Technology Extension Service Center, Taiyuan 030001, Shanxi

【Objective】Adding fiber raw materials is one of the effective methods to reduce the feed costs. The aim of this study was to investigate the effects of different fiber level diets on the intestinal health of Mashen (MS) pig and Duroc × Landrace × Large (DLY) pig, so as to provide the basis for the rational use of fiber. 【Method】In this study, 80 MS pigs and 80 DLY pigs with an initial body weight of (20 ± 0.5) kg were used as test objects (half of the sows and half of the boars). MS and DLY pigs were divided into four groups each assigned to different diets, with five replicates per treatment and four pigs per replicate. When 0%, 9.35%, 18.64% and 28.03% soybean hulls were added to the corn soybean meal basal diet, the NDF content was 9% (9N), 13.5% (13.5N), 18% (18N) and 22.5% (22.5N), respectively. The test lasted for 30 days. 【Result】 For MS pigs, the content of IL-10 in ileum of 18N group and TNF-α in cecum of 13.5N and 22.5N groups was significantly decreased (＜0.05). The number of goblet cells in jejunum, ileum and caecum was increased with the increase of fiber level. In colon, the number of goblet cells and the expression level ofwere significantly increased in 13.5N and 18N groups (＜0.05). The expressions of,,,, andof 18N and 22.5N groups were increased significantly (＜0.05). The abundance ofin 13.5N, 18N and 22.5N groups were decreased significantly (＜0.05), while the abundance ofin 13.5N group,in 18N group andin 22.5N group were increased significantly (＜0.05). Palmitic acid, stearic acid, lauric acid and capric acid in 13.5N, 18N and 22.5N groups were significantly increased (＜0.05), while lithocholic acid and cholic acid were significantly decreased (＜0.05). Differential metabolites were mainly concentrated in the pathways related to lipid metabolism and carbohydrate digestion and absorption. For DLY pigs, the TNF-α content in cecum of 13.5N group was significantly increased (＜0.05). The number of goblet cells in each intestinal segment of 13.5N, 18N and 22.5N groups was significantly higher than those of 9N group (＜0.05). The expression level of colonicwas increased significantly in 13.5N and 18N groups (＜0.05) and decreased significantly in 22.5N group (＜0.05). The expression levels of,andsignificantly (＜0.05). The abundance ofin 13.5N group,in 18N group andin 22.5N group was significantly increased (＜0.05). L-tyrosine, L-glutamic acid, L-pyroglutamic acid, phenylalanine and other derivatives in 13.5N, 18N group were significantly increased (＜0.05), while significantly decreased (＜0.05) in 22.5N group. Differential metabolites were mainly concentrated in amino acid metabolism pathway. In MS pigs and DLY pigs, there was a strong correlation between microflora and intestinal barrier related genes, as well as tryptophan and bile acid metabolites. 【Conclusion】 Improving the dietary fiber level could strengthen the intestinal barrier function of pigs, increase the abundance of beneficial bacteria, reduce the abundance of harmful bacteria, regulate the metabolism of lipid and amino acids in the colon, affect the metabolism of short-chain fatty acids, tryptophan and bile acids through the microbial pathway, and promote intestinal health.

dietary fiber level; intestinal barrier; microbiota; metabolites; pig

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.22.014

2023-02-12；

2023-04-13

山西省高等學(xué)?？茖W(xué)研究?jī)?yōu)秀成果培育項(xiàng)目、山西省研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（2021Y345）、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物育種工程項(xiàng)目（YZGC128）、三晉學(xué)者支持計(jì)劃專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助（2016；2017）、山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)

劉暢，E-mail：lc53857983@163.com。通信作者曹果清，E-mail：anniecao710502@aliyun.com。通信作者趙燕，E-mail：zhaoyan@sxau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）