摘要：目的 篩選雞胚胎期肌肉差異表達長鏈非編碼RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）及mRNA，通過構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA競爭性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘肌內(nèi)脂肪形成的重要候選基因。方法 分別采集玫瑰冠雞、科寶雞胚胎期的肌肉組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，利用生物信息學(xué)方法篩選差異表達lncRNA、miRNA和mRNA，對差異表達基因GO富集及KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析，同時預(yù)測lncRNA-miRNA、miRNA-mRNA之間的靶標關(guān)系，結(jié)合基因表達分析，構(gòu)建可能與肌內(nèi)脂肪形成相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA競爭性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用qRT-PCR驗證測序數(shù)據(jù)的準確性。結(jié)果 玫瑰冠雞、科寶雞的胸肌、腿肌間共差異表達的lncRNA、miRNA和mRNA分別是5個、225個和146個，GO和KEGG結(jié)果表明靶基因均富集在脂代謝或脂生成相關(guān)信號通路上，構(gòu)建由4個lncRNA、6個miRNA和6個mRNA組成16個節(jié)點的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)論 成功構(gòu)建雞肌內(nèi)脂肪形成相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進一步探究肌內(nèi)脂肪形成的相關(guān)分子調(diào)控機制提供參考依據(jù)，對今后優(yōu)質(zhì)肉雞的選育奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞；胚胎期；肌內(nèi)脂肪；lncRNA；ceRNA

中圖分類號：S828文獻標志碼：文獻標識碼A

Construction of LncRNA-related CeRNA network for intramuscular fat formation in chicken embryo

SUN" Nanzhen，WANG" Jiajun，CHEN" Ruonan，SUN" Jie*

（College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： "Objective The aim of this study was to screen the differential expression of long non-coding RNA（lncRNA）， microRNA（miRNA） and mRNA in chicken embryonic muscle. And to explore the important candidate genes of intramuscular fat formation by constructing lncRNA-miRNA-mRNA competitive regulatory network. Methods In this study， the muscle tissues of Rose Crown chicken and Cobb chicken at embryonic period were collected for transcriptome sequencing， and the differentially expressed lncRNA， miRNA and mRNA were screened by bioinformatics methods. We analyzed the GO enrichment and KEGG signal transduction pathway of differentially expressed genes， and then predicted the target relationship between lncRNA-miRNA and miRNA-mRNA. Combined with gene expression analysis， a lncRNA-miRNA-mRNA competitive regulatory network that may be related to the formation of intramuscular fat was constructed， and used qRT-PCR to verify the accuracy of the sequencing data. Results The results showed that there were 5 lncRNAs， 225 miRNAs and 146 mRNAs common differentially expressed between breast and leg muscles of Rose crowned chicken and Cobb chicken. GO and KEGG results showed that the target genes were enriched in the signaling pathways related to lipid metabolism or adipogenesis. A 16-node ceRNA regulatory network consisting of 4 lncRNAs， 6 miRNAs and 6 mRNAs was constructed. Conclusions The ceRNA regulatory network of chicken intramuscular fat formation was successfully constructed. This study provided a reference for further exploring the molecular regulation mechanism of intramuscular fat formation. And laid a foundation for the breeding of high-quality broilers in the future.

Key words： chicken;embryonic period;intramuscular fat;lncRNA;ceRNA

人們對肉的需求從以前的數(shù)量轉(zhuǎn)向現(xiàn)在的質(zhì)量，風(fēng)味、色澤及口感等是評價肉品質(zhì)的重要指標，研究發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)脂肪能夠降低肌肉的剪切力、提高肉質(zhì)嫩度以及對肉的多汁性和風(fēng)味起重要作用［1］。而動物體內(nèi)脂肪沉積是一個很復(fù)雜的生物學(xué)過程，不僅受能量水平、蛋白質(zhì)、維生素、脂肪酸、酶、激素等影響，遺傳因素也是極其重要的內(nèi)容。為了提供高品質(zhì)肉，育種者從基因著手尋找能夠增加肌內(nèi)脂肪的調(diào)控因子。據(jù)報道肌內(nèi)脂肪是中等遺傳力的性狀［2］，不同品種的雞脂肪沉積具有顯著差異。家禽脂肪細胞來源于間充質(zhì)干細胞，胚胎期中期肌內(nèi)脂肪開始形成，出雛生長后期則只能通過增大脂肪細胞的體積來增加脂肪的含量［1］，且課題組前期結(jié)果表明，玫瑰冠雞和科寶雞的腿肌、胸肌分別在7、8胚齡開始沉積［3］，因此認為胚胎期作為脂肪生長發(fā)育的關(guān)鍵時期對最終的脂肪含量有決定性作用，但其潛在的分子調(diào)控機制所知甚少。

2011年提出了“競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）”假說［4］，即lncRNA、環(huán)形RNA（circRNA）可以作為分子海綿，通過吸附miRNA發(fā)揮ceRNA的作用，對miRNA的功能產(chǎn)生影響，從而調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達水平，最終調(diào)控各種生物學(xué)功能。近幾年ceRNA在脂肪沉積過程中的研究逐漸增多，lncRNAIMFNCR能競爭性結(jié)合miR-128-3p和miR-27b-3p，從而導(dǎo)致靶基因PPARγ表達水平上升，促進雞脂肪細胞分化［5］。miRNA-2l5-5p通過靶向NCOA3負調(diào)控雞腹部脂肪形成，而gga-circ-0002520能夠降低miRNA-215-5p對NCOA3的抑制作用［6］。lncRNA-FNIP2作為miR-24-3p的競爭性分子海綿影響靶基因FNIP2的表達水平，從而促進雞前脂肪細胞脂質(zhì)合成［7］。

玫瑰冠雞有巨大且鮮紅的桑葚狀冠型，因其良好的肉品質(zhì)及獨特的風(fēng)味深受人們喜愛，肉質(zhì)鮮美，極具食用和觀賞價值［8］。鑒于ceRNA在雞胚胎期肌內(nèi)脂肪形成方面的研究較少，本文通過鑒定新疆本土肉品質(zhì)較好的玫瑰冠雞和快大型肉雞科寶雞胚胎期肌肉中差異表達的lncRNA、miRNA，并對其靶基因進行預(yù)測和功能富集，構(gòu)建肌內(nèi)脂肪相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)研究非編碼RNA調(diào)控胚胎期肌內(nèi)脂肪形成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本選擇

本試驗所用玫瑰冠雞、科寶雞種蛋分別由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院實驗站和新疆泰昆種雞場提供，常規(guī)程序孵化。采集玫瑰冠雞（M）、科寶雞（K）胚胎期第7天腿?。═）和第8天的胸?。╔），所得樣品置于Trizol試劑（Thermo Scientific，美國）中，隨后放入液氮中保存，MX、KX、MT和KT每組3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

Trizol法提取胸肌、腿肌總RNA，并采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳、DanoPhotometer分光光度計（IMPLEN，CA，USA）、Qubit和Bioanalyzer 2100測定RNA的質(zhì)量、濃度及完整性。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后構(gòu)建文庫并利用Illumina Hiseq 4000測序儀進行高通量測序，這一工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 測序數(shù)據(jù)分析

FastQC、NGSQC Toolkit軟件評估測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量并篩選，剔除原始序列數(shù)據(jù)包含接頭及質(zhì)量較低的序列，得到Clean reads數(shù)據(jù)。Bowti2和HISAT2 v2.0.4軟件把過濾測序數(shù)據(jù)同雞參考基因組比對，然后用StringTie（v1.3.1）進行組裝。最后使用Pfam-sca（E-value＜0.001）、CPC（score＜0）和CNCI（score＜0）編碼能力預(yù)測軟件預(yù)測lncRNA，用miREvo和mirDeep2軟件預(yù)測miRNA。

1.4 差異表達分析

Cuffdiffv2.1.1軟件定量分析lncRNA、miRNA及mRNA，R包edgeR、DESeq2進行差異表達分析，篩選2組中表達量logFC＞2以及FDR≤0.05。

1.5 LncRNA、miRNA的靶基因預(yù)測和功能分析

搜索lncRNA上、下游100kb內(nèi)的順式靶基因，選擇Pearson相關(guān)系數(shù)（r＞0.95）的靶標作為潛在反式靶基因。對差異表達基因進行spearman相關(guān)性分析。Targetscan、miRanda軟件預(yù)測miRNA的靶基因。使用GOseq（http：//www.geneontology.org/）對靶基因進行GO注釋，Kobas2.0進行KEGG功能富集分析，P值≤0.05則富集程度達到顯著，最后得到的結(jié)果用R包ggplot2進行繪圖。

1.6 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用miRanda軟件預(yù)測差異表達lncRNA與miRNA的靶向關(guān)系，結(jié)合各自的靶基因，篩選出與脂肪相關(guān)的互作關(guān)系對構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最后用cytoscape軟件對ceRNA網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.7 測序結(jié)果驗證

測序數(shù)據(jù)庫中隨機挑選lncRNA、miRNA和mRNA各8個，利用實時熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）驗證測序結(jié)果的準確性，定量所用引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達lncRNA、miRNA與mRNA的鑒定

本研究在MXvsKX中鑒定出差異表達lncRNA127個，MTvsKT中25個，差異表達分析后得到5個lncRNA在MX、KX、MT和KT間共差異表達（圖1A）。同時在MXvsKX、MTvsKT中分別鑒定出280、335個差異表達miRNA，225個共差異表達miRNA（圖1B）。在4個組中共差異表達基因146個（圖1C）。

2.2 LncRNA靶基因的功能富集分析

對差異表達lncRNA的靶基因進行GO功能富集分析，結(jié)果表明其顯著富集在代謝過程、基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、細胞大分子分解代謝過程、mRNA轉(zhuǎn)運等生物學(xué)過程；細胞成分富集在核糖體細胞成分、大分子復(fù)合物細胞組分、細胞外膜、纖維蛋白復(fù)合物和線粒體內(nèi)膜等；分子功能中富集到RNA結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子活性、翻譯因子活性、酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、脂肪酸結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合（圖2A）。

KEGG通路分析表明，部分基因顯著富集在脂肪生成相關(guān)通路上：類固醇激素生物合成、PPAR信號通路、亞油酸代謝等通路（圖2B）。

2.3 miRNA靶基因的功能富集分析

對差異表達miRNA的靶基因進行GO和KEGG富集分析，GO分析表明部分基因顯著富集于生物合成過程、轉(zhuǎn)錄過程、細胞增殖和分化、調(diào)控核酸結(jié)合的分子功能（圖3A）。KEGG通路分析表明，miRNA"" 靶基因顯著富集于TGF-β信號通路、Notch信號通路、Hedgehog信號通路、脂肪酸降解等通路（圖3B），這些均是脂肪代謝相關(guān)的經(jīng)典信號通路，這表明本實驗篩選到的miRNA可能通過上述信號通路參與調(diào)控雞胚胎期肌內(nèi)脂肪形成。

2.4 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

不同組別間篩選共差異表達lncRNA及其競爭性結(jié)合的miRNA，再篩選與脂肪形成相關(guān)的靶基因，分別對lncRNA、miRNA和靶基因進行表達分析，構(gòu)建出與肌內(nèi)脂肪形成相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中包含4個lncRNA、6個miRNA和6個mRNA（圖4）。以科寶雞為參照，lncRNA有2個表達下調(diào)，2個上調(diào)，且均是已注釋lncRNA。miRNA有2個表達上調(diào)，4個表達下調(diào)，都具有較高的差異表達倍數(shù)，其中g(shù)ga-miR-402屬于新發(fā)現(xiàn)的miRNA，其余5個已注釋miRNA中g(shù)ga-miR-1677-5p和gga-miR-103-3p已被證實能調(diào)控脂肪生成。該ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中靶基因的表達有3個上調(diào)3個下調(diào)，且均富集到脂肪生成或脂肪代謝相關(guān)信號通路中。

2.5 實時熒光定量PCR驗證

qRT-PCR驗證隨機挑選的lncRNA、miRNA和mRNA，結(jié)果如圖5所示，測序結(jié)果和定量實驗結(jié)果差異倍數(shù)存在偏差，但表達趨勢相同，表明測序數(shù)據(jù)較為準確可靠。

3 討論

ceRNA作為新生領(lǐng)域成為近幾年的研究熱點，發(fā)現(xiàn)其參與多種生物學(xué)過程，例如癌癥發(fā)生、肌細胞分化和脂肪細胞分化等。lncRNAKCNMB2-AS1能夠競爭性吸附miR-509-3p，使得靶基因核糖體蛋白S6激酶A1（RPS6KA1）的表達水平升高，并且發(fā)現(xiàn)RPS6KA1是mTOR信號通路中的重要基因，所以KCNMB2-AS1-miR-509-3p-RPS6KA1可能是通過mTOR信號通路來影響非小細胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展［9］。在小鼠成肌細胞中，lncRNAMalat1通過吸附miR-129-5p從而調(diào)控下游基因肌細胞增強因子2A（Mef2a），促進成肌細胞分化及慢肌基因肌球蛋白重鏈1（MyHCI）的表達［10］。為了探究lncRNANEAT1對間充質(zhì)干細胞（MSCs）成脂分化的作用，姚明康［11］在鼠和人來源的MSCs成脂分化過程中成功驗證了lncRNANEAT1競爭性結(jié)合miR-875-3p，影響了過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的表達從而促進MSCs成脂分化。

lncRNA作為競爭性分子海綿吸附miRNA來調(diào)控mRNA的表達在很多物種中的研究較成熟，但雞胚胎期肌內(nèi)脂肪形成相關(guān)lncRNA的功能所知甚少，因此從高差異表達lncRNA、miRNA和脂肪相關(guān)的靶基因來構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)驗證其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。此ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共16個節(jié)點產(chǎn)生10個相互作用，分別是lnc-PACS2-gga-miR-1677-5p-FLVCR1、lnc-PACS2-gga-miR-3530-5p-MYL4、lnc-PACS2-gga-miR-6659-3p-ADAMTS1、lnc-DNAJC3-gga-miR-3530-5p-MYL4、lnc-DNAJC3-gga-miR-1677-5p-FLVCR1、lnc-ECM1-gga-miR-103-3p-UQCRC2、lnc-ECM1-gga-miR-3530-5p-MYL4、lnc-ECM1-gga-miR-3523-MYL4、1nc-GNG7-gga-miR-402-LDB1、lnc-GNG7-gga-miR-402-PFDN5。

研究表明gga-miR-1677-5p能夠抑制細胞增殖，并且抑制雞前脂肪細胞的分化過程［12］，而預(yù)測靶基因FLVCR1是血紅素轉(zhuǎn)運蛋白1，該基因與2型糖尿病患者的全身性葡萄糖代謝有關(guān)，和與胰島素敏感性呈負相關(guān)［13］。因此lnc-PACS2、lnc-DNAJC3可能是通過競爭性吸附gga-miR-1677-5p促進FLVCR1的表達進而增加脂肪生成。gga-miR-103-3p在固始雞中預(yù)測與肌內(nèi)脂肪沉積有關(guān)［14］，能顯著增加小鼠肝組織中脂滴的積累和脂質(zhì)代謝異常［15］。UQCRC2是泛醇-細胞色素c還原酶核心蛋白2，在白色脂肪細胞中作為線粒體活性代表物質(zhì)對脂質(zhì)代謝很重要［16］。通過它們之間的靶向關(guān)系預(yù)測lnc-ECM1競爭性結(jié)合gga-miR-103-3p促使UQCRC2表達水平升高，進而抑制脂滴合成。一種具有血小板反應(yīng)蛋白基序的去整合素和金屬蛋白酶（ADAMTS1）被預(yù)測能夠影響奶牛乳脂代謝［17］，該基因在小鼠脂肪組織中敲除后造成脂肪組織脂質(zhì)增加，胰島素敏感性降低，脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)被破壞，表明ADAMTS1能夠維持細胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)脂肪細胞分化和脂肪組織的生成［18］，因此可以猜測gga-miR-6659-3p促進脂肪細胞分化的其中一條途徑是通過降低ADAMTS1的表達水平實現(xiàn)的，而lnc-PACS2通過競爭性吸附gga-miR-6659-3p減少gga-miR-6659-3p對ADAMTS1的抑制作用。棕色脂肪細胞中含有大量的線粒體，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪含量和產(chǎn)熱的功能，對肥胖有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)LIM域綁定1（LDB1）基因在小鼠和人的棕色脂肪細胞中高表達，與棕色脂肪功能調(diào)節(jié)有關(guān)，使得脂肪細胞更大更多［19］。lnc-GNG7與未注釋的gga-miR-402有結(jié)合位點，預(yù)測它作為競爭性RNA能夠促進靶基因LDB1的表達水平，進而促進脂肪細胞分化。MYL4基因是肌球蛋白輕鏈家族成員之一，該家族中多數(shù)基因與肌細胞發(fā)育和肌纖維分化有關(guān)，少數(shù)也被證明與脂肪細胞分化相關(guān)，且在不同物種間的生物學(xué)功能研究存在差異。例如MYL2磷酸化能夠促進棕色脂肪前體細胞分化，抑制棕色脂肪白色化，對改善小鼠肥胖起重要作用［20］，但在牛物種中MYL2則與肌肉發(fā)育相關(guān)［21］?；騇YL4在寧鄉(xiāng)豬皮下脂肪中差異表達，可能與脂肪沉積有關(guān)［22］，推測MYL4在雞上也有相似的功能。對山羊腎周脂肪組織RNA-seq鑒定，前折疊蛋白亞基5（PFDN5）被認為是棕色脂肪組織向白色脂肪組織過渡過程中最為合適的參考基因之一［23］。本研究篩選到多個調(diào)控雞肌內(nèi)脂肪形成的lncRNA-miRNA-mRNA，但其在肌內(nèi)脂肪形成過程中的具體功能仍需進一步實驗驗證。

本研究在玫瑰冠雞和科寶雞的胸肌、腿肌間鑒定出共差異表達lncRNA5個、miRNA225個及mRNA146個。成功構(gòu)建雞肌內(nèi)脂肪形成lncRNA相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括16個節(jié)點和10個相互作用。該結(jié)果為進一步探究雞胚胎期肌內(nèi)脂肪形成的分子調(diào)控機制提供了參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）