摘要： 為了考察金線蓮多糖對(duì)糖尿病小鼠腎損傷的改善作用，將糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組及高、低劑量金線蓮多糖組（100和300 mg·kg-1），給藥4周后測定小鼠血清生化指標(biāo)、炎癥因子及腎皮質(zhì)中的蛋白表達(dá)，并觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果表明：與正常組比，模型組小鼠24 h的尿蛋白質(zhì)量，血肌酐濃度、丙二醛濃度、炎癥因子顯著升高，而血清超氧化物歧化酶活力顯著下降；模型組小鼠腎組織p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，podocin，Nephrin的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)；組織學(xué)檢查顯示模型組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)異常改變；經(jīng)金線蓮多糖干預(yù)后，糖尿病小鼠血清生化指標(biāo)、腎組織中蛋白表達(dá)均明顯逆轉(zhuǎn)，組織學(xué)檢查也顯示糖尿病小鼠腎損傷明顯改善。

關(guān)鍵詞： 金線蓮多糖； 糖尿??； 腎損傷； NF-κB信號(hào)通路

中圖分類號(hào)： R 965.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A"" 文章編號(hào)： 1000-5013（2024）05-0635-07

Improvement Effects of Anoectochilus roxburghii Polysaccharose on Renal Injury in Diabetic Mice by Inhibiting NF-кB Signaling Pathway

Abstract： To investigate the improvement effect of Anoectochilus roxburghii polysaccharide on renal injury in diabetic mice， the diabetic mice were randomly divided into model group， metformin group and Anoectochilus roxburghii polysaccharide groups （100 and 300 mg·kg-1）. After 4 weeks of treatment， the serum biochemical indexes， inflammatory factors and protein expression in renal cortex of the mice were measured， and the renal morphological changes were observed. The results showed that compared with the control group， 24-hour urine protein mass， serum creatinine concentration， malondialdehyde content and inflammatory factors of mice in model group were significantly increased， while serum superoxide dismutase activity was significantly decreased. The protein expression of p-NF-κB p65 in renal tissue of model group was significantly up-regulated， and the protein expressions of podocin and Nephrin were significantly down-regulated. Histological examination showed abnormal changes of renal tissue structure of mice in model group. The serum biochemical indexes and protein expression in kidney tissue of diabetic mice were significantly reversed after the intervention of the Anoectochilus roxburghii polysaccharide， and the histological examination also showed that the kidney injury of diabetic mice treated with Anoectochilus roxburghii polysaccharide was significantly improved.

Keywords：Anoectochilus roxburghii polysaccharose； diabetes； renal injure； NF-κB signaling pathway

糖尿病腎病是糖尿病最常見的綜合癥。在持續(xù)高血糖的毒性作用下糖尿病患者腎臟的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致腎小球高濾過，尿蛋白增加及腎臟損傷［1］。腎小球?yàn)V過屏障異常，蛋白尿的出現(xiàn)是糖尿病腎病早期標(biāo)志性的臨床表現(xiàn)。足細(xì)胞及其足突之間的裂孔隔膜構(gòu)成濾過屏障的最外層，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常是蛋白尿發(fā)生的重要原因。足細(xì)胞的足突間交叉形成裂孔，其上覆蓋的隔膜中表達(dá)多種特異性蛋白，podocin和Nephrin是裂孔膜上的重要蛋白分子，對(duì)維持裂孔膜的完成整性起關(guān)鍵作用。如果足細(xì)胞的特征性蛋白丟失，裂孔間隙就會(huì)變大，引起腎小球?yàn)V過屏障高滲漏，蛋白就進(jìn)入尿液，形成蛋白尿［2］。引起糖尿病腎病的機(jī)制復(fù)雜，目前臨床上還沒有理想的治療糖尿病腎病的特異性藥物。

金線蓮是蘭科開唇屬的多年生草本植物，在我國主要分布于福建、江西、臺(tái)灣等地。金線蓮性平味甘，具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕的功效［2］，且無毒副作用，在民間常用于治療腎炎、糖尿病、高血壓等病癥［3］。金線蓮多糖是金線蓮的主要有效成分之一，以往的研究顯示，金線蓮多糖有很好的降血糖、降血脂等作用［4-5］。金線蓮多糖能保護(hù)糖尿病小鼠的腎組織［6］，但金線蓮多糖是否能通過改善糖尿病小鼠的腎小球過濾屏障而改善腎功能還未見研究?；诖耍疚难芯拷鹁€蓮多糖通過抑制NF-κB信號(hào)通路對(duì)糖尿病小鼠腎損傷的改善作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料與試劑

金線蓮原植物（福建省佳晟生物有限公司）；二甲雙胍腸溶片（0.25 mg·片-1，貴州天安藥業(yè)股份有限公司），藥物均采用蒸餾水現(xiàn)配現(xiàn)用。金線蓮多糖（Anoectochilus roxburghii polysaccharose，ARP）由蘭州大學(xué)功能有機(jī)分子化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取、鑒定并提供［6］，純度≥95%。

鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；高脂飼料（HFD，按照20%脂肪、2%膽固醇、10%蔗糖、0.5%膽酸鈉、其他為基礎(chǔ)鼠飼料進(jìn)行配置）；尿蛋白、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、肌酐、IL-6試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒（南京建成生物公司）；p-NF-κB p65抗體（Affinity試劑公司）；Nephrin抗體、podocin抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；β-actin抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；二抗（上海圣克魯斯生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性ICR小鼠，體質(zhì)量為（18±2） g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK（閩）2016-0006。將小鼠置于溫度（22±2） ℃，濕度（50±5）%，光暗周期為12 h/12 h（光照時(shí)間7：00-19：00）的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由獲取飲水與飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始糖尿病模型的誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)遵守華僑大學(xué)倫研批第（A2019016）號(hào)審查要求。

1.3 儀器

超微量核酸蛋白測定儀（英國 Bio Drop公司）；M530型組織切片機(jī)（德國MEDITE公司）；MULTISKAN ASCENT-354型酶標(biāo)儀（美國熱電公司）；JY-SCZ2型垂直板電泳槽、JY300C型電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；Image Station 4000MM型化學(xué)發(fā)光成像儀（美國柯達(dá)公司）；快速血糖檢測儀（美國羅氏生物科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 2型糖尿病小鼠模型的建立

高脂飼料（HFD）/STZ誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠建模方法參考文獻(xiàn)［6］，即除正常組小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料外，其余小鼠給予HFD喂養(yǎng)3周，小鼠體質(zhì)量明顯增加后，將小鼠禁食不禁水12 h后，采用質(zhì)量比為130 mg·kg-1的STZ一次性腹腔注射。72 h后，測小鼠空腹血糖濃度。選擇血糖濃度≥11.1 mmol·L-1為糖尿病小鼠，血糖不達(dá)標(biāo)的小鼠3 d后再用80 mg·kg-1的STZ一次性腹腔注射，72 h后，選擇血糖濃度≥11.1 mmol·L-1為糖尿病小鼠。將糖尿病小鼠隨機(jī)分為4組，每天分別灌胃給予同體積不同藥物。糖尿病模型組（生理鹽水，9只）、二甲雙胍組（200 mg·kg-1，8只），低劑量ARP組（100 mg·kg-1，9只）、高劑量ARP組（300 mg·kg-1，9只），所有糖尿病小鼠均持續(xù)給予高脂飼料，正常組小鼠給予普通飼料（10只）。藥物處理4周之后，處死動(dòng)物。處死動(dòng)物前3 d，收集小鼠24 h尿液，測尿蛋白質(zhì)量，并測定小鼠空腹血糖濃度。小鼠處死后收集血液，分離血清，用于生化檢測，并分離右側(cè)腎臟皮質(zhì)組織，快速冷凍，于-80 ℃保存，用于Western blot分析。左側(cè)腎臟保存于4 g·mL-1的多聚甲醛溶液中，用于組織學(xué)觀察。

2.2 生化檢測

使用血糖儀檢測小鼠的空腹血糖濃度。取血液樣品，分離血清，采用生化檢測試劑盒檢測小鼠24 h尿蛋白質(zhì)量及血清中SOD活性、MDA濃度及血肌酐濃度。

2.3 ELISA分析

分離血清，按照試劑盒說明書要求檢測小鼠血清中IL-6，TNF-α的質(zhì)量濃度。

2.4 Western blot分析

采用Western blot分析小鼠腎組織p-NF-κB p65，podocin，Nephrin的蛋白表達(dá)。取小鼠腎臟組織勻漿約50 mg，加入含蛋白酶抑制劑的預(yù)冷細(xì)胞裂解液，充分裂解后，離心取上清，采用BCA法測蛋白質(zhì)量并定量。將各組蛋白樣品用裂解液調(diào)成相同濃度（50 μmol·L-1），經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）恒壓電泳分離蛋白，將電泳好的凝膠轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，將轉(zhuǎn)好的膜加5 g·mL-1脫脂牛奶封閉后，分別加入相應(yīng)一抗，即p-NF-κB p65抗體（1∶1 000）、podocin抗體（1∶1 000）、Nephrin抗體（1∶1 000）和β-actin單抗（1∶300），4 ℃下孵育過夜。最后，加二抗37 ℃下孵育1 h，ECL電化學(xué)發(fā)光成像。使用Quantity-one專業(yè)分析軟件對(duì)Western blot實(shí)驗(yàn)所得圖片進(jìn)行光密度掃描分析。

2.5 蘇木精-伊紅染色觀察小鼠腎臟組織損傷

用4 g·mL-1多聚甲醛溶液固定小鼠腎臟組織24 h以上，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋，制成石蠟塊，再用切片機(jī)切成4 μm厚的切片，脫蠟至水，蘇木精-伊紅（HE）染色，二甲苯透明，樹膠封片，于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織損傷情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s形式表示，數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組比較采用單因素方差分析，2組比較采用LSD-t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組比較，aPlt;0.05，bPlt;0.01；與模型組比較，cPlt;0.05，dPlt;0.01 。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 小鼠的血糖與體質(zhì)量

各組小鼠血糖濃度及體質(zhì)量變化，如圖1所示。圖1中：cb為小鼠血糖濃度；m為小鼠體質(zhì)量。

由圖1可知：實(shí)驗(yàn)開始時(shí)（0周），各組小鼠的血糖濃度沒有明顯差異，小鼠經(jīng)HFD喂養(yǎng)3周，STZ誘導(dǎo)后，糖尿病小鼠的血糖濃度比正常組明顯升高（P＜0.01）；隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，與正常組相比，糖尿病小鼠的血糖濃度持續(xù)升高，而與模型組相比，給予不同藥物干預(yù)4周后，藥物組小鼠血糖明顯下降（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各組小鼠的體質(zhì)量無明顯差異，HFD喂養(yǎng)3周后，小鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.01）；隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，正常組小鼠體質(zhì)量增加較快，相比之下，模型組小鼠的體質(zhì)量明顯下降（P＜0.01）；經(jīng)藥物治療4周后，糖尿病小鼠的體質(zhì)量下降得到明顯緩解（P＜0.01）。

3.2 生化檢測結(jié)果

生化檢測結(jié)果，如圖2所示。圖2中：z為SOD的活性；cMDA為MDA濃度；mp為24 h尿蛋白質(zhì)量；ccr為血肌酐濃度。

由圖2可知：與正常小鼠相比，模型組小鼠的血清中抗氧化酶SOD的活性下降，MDA濃度增多，表明糖尿病小鼠的氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)；同時(shí)，模型組小鼠的24 h尿蛋白質(zhì)量及血肌酐濃度增多，表明模型組小鼠腎功能異常；給予糖尿病小鼠金線蓮多糖后，高、低兩個(gè)劑量的ARP組小鼠的24 h尿蛋白質(zhì)量及血肌酐濃度均明顯下降（P＜0.01），表明糖尿病小鼠腎小球高濾過現(xiàn)象得到改善；給予不同劑量金線蓮多糖干預(yù)后，小鼠血清中SOD的活性顯著上升（P＜0.01），MDA濃度明顯降低（P＜0.01），表明糖尿病小鼠增強(qiáng)的氧化應(yīng)激作用減弱。

3.3 Elisa檢測結(jié)果

小鼠血清中IL-6，TNF-α的質(zhì)量濃度，如圖3所示。圖3中：ρIL-6，ρTNF-α分別為IL-6，TNF-α的質(zhì)量濃度。

由圖3可知：模型組小鼠血清中炎癥因子IL-6，TNF-α的質(zhì)量濃度比正常小鼠高，經(jīng)金線蓮多糖干預(yù)后，糖尿病小鼠血清中炎癥因子IL-6，TNF-α的質(zhì)量濃度明顯下降（P＜0.05），表明金線蓮多糖有較強(qiáng)的抗炎作用。

3.4 Western blot分析

小鼠腎臟組織中p-NF-κB p65，podocin，Nephrin的蛋白表達(dá)，如圖4所示。由圖4可知：模型組小鼠腎臟組織中p-NF-κB p65的表達(dá)上調(diào)，提示糖尿病小鼠腎臟組織中NF-κB信號(hào)通路被激活；模型組小鼠腎臟組織中podocin，Nephrin的蛋白表達(dá)均下調(diào)，提示糖尿病小鼠腎小球?yàn)V過膜受損；給予金線蓮多糖后，糖尿病小鼠腎臟組織中p-NF-κB p65的表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），podocin，Nephrin的蛋白表達(dá)均上調(diào)（低劑量ARP組P＜0.05，高劑量ARP組P＜0.01），（低、高劑量ARP組P＜0.01）。

3.5 HE染色分析

金線蓮多糖對(duì)糖尿病小鼠腎臟組織病理學(xué)變化的影響，如圖5所示。圖5中：紅色箭頭顯示系膜區(qū)增生；黑色箭頭顯示足細(xì)胞病變；右下角方框內(nèi)為箭頭所示足細(xì)胞局部放大圖。

正常組小鼠腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)無增生，毛細(xì)血管管腔通暢，腎小球囊無擴(kuò)張（圖5（a））；與正常小鼠相比，模型組小鼠的腎臟結(jié)構(gòu)明顯改變，腎小球系膜細(xì)胞呈現(xiàn)明顯增生，系膜基質(zhì)增多，呈彌漫或節(jié)段性，毛細(xì)血管受壓，管腔狹窄，腎小球囊擴(kuò)張，足細(xì)胞萎縮、變性（圖5（b））；給予二甲雙胍的糖尿病小鼠的腎小球體積如常，系膜基質(zhì)、系膜細(xì)胞呈局灶節(jié)段或節(jié)段性輕度增多，毛細(xì)血管擴(kuò)張，腎小球囊無明顯擴(kuò)張，足細(xì)胞增生（圖5（c））；給予低劑量金線蓮多糖的糖尿病小鼠的腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)呈節(jié)段性輕度增生，以系膜基質(zhì)增生為主，毛細(xì)血管腔無明顯受壓，足細(xì)胞肥大，損傷明顯緩解，腎小球囊無明顯擴(kuò)張（圖5（d））；給予高劑量金線蓮多糖的糖尿病小鼠的腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)呈節(jié)段性明顯增生，毛細(xì)血管受壓貧血，腎小球囊擴(kuò)張，但比模型組小鼠有所改善，足細(xì)胞增生（圖5（e））。

4 結(jié)論

糖尿病腎病占糖尿病患者的30%～40%，是最常見的糖尿病并發(fā)癥。引起糖尿病腎病的確切機(jī)制還不清楚。大量的報(bào)道顯示，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗等與糖尿病腎病病理密切相關(guān)［7-9］。對(duì)糖尿病機(jī)制及治療藥物的研究是醫(yī)療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，目前HFD/STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病模型被很多糖尿病研究者采用［10-11］。實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)3周，出現(xiàn)明顯肥胖后，一次性注射STZ損傷小鼠胰島β細(xì)胞，并持續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，經(jīng)HFD/STZ誘導(dǎo)將小鼠發(fā)展為2型糖尿病。糖尿病小鼠隨著血糖濃度的升高，體質(zhì)量逐漸減輕，其24 h蛋白尿質(zhì)量及血肌酐濃度均明顯升高，表明糖尿病小鼠腎臟功能受損。腎小球高濾過，炎癥、氧化應(yīng)激與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［12-13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病小鼠在持續(xù)高血糖作用下，血清抗氧化酶SOD活性顯著下降。SOD是內(nèi)源性自由基清除酶，SOD活性下降使體內(nèi)氧化與抗氧化失衡，導(dǎo)致活性氧ROS產(chǎn)生量增多，引起脂質(zhì)過氧化中間產(chǎn)物MDA濃度增多，MDA濃度越高，表明氧化損傷越嚴(yán)重。

NF-κB信號(hào)通路是對(duì)氧化應(yīng)激及炎癥敏感的信號(hào)通路。糖尿病狀態(tài)下，在過多活性氧ROS及炎癥因子的刺激下，NF-κB信號(hào)通路被激活，促進(jìn)系膜表達(dá)TGF-β，引起細(xì)胞外基質(zhì)增生，導(dǎo)致腎小球基底膜增厚和腎小球硬化，加速纖維化進(jìn)程，并引起或加劇炎癥［14-15］。足細(xì)胞損傷也是糖尿病腎病早期的一個(gè)關(guān)鍵特征。糖尿病狀態(tài)下，足細(xì)胞丟失，導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和高通透性，引起蛋白尿的發(fā)生［16］。實(shí)驗(yàn)中糖尿病小鼠血清中炎癥因子IL-6和TNF-α的質(zhì)量濃度顯著升高。過多的炎癥因子與氧化應(yīng)激使糖尿病小鼠腎臟組織中p-NF-κB p65的表達(dá)上調(diào)，激活了NF-κB信號(hào)通路，激活的NF-κB信號(hào)通路反過來又調(diào)控IL-6和TNF-α等炎癥因子，加速疾病的進(jìn)展［17］。組織學(xué)檢查顯示，糖尿病小鼠腎小球系膜細(xì)胞明顯增生，系膜基質(zhì)增多，毛細(xì)血管腔明顯受壓，腎小球囊擴(kuò)張，腎小球結(jié)構(gòu)明顯改變。腎小球結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)一步引起腎小球功能的改變。實(shí)驗(yàn)中糖尿病小鼠腎臟組織的podocin和Nephrin的表達(dá)顯著下降，podocin和Nephrin是足細(xì)胞裂孔膜上的特殊蛋白分子，它們的減少導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障缺損，使蛋白分子進(jìn)入尿液，糖尿病小鼠出現(xiàn)蛋白尿、血肌酐濃度升高癥狀，并出現(xiàn)糖尿病腎病。

給予金線蓮多糖后，糖尿病小鼠腎臟炎癥因子水平明顯下調(diào)，血清SOD活性增加，MDA濃度顯著減少，氧化應(yīng)激反應(yīng)降低，腎臟組織p-NF-κB p65的表達(dá)下調(diào)，NF-κB信號(hào)通路被抑制。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，金線蓮多糖組小鼠的損傷減輕，特別是低劑量金線蓮多糖組系膜細(xì)胞及基質(zhì)呈節(jié)段性輕度增生，毛細(xì)血管腔無明顯受壓，腎小球囊無明顯擴(kuò)張，足細(xì)胞損傷緩解（圖5（d））。與病理學(xué)結(jié)果一致的是，經(jīng)金線蓮多糖干預(yù)后，糖尿病小鼠尿蛋白明顯減少，血肌酐濃度降低，糖尿病腎病明顯好轉(zhuǎn)。

臨床上還沒有理想的糖尿病腎病治療藥物，目前主要采用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑等藥物治療糖尿病腎病。但總體療效和遠(yuǎn)期預(yù)后較差，加上不良反應(yīng)多，不能有效阻止糖尿病腎病患者發(fā)展為終末期腎病。二甲雙胍是臨床推薦使用的抗2型糖尿病的一線藥物，它可能增加乳酸酸中毒的風(fēng)險(xiǎn)，不適用于晚期糖尿病腎病的治療［18］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金線蓮多糖有與二甲雙胍相似的作用，糖尿病腎病治療藥物仍是臨床面臨的難題，糖尿病腎病不僅提高了心血管疾病的病死率，還加重了患者和社會(huì)的負(fù)擔(dān)?？紤]到金線蓮多糖基本無毒，能通過抗炎、抗氧化，抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮腎保護(hù)作用，因此，將金線蓮用于治療糖尿病腎病可能具有較好的前景。

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