關(guān)鍵詞 甘蔗； 割手密； 核心種質(zhì)； 關(guān)聯(lián)分析； SSR 標(biāo)記

甘蔗是我國(guó)最主要的糖料作物，我國(guó)年產(chǎn)糖約1 300 萬(wàn)t，90% 以上來(lái)自甘蔗，其中廣西甘蔗產(chǎn)糖量占六成以上?，F(xiàn)代甘蔗栽培種是異源多倍體，是由原種熱帶種（Saccharum officinarum L.）、印度種（S.barberi）、野生種割手密（S. spontaneum L.）和大莖野生種（S. robustum）經(jīng)過(guò)一系列種間雜交育成的，其中約75%～85% 的染色體來(lái)源于熱帶種，15%～25%來(lái)源于割手密［1］。割手密還具有種類數(shù)量龐大、遺傳多樣性豐富、利于雜交利用等優(yōu)點(diǎn)，因此，割手密作為甘蔗屬的野生種，已成為現(xiàn)代甘蔗遺傳育種和種質(zhì)創(chuàng)新研究最為重要的野生種質(zhì)之一，甘蔗育種工作者非常重視割手密種質(zhì)資源收集與評(píng)價(jià)研究［2-4］。

近年來(lái)，廣西甘蔗種質(zhì)資源圃（南寧）廣泛收集并保存了3 800 余份資源，若對(duì)所有資源開(kāi)展精細(xì)鑒定評(píng)價(jià)和雜交利用研究，將給資源保育工作者帶來(lái)巨大的工作量與挑戰(zhàn)。核心種質(zhì)（core collection）概念的提出［5］為解決這一難題開(kāi)辟了新的思路，核心種質(zhì)是以最少數(shù)量的種質(zhì)材料代表原始種質(zhì)資源的全部或大多數(shù)遺傳多樣性和地理來(lái)源，最大限度地去除原始種質(zhì)資源中的重復(fù)。在割手密的核心種質(zhì)構(gòu)建方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了相關(guān)研究。早期主要是應(yīng)用表型數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，如Tai 等［6］應(yīng)用USA-ARS保育的342 份割手密為材料，根據(jù)11 個(gè)數(shù)量性狀及地理信息，構(gòu)建了含75 份種質(zhì)的核心庫(kù)；Amalraj等［7］以印度Coimbatore 甘蔗育種所保育的617 份割手密為材料，應(yīng)用21 個(gè)質(zhì)量性狀和10 個(gè)數(shù)量性狀，構(gòu)建了含60 份無(wú)性系的核心種質(zhì)；蘇火生等［8］以國(guó)家甘蔗種質(zhì)資源圃中596 份割手密為研究對(duì)象，根據(jù) 21 個(gè)質(zhì)量性狀和6 個(gè)數(shù)量性狀探討了構(gòu)建割手密初級(jí)核心種質(zhì)的最佳取樣策略。齊永文等［9］以海南甘蔗育種場(chǎng)保育的540 份割手密為研究對(duì)象、徐超華等［10-11］以92 份割手密初級(jí)核心種質(zhì)［8］為研究對(duì)象，利用SSR 分子標(biāo)記和表型數(shù)據(jù)構(gòu)建割手密核心種質(zhì)庫(kù)，前者應(yīng)用分子標(biāo)記遺傳多樣性和主成分分析評(píng)價(jià)核心種質(zhì)的代表性，后者主要應(yīng)用分子標(biāo)記遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果均表明所構(gòu)建的核心種質(zhì)具有較好的代表性。

廣西屬亞熱帶氣候，是我國(guó)甘蔗原產(chǎn)地之一，具有豐富多樣的甘蔗栽培品種資源和野生種質(zhì)資源［12］。本研究對(duì)搜集于廣西境內(nèi)于廣西甘蔗種質(zhì)資源圃（南寧）保育的割手密種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)，構(gòu)建割手密核心種質(zhì)并進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在為割手密種質(zhì)優(yōu)異基因的發(fā)掘和育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

333 份割手密材料均來(lái)自廣西甘蔗種質(zhì)資源圃（南寧），主要采集于廣西境內(nèi)的百色市凌云縣和田林縣、柳州市鹿寨縣和三江侗族自治縣、桂林市平樂(lè)縣和靈川縣、來(lái)賓市金秀瑤族自治縣等。

1.2 表型數(shù)據(jù)收集

形態(tài)表型數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［13］，采集錘度、莖徑、株高、葉寬、葉長(zhǎng)、節(jié)間長(zhǎng)度、節(jié)數(shù)、莖形、節(jié)間性狀、曝光前后莖色、蠟粉帶、木栓、生長(zhǎng)裂縫、空心、蒲心、生長(zhǎng)帶性狀、根點(diǎn)排列、氣根、芽形、芽位、芽溝、葉姿、葉色、脫葉性、毛群、內(nèi)葉耳形狀和外葉耳形狀共28 個(gè)表型性狀數(shù)據(jù)。

1.3 葉片基因組總DNA提取與PCR擴(kuò)增

采用SDS 法［14］進(jìn)行割手密葉片基因組DNA 的提取和純化。篩選出12 對(duì)條帶清晰的甘蔗SSR 引物［15-16］（表1），參照高軼靜等［14］的方法設(shè)計(jì)SSR 反應(yīng)體系和PCR 擴(kuò)增條件，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳［17］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用GeneMarker 軟件（v2.4.0，SoftGenetics，State College， Pennsylvania）分析SSR 擴(kuò)增的DNA片段的毛細(xì)管電泳圖譜數(shù)據(jù)。應(yīng)用GenAIEx 軟件［18］進(jìn)行群體的遺傳多樣性分析；應(yīng)用TASSEL5軟件［19］對(duì)SSR 分子標(biāo)記和表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，模型選擇為混合線性模型（MLM）；應(yīng)用TBtools 軟件［20］對(duì)割手密材料的6 個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)系數(shù)計(jì)算。核心種質(zhì)構(gòu)建應(yīng)用Core Hunter Ⅱ軟件［21］進(jìn)行：參照文獻(xiàn)［22-23］使用加權(quán)指數(shù)modified rogers distance （0.7）和Shannon diversity index（ 0.3）按照總的種質(zhì)資源比例的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 梯度進(jìn)行篩選，選擇最優(yōu)抽樣比例，并對(duì)最終確定的核心種質(zhì)材料進(jìn)行覆蓋度評(píng)價(jià)。應(yīng)用以上的GenAIEx 軟件［18］對(duì)核心種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，同時(shí)使用adegenet軟件［24］的glPca 模塊進(jìn)行主成分分析，進(jìn)一步評(píng)估核心種質(zhì)篩選的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 割手密遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析結(jié)果（表1）顯示，12 對(duì)SSR 引物在333 份割手密材料上共檢測(cè)到227 個(gè)多態(tài)性條帶，平均每對(duì)引物檢測(cè)到多態(tài)性條帶為18.92。各引物的多態(tài)性條帶數(shù)差異較大，其中，SMC31CUQ 檢測(cè)到的條帶數(shù)最多，為33 條；引物SMC336BS 次之，檢測(cè)到32 條；引物ESTB155 檢測(cè)到的最少，僅為4 條。各引物的Shannon-Weiner 指數(shù)在0.294 6～0.570 7，平均值為0.411 4，表明本研究中搜集于廣西境內(nèi)的割手密材料具有豐富的遺傳多樣性。

2.2 割手密表型性狀與SSR標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析

對(duì)SSR 分子標(biāo)記和27 個(gè)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共有5 個(gè)表型性狀與8 個(gè)位點(diǎn)顯著相關(guān)，分別是莖徑、節(jié)間長(zhǎng)度、曝光前顏色、脫葉性和毛群（表2）。其中，相關(guān)性最顯著的表型性狀是毛群，與SMC336BS 標(biāo)記的相關(guān)系數(shù)為1.74E-09。其余7 個(gè)顯著相關(guān)位點(diǎn)是莖徑與SMC221MS 標(biāo)記（相關(guān)系數(shù)為3.2E-05），節(jié)間長(zhǎng)度與mSSCIR9、SMC16SA 標(biāo)記（相關(guān)系數(shù)分別為1.22E-05、1.16E-04），曝光前顏色與1.38E-06 標(biāo)記（相關(guān)系數(shù)為1.38E-06），脫葉性與mSSCIR9、SMC16SA 標(biāo)記（相關(guān)系數(shù)分別為9.01E-05、1.02E-05），毛群與mSSCIR41 標(biāo)記（相關(guān)系數(shù)為2.25E-05）。

對(duì)割手密材料的6 個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行變異及相關(guān)性分析，相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)系數(shù)計(jì)算。結(jié)果表明，莖徑與其他5 個(gè)性狀均表現(xiàn)出極顯著相關(guān)，其中葉長(zhǎng)、葉寬、節(jié)間長(zhǎng)度和節(jié)數(shù)為正相關(guān)，錘度為負(fù)相關(guān)。株高、莖徑、節(jié)間長(zhǎng)度、節(jié)數(shù)是甘蔗產(chǎn)量上極為重要的表型，該4 個(gè)表型性狀之間互相呈現(xiàn)顯著至極顯著的正相關(guān)；錘度是甘蔗品種選育目標(biāo)上的另一重要指標(biāo)，與莖徑和節(jié)間長(zhǎng)度均表現(xiàn)為極顯著的負(fù)相關(guān)（圖1）。

2.3 核心種質(zhì)構(gòu)建

根據(jù)遺傳變異SSR 標(biāo)記數(shù)據(jù)，應(yīng)用Core HunterⅡ 軟件，結(jié)合加權(quán)指數(shù)Modified Rogers distance（0.7）和Shannon diversity index（ 0.3），按照總資源比例的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 進(jìn)行梯度篩選，并對(duì)篩選材料進(jìn)行覆蓋度評(píng)價(jià)（圖2）。結(jié)果顯示，當(dāng)抽樣比例達(dá)到30% 以上時(shí)，即可包含100% 等位基因覆蓋度。因此，根據(jù)30% 的抽樣比例，共篩選出99 個(gè)割手密樣本構(gòu)建核心種質(zhì)。

2.4 核心種質(zhì)代表性分析

對(duì)所有材料以及篩選出的核心種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，核心種質(zhì)的有效等位基因數(shù)、香農(nóng)維納指數(shù)（Shannon-Wiener index）、觀測(cè)雜合度和期望雜合度均略高于原始種質(zhì)，表明本研究構(gòu)建的核心種質(zhì)所篩選材料間具有豐富的遺傳多樣性，同時(shí)保留了較高的遺傳變異（表3）。

對(duì)所有種質(zhì)材料和篩選的核心種質(zhì)材料進(jìn)行主成分分析（principal component analysis， PCA），以評(píng)估種質(zhì)篩選的準(zhǔn)確性。聚類分析結(jié)果顯示，基于核心種質(zhì)繪制的主成分圖能保持原始種質(zhì)分布的幾何形狀和特征，核心種質(zhì)較為均勻地分布在333 份原種質(zhì)中，和原始種質(zhì)的分布圖趨勢(shì)吻合（圖3），充分說(shuō)明了核心種質(zhì)材料篩選的合理性，且具有較好的代表性。

3 討論

本研究所用的12 對(duì)SSR 引物中有7 對(duì)具有高多態(tài)性，分別是mSSCIR41、SMC1047HA、SMC179SA、SMC278CS、SMC31CUQ、SMC336BS 和SMC221MS，每對(duì)引物均獲得條帶24 條以上。

齊永文等［9］研究顯示9 對(duì)引物已經(jīng)能夠滿足鑒別所選種質(zhì)的需要，在其研究中SSR 引物的平均多態(tài)性條帶為22.7、總條帶數(shù)達(dá)到204.3 條（9×22.7）時(shí)，能夠鑒別所選種質(zhì)。本研究共檢測(cè)到227 個(gè)多態(tài)性條帶，已經(jīng)滿足割手密核心種質(zhì)取樣需要。并且本研究采用熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳，條帶數(shù)據(jù)清晰，可用軟件直接讀取，易于統(tǒng)計(jì)，因此應(yīng)用高多態(tài)性SSR標(biāo)記引物和毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合是較好的選擇。同時(shí)，隨著分子標(biāo)記的迅猛發(fā)展，利用高通量測(cè)序獲得的適合規(guī)?；治?、多態(tài)性豐富的SNP（single nu?cleotide polymorphism）標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)研究，本團(tuán)隊(duì)將在今后的割手密種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中應(yīng)用。

近年來(lái)，已有研究人員應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記開(kāi)展甘蔗表型性狀關(guān)聯(lián)分析相關(guān)研究［25-27］，然而，尚未見(jiàn)利用分子標(biāo)記對(duì)割手密的表型性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。在本研究中，12 對(duì)SSR 引物的Shannon-Weiner 多樣性指數(shù)在0.294 6～0.570 7，說(shuō)明割手密材料在12 個(gè)SSR 位點(diǎn)上的遺傳多樣性十分豐富，然而對(duì)SSR 分子標(biāo)記和27 個(gè)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，僅有5 個(gè)表型性狀與8 個(gè)位點(diǎn)顯著相關(guān)，主要原因是用于關(guān)聯(lián)分析的分子標(biāo)記數(shù)量偏少，在目標(biāo)材料的全基因組中分布密度低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能覆蓋全基因組。同時(shí)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，除莖徑外，相關(guān)性顯著的主要是質(zhì)量性狀，推測(cè)原因可能是株高、錘度等數(shù)量性狀受栽培技術(shù)、氣候等環(huán)境影響較大［27］，而不易受環(huán)境影響的質(zhì)量性狀在關(guān)聯(lián)分析中更容易被定位到。因此，對(duì)于數(shù)量性狀，后續(xù)將通過(guò)多年多點(diǎn)的表型鑒定進(jìn)一步提升其穩(wěn)定性，為定位主效位點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

構(gòu)建核心種質(zhì)常用的2 類特征數(shù)據(jù)分別是表型性狀和分子標(biāo)記。其中，表型性狀在早期的割手密核心種質(zhì)構(gòu)建研究中被普遍采用［6-8］，主要是由于表型性狀具有可直接反映種質(zhì)資源應(yīng)用價(jià)值、易獲取等優(yōu)點(diǎn)。然而，割手密的遺傳背景非常復(fù)雜，染色體倍性從四倍體到十六倍體不等、具有多種類型［28］，并且割手密生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、屬于多年生植物，其表型性狀尤其是一些與生長(zhǎng)周期相關(guān)的數(shù)量性狀測(cè)量需要花費(fèi)大量時(shí)間，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性較低，而且受生態(tài)、氣候等環(huán)境因素的影響很大，因此，表型性狀不能穩(wěn)定反映割手密種質(zhì)資源的遺傳多樣性。而分子標(biāo)記具有遍布整個(gè)基因組、多態(tài)性豐富、密度大、遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，并且不受環(huán)境和植物發(fā)育時(shí)期的影響，可準(zhǔn)確、穩(wěn)定地反映種質(zhì)間的遺傳關(guān)系，更適用于核心種質(zhì)構(gòu)建。在利用SSR 分子標(biāo)記構(gòu)建割手密核心種質(zhì)庫(kù)的研究中，齊永文等［9］應(yīng)用主成分分析評(píng)價(jià)核心種質(zhì)的代表性，其結(jié)果顯示10% 的取樣比例可獲得70% 以上的變異保留比例；徐超華等［10］應(yīng)用分子標(biāo)記遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明核心種質(zhì)較好地代表了基礎(chǔ)原始種質(zhì)。本研究應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記進(jìn)行廣西割手密核心種質(zhì)構(gòu)建，主成分分析結(jié)果顯示，當(dāng)抽樣比例達(dá)到30% 以上時(shí)，可包含100% 等位基因覆蓋度。

在利用分子標(biāo)記和表型數(shù)據(jù)構(gòu)建割手密核心種質(zhì)庫(kù)的研究中，齊永文等［9］以海南甘蔗育種場(chǎng)保存的來(lái)自廣東、廣西、海南、福建、云南、四川、貴州、江西、湖南和上海等10 個(gè)?。ㄊ校?、自治區(qū)的 540 份割手密為研究對(duì)象，徐超華等［10-11］以國(guó)家甘蔗種質(zhì)資源圃保存的來(lái)源于國(guó)內(nèi)8 個(gè)省份和4 個(gè)國(guó)家的92 份割手密為研究對(duì)象，均覆蓋了較大范圍的地理來(lái)源。廣西是我國(guó)甘蔗原產(chǎn)地之一，野生種質(zhì)資源豐富，尤其是割手密類型多樣，有許多高大型割手密材料，本研究以廣西甘蔗種質(zhì)資源圃（南寧）保存的來(lái)源于廣西境內(nèi)百色、柳州、桂林、來(lái)賓等市的333 份割手密材料為試驗(yàn)材料，已覆蓋廣西所有割手密類型，遺傳多樣性評(píng)價(jià)和主成分分析也表明所構(gòu)建的核心種質(zhì)具有較好的代表性，目前本課題組已開(kāi)展利用廣西割手密中的高大型割手密，雜交后代已表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。

本研究利用SSR 分子標(biāo)記與割手密表型性狀開(kāi)展關(guān)聯(lián)分析研究，并建立了一個(gè)包含99 份廣西割手密的核心種質(zhì)。核心種質(zhì)取樣比例為30%，包含了100% 等位基因覆蓋度，遺傳多樣性評(píng)價(jià)和主成分分析均表明所構(gòu)建的核心種質(zhì)具有較好的代表性，將為后續(xù)割手密種質(zhì)資源的分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究提供依據(jù)。