關(guān)鍵詞 大白菜； 根系分泌物； 自毒作用； 連作障礙； 二烯丙基二硫

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis），原產(chǎn)于中國，栽培歷史悠久，種植面積與市場(chǎng)銷量大，是我國第二大蔬菜作物［1］，具有耐儲(chǔ)運(yùn)、食用方式多樣以及營養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，深受人們的喜愛。近年因?yàn)檫B茬種植以及區(qū)域化的種植習(xí)慣，導(dǎo)致連作障礙嚴(yán)重發(fā)生，病蟲害加劇、生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重影響大白菜的產(chǎn)量品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益。研究表明，造成其連作障礙的主要原因之一是根系分泌物產(chǎn)生的自毒作用［2］。

在特定時(shí)刻，植物的生長(zhǎng)發(fā)育能與環(huán)境因子發(fā)生相互作用，化感作用（allelopathy）是指植物向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)對(duì)自身或其他動(dòng)植物以及微生物受體的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生有利或不利的影響，這類化學(xué)物質(zhì)稱作化感物質(zhì)［3］。化感物質(zhì)會(huì)影響植物體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、各項(xiàng)生理代謝過程以及土壤理化性質(zhì)。自毒作用（autotoxicity）作為化感作用的一種特殊形式，是指植物根系分泌或植株殘茬降解后向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)，嚴(yán)重危害自身或者種內(nèi)植物，同時(shí)也是植物適應(yīng)種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)的表現(xiàn)［4］。二烯丙基二硫（diallyl disul?fide， DADS）是大蒜素分解后的有機(jī)硫化合物，普遍存在于大蒜根系分泌物、鱗莖提取物以及地上部揮發(fā)物中［5-7］。DADS 是大蒜根系分泌物和秸稈水浸提液中的主要化感物質(zhì)［5-6］。利用GC-MS 技術(shù)鑒定青蒜揮發(fā)物主要成分是DADS，適當(dāng)濃度的青蒜揮發(fā)物與DADS 對(duì)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用［7］。DADS 可調(diào)控植物的抗氧化酶活性和非酶類活性物質(zhì)，清除活性氧，發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用，最終緩解非生物脅迫造成的膜脂過氧化［8］。DADS 可通過調(diào)節(jié)番茄內(nèi)源激素含量和EXPs 基因表達(dá)來調(diào)控根系生長(zhǎng)和葉綠素含量，提高POD、SOD 與PAL 酶活性，調(diào)控GSSG 與GSH 代謝，進(jìn)而提高植株抗性；同時(shí)還可改變番茄根系分泌物含量來緩解連作障礙［9］。DADS 處理黃瓜可使根系有絲分裂相關(guān)基因CDKA和CDKB 表達(dá)上調(diào)，調(diào)控根系內(nèi)源激素含量，促進(jìn)根系生長(zhǎng)［10］。

關(guān)于DADS 影響黃瓜、番茄等作物的生長(zhǎng)生理代謝過程已有相關(guān)研究，而在蕓薹屬蔬菜上，外源施加DADS 對(duì)大白菜自毒作用緩解效應(yīng)尚不清楚。為探究DADS 對(duì)大白菜自毒作用的緩解效應(yīng)，本研究利用水培試驗(yàn)，設(shè)置6 組DADS 濃度處理，測(cè)定各處理大白菜幼苗的生長(zhǎng)性狀、生理指標(biāo)，并通過組織染色顯示過氧化氫和超氧陰離子積累情況，探討DADS 對(duì)大白菜幼苗自毒作用的影響機(jī)制，以期為大白菜綠色生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大白菜品種為‘金麒麟’，購于河北慕蘭多種子有限公司。DADS 和Hoagland 營養(yǎng)液，購于上海麥克林有限公司。

1.2 大白菜水培重茬液的收集

大白菜種子于25 ℃下催芽1 d，之后將幼芽放入PCR 板孔中，將其漂浮于1/4 Hoagland 營養(yǎng)液中進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)7 d，移入1/2 Hoagland 營養(yǎng)液的組培瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶裝入200 mL 營養(yǎng)液培養(yǎng)4 株大白菜幼苗。組培瓶外包錫箔紙避光，移入組培室進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件設(shè)為25 ℃ 6 000 lx 光照14 h/19 ℃黑暗10 h，每周調(diào)節(jié)1 次pH 值，使pH 保持在5.8～6.5，培養(yǎng)20 d 后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)瓶中營養(yǎng)液至200 mL，收集大白菜水培重茬培養(yǎng)液備用。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

催芽的大白菜植物材料在1/4 Hoagland 營養(yǎng)液中適應(yīng)性培養(yǎng)7 d，再使用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液與上述收集的重茬液分別處理5 d。之后向重茬液中加入不同濃度DADS，共設(shè)置6 組處理：CK1（1/2 Hoa?gland 營養(yǎng)液）、CK2（重茬液處理）、D1（1 μmol/LDADS+重茬液）、D5（5 μmol/L DADS+重茬液）、D10（10 μmol/L DADS+重茬液）、D15（15 μmol/LDADS+重茬液），每個(gè)處理設(shè)置12 個(gè)組培瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)4 株幼苗，共48 株幼苗。每周調(diào)節(jié)pH 值保持在5.8～6.5，期間每間隔4 d 向組培瓶中加入等量1/2 Hoagland 營養(yǎng)液。DADS 處理10 d 后進(jìn)行取樣并保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4 測(cè)定性狀與方法

1）生長(zhǎng)性狀。將大白菜幼苗置于含少量清水的培養(yǎng)皿中，拍照記錄植株的生長(zhǎng)情況。測(cè)量最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、株幅、地上部鮮質(zhì)量和地下部鮮質(zhì)量，再將植株的地上部和地下部放入信封中，并置于105 ℃的烘箱中殺青20 min，之后立即降低烘箱溫度，維持在75 ℃，直到樣品烘干至恒質(zhì)量，用電子天平稱量植株地上部干質(zhì)量和地下部干質(zhì)量。

2）根系性狀。采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測(cè)定根系活力［11］；用清水洗凈植株根系后進(jìn)行掃描（根系掃描儀 WinRhizo Basic03040415），在托盤內(nèi)加入一定量的蒸餾水，將洗凈完整的根系放入托盤中，使其平展后開始掃描，掃描后保存圖片并分析總根長(zhǎng)、根表面積以及根體積等形態(tài)性狀。

3）生理性狀。參照文獻(xiàn)［11］，利用96% 乙醇研磨提取比色的方法測(cè)定葉綠素含量；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定葉片可溶性蛋白含量；采用酸性茚三酮比色法測(cè)脯氨酸含量；采用蒽酮比色法測(cè)可溶性糖含量；采用硫代巴比妥酸法測(cè)丙二醛（MDA）含量；采用氯化硝基四氮唑（NBT）光化還原法測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)過氧化物酶（POD）活性；采用紫外吸收比色法測(cè)過氧化氫酶（CAT）活性。

采用DAB 組織化學(xué)染色法觀察過氧化氫累積含量［12］ ， NBT 組織化學(xué)染色法觀察超氧陰離子累積含量［13］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及圖表繪制，使用IBM-SPSS 24.0 軟件one-way ANO?VA 單因素方差分析方法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源DADS對(duì)自毒作用下大白菜幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖1 可見，與CK2 重茬液處理相比，添加不同濃度DADS 處理后的幼苗葉片大小及根系生長(zhǎng)情況均得到改善，其中D5 處理（5 μmol/L DADS）植株葉面積、總根長(zhǎng)及根系數(shù)目增加明顯。在重茬液中添加DADS 可以緩解自毒作用對(duì)幼苗的傷害，且在5 μmol/L DADS 處理下效果最好。

由表1 可知，CK2 處理比CK1 處理大白菜幼苗株幅、最大葉寬和最大葉長(zhǎng)分別顯著降低了30.03%、39.90% 和38.33%，地下部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別顯著降低了30.85% 和20.00%。施用DADS 后，均可促進(jìn)大白菜幼苗生長(zhǎng)，隨著DADS 處理濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。D1、D5、D10 和D15 處理的地上部鮮質(zhì)量分別較CK2 處理增加了13.42%、19.42%、9.71% 和3.53%； D1、D5 和D10 處理地下部鮮質(zhì)量較CK2 處分別顯著增加11.70%、23.40%和12.77%； D5 處理對(duì)幼苗株幅、最大葉寬和最大葉長(zhǎng)的促進(jìn)作用達(dá)到最大值，分別比CK2 處理增加了22.81%、20.93% 和21.20%。

2.2 外源DADS對(duì)自毒作用下大白菜幼苗根系的影響

由圖2 可見，重茬液處理（CK2）顯著抑制大白菜根系生長(zhǎng)（根直徑除外），外源DADS 處理可以不同程度促進(jìn)大白菜幼苗根系的生長(zhǎng)，隨著外源DADS處理濃度增大均呈現(xiàn)先上升再降低的趨勢(shì)，D1、D5、D10、D15 處理顯著高于CK2 處理各性狀，且D5 處理下各性狀均達(dá)到峰值，根系活力、總根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)、根系分枝數(shù)、根系交叉數(shù)分別比CK2 處理提高了45.29%、34.41%、42.60%、53.45%、50.00%、57.79%、48.30%。施用DADS 的各處理根部直徑與CK2 處理無顯著差異。

2.3 外源DADS對(duì)自毒作用下大白菜幼苗葉綠素含量的影響

外源DADS 處理對(duì)自毒作用下大白菜幼苗的葉綠素含量測(cè)定結(jié)果（表2）顯示，CK2 處理的葉綠素含量均顯著低于CK1 處理，施加外源DADS 后幼苗葉綠素含量先升后降，總體高于CK2，其中D5 處理作用最好，大白菜幼苗葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和葉綠素（a+b）分別比CK2 處理提高18.97%、20.39%、17.16% 和19.42%。

2.4 外源DADS對(duì)自毒作用下大白菜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和MDA含量的影響

由圖3 可見，施用DADS 后，對(duì)比CK2 處理，大白菜葉片可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量隨濃度增加呈先升后降趨勢(shì)，以D5 處理（5 μmol/L）最高，其可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量分別高于CK2 處理12.97%、16.72 %和36.63%。

自毒作用導(dǎo)致CK2處理的大白菜幼苗MDA含量比CK1 顯著升高，而外源施用DADS 均可降低MDA積累，隨濃度增加呈先降后升趨勢(shì)，D1、D5和D10處理的MDA 含量分別比CK2 處理降低了8.96%、20.58%和7.32%，其中D5 處理降低最顯著（圖3D）。

2.5 外源DADS對(duì)自毒作用下大白菜幼苗抗氧化酶活性的影響

大白菜幼苗各處理抗氧化酶活性測(cè)定結(jié)果如圖4 所示，對(duì)比CK2 處理，施用DADS 后大白菜幼苗抗氧化酶活性隨處理濃度增加呈先升后降趨勢(shì)，以D5處理（5 μmol/L）最高，其SOD、POD 和CAT 活性比CK2 分別著增加了30.75%、27.44% 和17.68%。

2.6 外源DADS對(duì)自毒作用下大白菜幼苗活性氧積累的影響

DAB 組織化學(xué)染色結(jié)果（圖5）顯示，CK2 處理比CK1 的葉片染色深，棕褐色沉淀面積明顯增加，過氧化氫累積含量較高；重茬液中添加不同濃度DADS后，棕褐色沉淀程度比CK2 淺及面積小，隨濃度增加呈現(xiàn)先淺后深的趨勢(shì)，以D5 處理（5 μmol/L DADS）棕褐色沉淀最淺，說明過氧化氫累積含量最少。NBT可與超氧陰離子反應(yīng)生成藍(lán)紫色沉淀物質(zhì)，用于觀察植物組織中的超氧陰離子的積累情況。藍(lán)紫色沉淀物質(zhì)越多，說明超氧陰離子積累量越多。CK2 處理比CK1 處理染色程度加深，藍(lán)紫色斑點(diǎn)明顯增加，表明超氧陰離子積累量較多；重茬液中添加不同濃度DADS 后，棕褐色沉淀程度比CK2 淺及面積小，隨濃度增加呈現(xiàn)先淺后深的趨勢(shì)，D5處理藍(lán)紫色沉淀明顯減少，斑點(diǎn)顏色減輕，活性氧積累明顯降低（圖5）。

3 討論

DADS 作為一種生物刺激素可參與植物的整個(gè)生長(zhǎng)周期，如通過增強(qiáng)植物的新陳代謝來提高生物量，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生刺激反應(yīng)，使其生長(zhǎng)更快，尤其在逆境條件下處理效果更明顯［14-15］。DADS 可促進(jìn)番茄幼苗防御反應(yīng)的發(fā)生，使番茄的生長(zhǎng)和發(fā)育更好［16］。本研究中添加DADS 可在一定程度上緩解大白菜幼苗的自毒作用，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)和生物量積累，這與前人報(bào)道的結(jié)果［9］一致。大白菜遭受自毒作用后，添加DADS 處理的大白菜幼苗株幅、最大葉長(zhǎng)和葉寬均增加，地上部和地下部干鮮質(zhì)量均明顯高于CK2 處理組，尤其以5 μmol/L DADS 表現(xiàn)最佳。

DADS 與生長(zhǎng)素的生物合成密切相關(guān)，DADS通過調(diào)控番茄和黃瓜幼苗中的生長(zhǎng)素含量來促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂和根系生長(zhǎng)［10］。Cheng 等［17］研究結(jié)果表明，DADS 可以通過促進(jìn)細(xì)胞分裂、調(diào)控內(nèi)源激素水平和擴(kuò)展蛋白基因表達(dá)來促進(jìn)番茄的根系生長(zhǎng)。本研究中，DADS 可通過調(diào)控大白菜幼苗根系發(fā)育來緩解自毒作用的影響。在自毒作用脅迫下，施用DADS 明顯提高了大白菜幼苗的根系活力、根長(zhǎng)和根尖數(shù)，增強(qiáng)了抵御自毒作用的能力，這可能與DADS 參與調(diào)控植物地下部的發(fā)育有關(guān)。

DADS 是大蒜素分解后的有機(jī)硫化合物。許多研究表明，在受體植物葉面噴施大蒜鱗莖水浸提液、土壤添加腐熟大蒜莖或套種大蒜均可提高植物葉綠素、類胡蘿卜素含量和凈光合速率［18-20］。Cheng等［21］報(bào)道，DADS 可消減番茄的連作障礙，這可能是由于DADS 處理使得番茄的光合色素增加，改善了源庫關(guān)系以及水分和營養(yǎng)的吸收，增強(qiáng)了植株的光合同化作用。因此，DADS 在一定程度上能保護(hù)植物的光合系統(tǒng)。本研究發(fā)現(xiàn)大白菜幼苗在遭受自毒作用時(shí)，光合作用會(huì)受到抑制，CK2 處理顯著降低幼苗葉片的葉綠素a、b 及總?cè)~綠素含量。施用DADS各處理的葉綠素a、b 及總?cè)~綠素含量均有不同程度的增加，說明DADS 在一定程度上能保護(hù)植物光合系統(tǒng)遭受逆境傷害。

在抵御逆境脅迫時(shí)，植物的滲透調(diào)節(jié)能力也會(huì)提高。程芳［9］用番茄連作地的土壤浸提液和DADS共同處理番茄幼苗，番茄葉片和根系的可溶性蛋白含量均顯著增加。Ali 等［22］用適宜濃度的大蒜水提取物使茄子幼苗中的可溶性蛋白含量增加。王夢(mèng)怡［23］和肖雪梅［24］研究認(rèn)為，青蒜與春茬、秋茬黃瓜套作和大蒜與茄子套作均可降低葉片中MDA 含量，本研究得到類似的結(jié)果。在重茬液中施用5 μmol/LDADS 后，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量均顯著高于CK2 處理組，同時(shí)MDA 含量顯著降低，這表明DADS 對(duì)細(xì)胞膜具有一定的修復(fù)和保護(hù)作用，減輕自毒脅迫對(duì)膜系統(tǒng)的傷害。

自毒物質(zhì)在一定濃度下會(huì)使植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧積累增加，迫使植物細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高抗氧化酶活性來抵御逆境傷害。程芳［9］研究認(rèn)為，DADS 可以通過提高番茄防御酶基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)抗氧化酶活力，減輕番茄自毒作用造成的傷害。Yang 等［25］從青蒜中提取的揮發(fā)性有機(jī)物DADS 能降低超氧陰離子，還可調(diào)節(jié)抗氧化酶（SOD、CAT、POD）的活性、抗氧化物質(zhì)（MDA、GSH 和ASA）的含量和基因（CscAPX、CsGPX、CsMDAR、CsSOD、CsCAT、CsPOD）的表達(dá)來抵御逆境脅迫。DADS 能夠緩慢釋放H2S［26］，使細(xì)胞中積累少量H2S，積累的H2S 又可以調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和調(diào)控抗氧化系統(tǒng)，進(jìn)而減輕多種非生物脅迫對(duì)植物造成的傷害［27-28］。在本研究中，大白菜幼苗受到自毒作用脅迫后施用DADS，保護(hù)酶SOD、POD 和CAT 活性較CK2 處理組顯著升高，H2O2、O2?·積累速率下降，減輕了氧化脅迫對(duì)幼苗造成的傷害。

綜上，適宜濃度的外源DADS 對(duì)大白菜幼苗的自毒作用具有緩解效應(yīng)，以施加濃度為5 μmol/L 的效果最為理想，可顯著提高幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性，降低活性氧水平，并在一定程度上增加葉片葉綠素含量，促進(jìn)大白菜幼苗的生長(zhǎng)與干物質(zhì)的積累，從而緩解自毒脅迫對(duì)大白菜幼苗的傷害。