關(guān)鍵詞 ‘東試早柚’； 雄性不育； 自交不親和； 單性結(jié)實(shí)

柑橘在我國(guó)鮮果市場(chǎng)中占據(jù)十分重要的地位，2022 年全國(guó)柑橘總產(chǎn)量 6 000 余萬(wàn)t，占全球柑橘產(chǎn)量的近40%（FAOSTAT 數(shù)據(jù)庫(kù)）。我國(guó)柑橘品種培育以易剝皮、有香氣、風(fēng)味足及無(wú)核等為主要目標(biāo)［1］。在柑橘市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)日益激烈的大環(huán)境中，廣大消費(fèi)者更加青睞無(wú)核或少籽的柑橘優(yōu)良品種。無(wú)核品種因食用方便，加工簡(jiǎn)單且成本低等優(yōu)點(diǎn)，往往被市場(chǎng)保留下來(lái)。

柑橘無(wú)核成因主要包括雄性不育、胚囊敗育、胚乳敗育、自交不親和及環(huán)境因素等。雄性不育在柑橘中是非常普遍的現(xiàn)象，也是導(dǎo)致柑橘無(wú)核的主要原因，表現(xiàn)為花粉敗育［2］，如‘馬敘葡萄柚’、溫州蜜柑、‘華柚2 號(hào)’‘華農(nóng)本地早橘’等。王蓉［3］利用細(xì)胞學(xué)、多組學(xué)及sRNA-seq（小RNA 測(cè)序）發(fā)現(xiàn)Cs?miR399a.1 是調(diào)控柑橘雄性不育及生殖器官發(fā)育的重要因子。此外，雌性不育也是導(dǎo)致柑橘無(wú)核的重要原因，其主要包括胚囊敗育和胚乳敗育［4］。肖金平等［5］通過(guò)切片觀察到‘麗椪2 號(hào)’胚囊母細(xì)胞在后期完全退化，表明其無(wú)核是由胚囊敗育導(dǎo)致的；‘桂林良豐’無(wú)核的原因同樣也是胚囊敗育引起的［6］。而胚乳敗育導(dǎo)致的柑橘無(wú)核，一般是由2x × 4x 與4x ×2x 倍性雜交引起的，打破了正常種子胚和胚乳的倍性比，使胚乳敗育，進(jìn)而導(dǎo)致種子敗育［7］。

在柑橘中，自交不親和及單性結(jié)實(shí)也是導(dǎo)致其果實(shí)無(wú)核的重要原因。自交不親和性（self-incompat?ibility， SI）是指植物拒絕或抑制自身的花粉進(jìn)入花柱而防止自交，促使異交的現(xiàn)象，是植物調(diào)節(jié)自身來(lái)適應(yīng)環(huán)境變化的一種進(jìn)化策略［8-9］。這個(gè)機(jī)制保證了植物后代具有豐富的遺傳背景，最大限度地使植物更好地適應(yīng)惡劣的生存環(huán)境，避免被自然淘汰［10］。自交不親和性一般由S 位點(diǎn)的復(fù)等位基因控制，S 位點(diǎn)中的S-RNase 蛋白稱為花柱決定因子。Liang等［11］利用全基因組重測(cè)序及RNA-seq 數(shù)據(jù)，確定參與柑橘自交不親和的9 個(gè)S-RNase 復(fù)等位基因，并且明確不同柑橘品系一般具有不同的S-基因型。單性結(jié)實(shí)是指一些品種在沒(méi)有授粉的情況下果實(shí)發(fā)育的現(xiàn)象；單性結(jié)實(shí)可分為刺激性單性結(jié)實(shí)和天然單性結(jié)實(shí)［12］。當(dāng)自交不親和及單性結(jié)實(shí)能力同時(shí)存在時(shí)，就可產(chǎn)生無(wú)核果實(shí)。

‘東試早柚’是云南西雙版納東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)站實(shí)生選育的特早熟無(wú)核優(yōu)良品種，故稱為‘東試早柚’，是云南熱帶亞熱帶地區(qū)主要的柚栽培品種之一，在全省種植面積達(dá)0.8 萬(wàn)hm2以上，且種植面積仍呈上升趨勢(shì)［13］。但隨著‘東試早柚’產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，許多產(chǎn)區(qū)的果實(shí)多籽，其無(wú)核性狀表現(xiàn)不穩(wěn)定，也成為制約其進(jìn)一步發(fā)展的重要原因。因此，本研究利用醋酸洋紅和苯胺藍(lán)染色法、雜交授粉及分子標(biāo)記等手段探究‘東試早柚’無(wú)核成因，以期為其果實(shí)品質(zhì)提質(zhì)增效、雜交育種、品種培育及該產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試柑橘材料包括：西雙版納州景洪市熱帶作物科學(xué)研究所柚試驗(yàn)基地的以‘酸柚’為砧木的23 年生‘ 東試早柚’（Citrus grandis ［L.］ Osbeck cv.‘Dongshi Zaoyou’）和湖北武漢市洪山區(qū)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家柑橘種質(zhì)資源圃的以‘酸柚’為砧木的8 年生‘沙田柚’（Citrus grandis［ L.］ Osbeck cv.‘ Shatiany?ou’）及‘沙田柚’ב東試早柚’的F1代雜交群體。

1.2 醋酸洋紅染色法及花粉活力檢測(cè)方法

醋酸洋紅染色液的配置參照文獻(xiàn)［14］的方法并作適當(dāng)修改。稱取1 g 洋紅于100 mL 45% 醋酸中煮沸，冷卻過(guò)濾后加入4% 鐵明礬，避光保存于棕色瓶中備用。

花粉活力測(cè)定：載玻片涂上醋酸洋紅染色液，用鑷子取出花藥，搗碎釋放花粉粒，染色5 min，使用光學(xué)顯微鏡觀察花粉活力。用于檢測(cè)花粉活力的花粉2 264 粒。

1.3 花粉萌發(fā)力檢測(cè)方法

花粉培養(yǎng)基的制備參照譚美蓮［15］的方法并作適當(dāng)修改。具體成分包括：0.02% MgSO4、0.01%KNO3、0.03% Ca（NO3）2、0.01% H3BO3、15% PEG-4000 以及20% 蔗糖，pH 6.0。花粉萌發(fā)力測(cè)定：用毛筆蘸取少量花粉，撥彈于培養(yǎng)基中，在恒溫（28±2） ℃培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)12 h 后，用剪去槍尖的槍頭吸取萌發(fā)的花粉于載玻片上壓片，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察花粉萌發(fā)情況，當(dāng)花粉萌發(fā)長(zhǎng)度大于花粉粒直徑時(shí)視為萌發(fā)。用于檢測(cè)花粉萌發(fā)力的花粉數(shù)量共505 粒。

1.4 自交和雜交授粉后親和性鑒定方法

自交授粉親和性鑒定試驗(yàn)于2022 年2 月11―12 日在西雙版納進(jìn)行，花粉的采集、保存及授粉參照朱晨橋［16］的方法。苯胺藍(lán)染色法采集已授粉后7 d 的花朵，用鑷子取出雌蕊部分置于現(xiàn)配的固定液（無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1）中，固定時(shí)間24 h，用95% 乙醇洗滌2 遍后，置于70% 乙醇，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。親和性鑒定時(shí)棄70% 乙醇，蒸餾水洗滌2～3遍，花柱于4 mol/L NaOH 65 ℃恒溫蒸煮1.5 h，中間顛倒2～3 次，待花柱由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)槌燃t色，棄NaOH 溶液，用蒸餾水每間隔30 min 洗1 遍，直至花柱由橙紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S白色，0.1% 苯胺藍(lán)染料染色。加2～3 滴70% 甘油于載破片上，蓋上蓋玻片，按壓至鋪平，倒置熒光顯微鏡觀察花粉管的生長(zhǎng)情況［17］。雜交授粉親和性鑒定試驗(yàn)于2022 年4 月11日在武漢進(jìn)行。

1.5 去雄和非去雄套袋處理

去雄套袋處理為刺激性單性結(jié)實(shí)，選擇‘東試早柚’即將開(kāi)放的頂端花蕾，去除已開(kāi)放花朵、小花蕾及畸形花，用鑷子小心剝開(kāi)花瓣，去除花藥，保留花絲，盡量不損傷雌蕊，立即套袋，用回旋針固定，作好標(biāo)記。非去雄套袋處理則為天然單性結(jié)實(shí)，選擇‘東試早柚’即將開(kāi)放的頂端花蕾，直接套袋。套袋85 d后統(tǒng)計(jì)其座果數(shù)。

1.6 利用S-RNase 鑒定雜交子代

‘東試早柚’及雜交子代葉片DNA 提取參照程運(yùn)江［18］的方法。利用已知的2 個(gè)S?RNase 基因序列［19］設(shè)計(jì)特異性引物（表1），在‘東試早柚’和‘沙田柚’及雜交子代中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系20μL，各組分為10.0 μL 2×Taq Mix，0.5 μL F（正向引物10 mmol/L），0.5 μL R（反向引物10 mmol/L），1.0 μL DNA（模板300 ng/L），8.0 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10min，4 ℃保存。1.0% 瓊脂糖凝膠（0.5×TBE 緩沖液）電泳檢測(cè)，Goldview（廣州健陽(yáng)生物技術(shù)有限公司）顯色后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和整理，使用Adobe PhotoshopCC 2019 軟件對(duì)原始圖片進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘東試早柚’生長(zhǎng)習(xí)性觀察

‘東試早柚’樹(shù)形一般為自然開(kāi)心形，樹(shù)勢(shì)強(qiáng)、花量大、花器官較大，花期以2 月上旬至3 月上旬為主，在熱帶地區(qū)具有周年開(kāi)花的特性。座果一般以當(dāng)年12 月及翌年2 月開(kāi)花為主，果實(shí)特早熟，可于7 月下旬至8 月上旬上市。果型呈倒卵形，果皮和果肉淺黃色，果皮易剝，果肉多汁且化渣性好，有香味［13］。在云南熱帶地區(qū)，‘東試早柚’的容器苗栽植3～5 a 后可進(jìn)入盛產(chǎn)期。從形態(tài)學(xué)的角度對(duì)‘東試早柚’無(wú)核成因進(jìn)行分析，解剖其花結(jié)構(gòu)，觀察發(fā)現(xiàn)花柄、花托、花萼、花瓣、花藥和花絲（雌蕊）、花柱和柱頭及子房（雄蕊）等花結(jié)構(gòu)均發(fā)育正常且完整，大部分為正常花（圖1），幾乎無(wú)畸形花。同時(shí)，觀察到‘東試早柚’未散粉前的花藥充盈飽滿，散粉后呈橙黃色，與正常的大多數(shù)柑橘品種的雄蕊花藥花粉表型特征一致。

2.2 ‘東試早柚’花粉活力及花粉萌發(fā)力檢測(cè)

‘東試早柚’花粉染色活力結(jié)果如圖2 A、表2 所示，5 個(gè)視野內(nèi)具有染色活力的花粉比率分別為94.19%、94.80%、93.99%、95.45%、95.58%，花粉活力比率均值為94.80%?！畺|試早柚’花粉萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，5 個(gè)視野內(nèi)花粉萌發(fā)率分別為89.31%、90.21%、89.22%、80.65%、81.63%，萌發(fā)率均值為86.20%（圖2B、表2）。結(jié)果表明，‘東試早柚’的花粉均具有較高的花粉活力及花粉萌發(fā)力。

2.3 ‘東試早柚’自交和雜交親和性及F1 代雜種鑒定

觀察‘東試早柚’自交授粉后花粉管的生長(zhǎng)萌發(fā)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)大量的花粉粒在花柱頂端萌發(fā)，但花粉管向子房伸長(zhǎng)卻受到抑制而停止生長(zhǎng)（圖3A），表現(xiàn)為不親和狀態(tài)。同時(shí)，以‘沙田柚’為母本、‘東試早柚’為父本進(jìn)行雜交授粉，觀察發(fā)現(xiàn)大量的花粉管向下延伸穿過(guò)花柱能夠到達(dá)雌蕊基部（圖3B），表現(xiàn)為親和狀態(tài)。

待果實(shí)成熟后采摘‘沙田柚’ב東試早柚’雜交果實(shí)，取其種子進(jìn)行催芽播種，共獲得F1代雜交群體175 株。通過(guò)S 基因型鑒定發(fā)現(xiàn)，‘東試早柚’的S 基因型為S5、S6（圖4），并進(jìn)一步利用‘東試早柚’SRNase對(duì)F1 代雜交群體進(jìn)行遺傳鑒定，擴(kuò)增結(jié)果表明：在F1代中有85 株雜交后代含有與其父本相同的S5-RNase 特異性條帶，79 株雜交后代含有與其父本相同的S6-RNase 特異性條帶，11 株雜交后代未檢測(cè)到與其父本相同的S-RNase 特異性條帶（圖5）。因此共獲得以‘ 東試早柚’為父本的真雜種后代164 株。

2.4 ‘東試早柚’單性結(jié)實(shí)能力鑒定

單性結(jié)實(shí)一般是指在子房未經(jīng)授粉或授粉但未受精而產(chǎn)生無(wú)核果實(shí)的性狀。2021―2022 年對(duì)‘東試早柚’進(jìn)行去雄套袋和非去雄套袋的田間重復(fù)性試驗(yàn)，第1 年去雄套袋30 朵，掛果數(shù)為1，座果率為3.33%，非去雄套袋70 朵，座果數(shù)為9，座果率為12.86%；第2 年去雄套袋200 朵，掛果數(shù)為29，座果率為14.50%，非去雄套袋200 朵，掛果數(shù)為60，座果率為30.00%（表3）。連續(xù)2 a 的去雄套袋和非去雄套袋平均座果率分別為13.04%、25.56%。結(jié)果表明，‘東試早柚’具有較強(qiáng)的單性結(jié)實(shí)能力，其非去雄套袋的座果率顯著高于去雄套袋的座果率。

3 討論

植物界顯花植物的花一般由花托、花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊構(gòu)成，而雄蕊由花絲和花藥構(gòu)成，花絲主要負(fù)責(zé)花藥所需各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，花藥則是產(chǎn)生花粉粒的器官，因此花藥能否正常發(fā)育很大程度上決定了植物的育性［20］。根據(jù)花藥敗育的形式，雄性不育可分為花藥原基、絨氈層細(xì)胞、花粉壁、減數(shù)分裂和胼胝質(zhì)代謝異常等類型［21］。葉麗霞［14］通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察‘華農(nóng)無(wú)核椪柑’花藥發(fā)育過(guò)程發(fā)現(xiàn)，‘華農(nóng)無(wú)核椪柑’花藥散粉較少，花粉粒多數(shù)無(wú)活性，在體內(nèi)外都無(wú)法正常萌發(fā)且減數(shù)分裂異常。李蒙蒙［22］基于石蠟切片及掃描電鏡等方法發(fā)現(xiàn)，‘拋橘’花粉的染色活力和花粉萌發(fā)力處在一個(gè)正常的水平且花粉粒超微結(jié)構(gòu)形態(tài)大部分為正常形態(tài)，排除了‘拋橘’雄性不育的可能性。本研究從形態(tài)學(xué)角度對(duì)‘東試早柚’的花進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，其雄蕊、雌蕊等花結(jié)構(gòu)發(fā)育完整，且肉眼觀察到花藥及花粉與正常的柑橘品種表現(xiàn)相近，因此排除畸形花是其無(wú)核的可能。此外，本研究檢測(cè)了‘東試早柚’花粉活力比率、花粉萌發(fā)率，二者均處于較高水平，因此可初步排除雄性不育是導(dǎo)致其無(wú)核的可能。

柑橘自交不親和是指花結(jié)構(gòu)完整且生殖系統(tǒng)均能正常發(fā)育，如‘琯溪蜜柚’‘緬甸柚’等［19］，但發(fā)育成熟的花粉在花柱頂端受到阻止或干擾而不能向下生長(zhǎng)，這也是導(dǎo)致柑橘無(wú)核的普遍原因之一［23］。梁梅［19］基于甜橙及克里曼丁橘測(cè)序數(shù)據(jù)和60 份柚資源的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，定位到控制柑橘自交不親和性的S?RNase 基因。韋壯敏等［24］利用同樣的方法，挖掘到柑橘S 遺傳位點(diǎn)12 個(gè)新的S?RNase 基因并鑒定了63份柚材料的S 基因型。因此，S 基因型可作為分子標(biāo)記用于種質(zhì)鑒定，馮意斯［25］利用多對(duì)S-RNase 多態(tài)性引物鑒定了93 份三倍體‘沃柑’子代的遺傳背景，明確其中2 份子代為‘砂糖橘’和‘沃柑’的雜交后代，而其余91 份三倍體后代可能為‘沃柑’自交授粉后染色體同源重組產(chǎn)生的。本研究觀察發(fā)現(xiàn)‘東試早柚’自交授粉表現(xiàn)為不親和，同時(shí)以‘東試早柚’為父本、‘沙田柚’為母本進(jìn)行雜交授粉，鑒定表現(xiàn)為親和，表明自交不親和性是導(dǎo)致其無(wú)核的重要成因，而雜交親和則是導(dǎo)致部分產(chǎn)區(qū)無(wú)核性狀不穩(wěn)定的重要原因。此外，‘沙田柚’ב東試早柚’雜交果實(shí)成熟后，利用‘東試早柚’S-RNase 從雜交子代中共鑒定到164 株為真雜種后代，且子代中含有S5-RNase 與S6-RNase 比值約為1。綜合以上結(jié)果，‘東試早柚’果實(shí)無(wú)核并非由雄性不育引起。

單性結(jié)實(shí)是許多作物產(chǎn)生無(wú)核果實(shí)的重要原因。目前柑橘品種溫州蜜柑、‘黔陽(yáng)無(wú)核’椪柑、克里曼丁橘和大多數(shù)臍橙等均具有一定的單性結(jié)實(shí)能力和座果率［26-28］。趙科科［29］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及關(guān)鍵基因的挖掘及功能分析，初步解析了‘琯溪蜜柚’和‘沙田柚’單性結(jié)實(shí)的生理和細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，并明確了‘琯溪蜜柚’單性結(jié)實(shí)能力顯著高于‘沙田柚’。本研究對(duì)‘東試早柚’進(jìn)行去雄套袋和非去雄套袋處理來(lái)探究其單性結(jié)實(shí)能力，連續(xù)2 a 的田間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，去雄套袋后平均座果率（13.04%）顯著低于非去雄套袋平均座果率（25.56%），表明‘東試早柚’具有較強(qiáng)的單性結(jié)實(shí)能力，且天然單性結(jié)實(shí)能力高于刺激性單性結(jié)實(shí)，推測(cè)原因可能是由于去雄處理過(guò)程損傷了花柱、花瓣和花絲等花結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其刺激性單性結(jié)實(shí)能力下降。

在柑橘無(wú)核機(jī)制研究中，雄性不育、自交不親和等因素是導(dǎo)致果實(shí)無(wú)核的重要原因。本研究利用形態(tài)學(xué)、分子標(biāo)記等方法雖初步厘清了自交不親和性和單性結(jié)實(shí)是‘東試早柚’無(wú)核的重要成因，但未解析其相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。未來(lái)可進(jìn)一步利用基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組等多組學(xué)手段，探究‘東試早柚’自交不親和、單性結(jié)實(shí)及自交不親和與單性結(jié)實(shí)之間的相互作用來(lái)解析其無(wú)核成因的分子機(jī)制。