關(guān)鍵詞 豬； 精液凍融； 冷凍保護(hù)劑； 凍精解凍劑； 精液理化性質(zhì)

豬精液冷凍是指以液氮為冷凍介質(zhì)將精液保存于超低溫環(huán)境（-196 ℃）下，進(jìn)而抑制精子的生理代謝活動(dòng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)精液長(zhǎng)期保存的一種方法。精液冷凍流程主要包括精液采集、凍前處理、凍前降溫平衡、添加冷凍保護(hù)劑、程序性冷凍，精液解凍流程主要包括加熱解凍、添加解凍稀釋液、解凍后精液質(zhì)量評(píng)估等。雖然豬精液凍融技術(shù)存在解凍后精子活力低的問(wèn)題，但若該技術(shù)能在生產(chǎn)上規(guī)模應(yīng)用，不僅可提高優(yōu)秀種公豬利用率，而且可降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)，提高生豬的生產(chǎn)效率。因此，本文針對(duì)目前豬精液凍融技術(shù)進(jìn)行綜述，旨在為從事豬精液凍融技術(shù)研發(fā)的科研人員了解該方向研究的最新動(dòng)態(tài)提供參考，進(jìn)而為豬精液凍融技術(shù)的完善提高并實(shí)現(xiàn)在養(yǎng)豬生產(chǎn)上的規(guī)模應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 豬冷凍精液發(fā)展概況及主要技術(shù)流程

人工授精技術(shù)變革了豬的繁殖方式并促進(jìn)了生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，如今93% 以上的生豬生產(chǎn)都采用人工授精技術(shù)。豬精液的冷凍研究始于20 世紀(jì)50年代，國(guó)內(nèi)外研究人員主要對(duì)冷凍稀釋液、冷凍保護(hù)劑、平衡時(shí)間、冷凍劑型、冷凍方法等開展了大量研究。1970 年，Polge 等 ［1］在英國(guó)首次成功使用凍融后的精液進(jìn)行人工授精并獲得健康仔豬。1973 年，Sal?amon 等［2］采用顆粒凍精進(jìn)行人工授精，成功使5 頭母豬妊娠，產(chǎn)仔數(shù)平均為7.6 頭。20 世紀(jì)80 年代后，豬冷凍精液的主流劑型和方法由顆粒形式、干冰制備逐漸改為細(xì)管形式、液氮熏蒸。我國(guó)廣西地區(qū)在20 世紀(jì)80 年代使用凍融精液進(jìn)行人工授精配種母豬頭數(shù)達(dá)6 萬(wàn)頭以上， 受胎率接近76%，平均窩產(chǎn)仔數(shù)達(dá)9 頭以上［3］。日本在1991 年使用凍融精液進(jìn)行人工授精，配種分娩率為72.3%，平均窩產(chǎn)仔數(shù)8.0頭［4］。雖然豬精液冷凍技術(shù)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但仍存在凍融后的精子損傷大、活力低及受精能力弱等問(wèn)題，導(dǎo)致該技術(shù)的使用率較低［5］。

豬精液冷凍的流程包括精液的采集、凍前處理、凍前降溫平衡、添加冷凍保護(hù)劑和冷凍處理。冷凍處理的方式有緩慢冷凍和快速冷凍（玻璃化冷凍）。緩慢冷凍方法包括干冰冷凍、液氮熏蒸和程序冷凍儀冷凍。緩慢冷凍過(guò)程中，精子在含有冷凍保護(hù)劑的稀釋液中，通過(guò)逐步降溫的方法進(jìn)行冷凍?？焖倮鋬鍪鞘褂酶邼舛鹊睦鋬霰Ｗo(hù)劑，讓精子和冷凍溶液在冷凍時(shí)呈現(xiàn)黏稠而不產(chǎn)生結(jié)晶的玻璃化狀態(tài)。解凍過(guò)程主要分為低溫慢速解凍和高溫快速解凍。在解凍劑中可添加促精子復(fù)蘇物質(zhì)、抗損傷物質(zhì)來(lái)提高解凍后精子的活力。目前解凍程序主要有低溫解凍（0～5 ℃）、中溫解凍（30～40 ℃）、高溫解凍（50～70 ℃），解凍時(shí)間有20、16 和8 s 等。

在豬精液預(yù)處理降溫過(guò)程中，不同豬個(gè)體的精子對(duì)“低溫打擊”敏感度存在明顯差異，這反映了不同豬個(gè)體的精子耐凍性（freezability）存在差別。根據(jù)凍精解凍后質(zhì)量評(píng)定的高低可將精液來(lái)源分為好（good freezers）和差（bad freezers）2 種，簡(jiǎn)稱為GFE（good freezability ejaculates）和PFE（poor freezabilityejaculates）［6］，或GSF（good semen freezability）和PSF（poor semen freezability）［7］。造成精液來(lái)源存在質(zhì)量差異的機(jī)制尚不清楚，推測(cè)遺傳差異可能是其耐凍性差異的基礎(chǔ)。

2 影響豬精液凍融后精子活力的關(guān)鍵因素

2.1 豬精液冷凍稀釋液和冷凍保護(hù)劑

常見的豬精液冷凍稀釋液有2 種，一種是乳糖-蛋黃體系（lactose egg yolk， LEY），一種是貝爾茨維爾體系（beltsville freezing extender 5， BF5）［8］，這2 種稀釋液均需添加新鮮蛋黃。精液在稀釋時(shí)有一步稀釋法和兩步稀釋法，一步稀釋法是直接將精液與含有冷凍保護(hù)劑的稀釋液按比例進(jìn)行混合，兩步稀釋法是先將精液與不含冷凍保護(hù)劑的稀釋Ⅰ液按比例混合，后經(jīng)降溫平衡再與含冷凍保護(hù)劑的稀釋Ⅱ液進(jìn)行混合，再經(jīng)降溫平衡后進(jìn)行冷凍。

在兩步稀釋法中，稀釋Ⅱ液通常添加冷凍保護(hù)劑（cryoprotectant agents， CPA），CPA 分為滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑。滲透性冷凍保護(hù)劑最常用的是甘油，此外還有二甲基亞砜、乙二醇、甲醇、丙二醇和二甲基乙酰胺等，該類物質(zhì)通過(guò)與氫鍵相互作用高度溶于水并能透過(guò)質(zhì)膜。甘油在高于5 ℃時(shí)會(huì)干擾細(xì)胞的代謝，因此在使用甘油時(shí)需在低溫條件下將甘油與精液混合。研究表明甘油添加量為2% 和4% 時(shí)會(huì)破壞豬精子的核膜［9］，高于4% 時(shí)會(huì)影響質(zhì)膜流動(dòng)性，高于6% 則會(huì)影響豬精子的運(yùn)動(dòng)性和頂體完整性［10］，因此，目前精液冷凍過(guò)程中甘油添加量一般以3% 為宜。

非滲透性冷凍保護(hù)劑最常用的是新鮮蛋黃，此外還有牛奶、羥乙基等聚合物，如右旋糖酐、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮等。相較于甘油，蛋黃物質(zhì)起到的冷凍保護(hù)效果更佳，但蛋黃物質(zhì)對(duì)蛋黃的新鮮程度有很高要求，且其生物安全性很難得到保障。目前可使用從蛋黃中提取的低密度脂蛋白（low den?sity lipoprotein， LDL）代替蛋黃作為冷凍保護(hù)劑，研究表明，添加0.09 g/mL LDL 可具有很好的精液冷凍保護(hù)效果［11］。大豆卵磷脂同樣富含LDL，有研究證實(shí)大豆卵磷脂可替代蛋黃作為冷凍保護(hù)劑，當(dāng)添加5% 大豆卵磷脂進(jìn)行精液冷凍時(shí)可達(dá)到最佳的冷凍效果，這些替代方法可減少使用蛋黃所存在的潛在生物安全性問(wèn)題［12］。Equex STM 也是一種常用的冷凍保護(hù)劑，它是基于十二烷基硫酸鈉和三乙醇胺的合成物質(zhì)，因Equex STM 和蛋黃結(jié)合時(shí)可從蛋黃中提取更多的脂質(zhì)或脂蛋白到冷凍液中，進(jìn)而可顯著提高精子的凍融質(zhì)量和受精能力［13-14］。筆者總結(jié)了近些年來(lái)在豬冷凍稀釋液中添加不同冷凍保護(hù)劑對(duì)豬精子凍融后活力的影響，如表1 所示。

除上述常用的冷凍保護(hù)劑外，抗氧化劑常被添加到冷凍稀釋液中，如白藜蘆醇、谷氨酰胺、表兒茶素、綠原酸、α-硫辛酸、紅景天多糖、蝦青素等，但冷凍稀釋液中添加不同的抗氧化劑提高凍融后精子活力的水平不同（ 表2）。

2.2 豬精液凍前平衡和冷卻速度

凍前平衡指精液進(jìn)行程序化冷凍前要經(jīng)歷一段較長(zhǎng)時(shí)間的緩慢降溫平衡過(guò)程，該過(guò)程需要經(jīng)過(guò)2 個(gè)重要的溫度節(jié)點(diǎn)：17～15 ℃和5～4 ℃，豬精子經(jīng)歷最明顯的脂質(zhì)相變是在15～5 ℃。在降溫平衡過(guò)程中，當(dāng)由常溫降至10 ℃以下時(shí)精子會(huì)發(fā)生冷休克現(xiàn)象，當(dāng)繼續(xù)降溫至1～2 ℃時(shí)，冷休克現(xiàn)象仍然存在，并會(huì)導(dǎo)致更多的精子喪失生存能力。因此，精子在程序冷凍前需在15 ℃平衡2～3 h，以使精子逐漸獲得對(duì)抗冷休克的能力。在凍前平衡過(guò)程中，可通過(guò)每間隔40 min 輕微搖晃精液來(lái)防止精子發(fā)生冷休克現(xiàn)象。有研究表明降溫平衡過(guò)程可通過(guò)維持質(zhì)膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)增加精子的冷凍耐受性，為達(dá)到豬精液最佳冷凍效果，通常凍前降溫平衡時(shí)間為17～20 ℃保存24 h［26］。平衡降溫效果還與其他多種因素有關(guān)，如稀釋液的種類，當(dāng)稀釋液為AHP（Androhep?Plus）或ASP（Androstar? Plus）時(shí)，在10 ℃下平衡24h 的精子表現(xiàn)出更好的低溫耐受性，這主要是因?yàn)樵撓♂屢喊莿?dòng)物來(lái)源的細(xì)胞膜保護(hù)成分，會(huì)降低精子體外保存時(shí)對(duì)低溫的高度敏感性。當(dāng)乳糖-蛋黃（ 不含甘油）用作稀釋介質(zhì)時(shí)，在5 ℃下平衡4 h就能夠取得更好的冷凍效果［27］。

除凍前平衡外，程序性冷凍速度也對(duì)冷凍效果有很大影響。若冷卻速度過(guò)快，細(xì)胞內(nèi)的水分不能完全流出，導(dǎo)致水分在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)形成冰晶，冰晶將引起精子冷凍損傷；若冷凍速度過(guò)慢會(huì)導(dǎo)致脫水過(guò)多，使得細(xì)胞器及膜體積收縮，影響細(xì)胞膜脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物、致使大分子變性、誘導(dǎo)不可逆的膜融合，從而造成精子損傷。一般認(rèn)為豬精液最佳冷凍速度為30～50 ℃/min。采用0.5 mL 冷凍細(xì)管進(jìn)行程序性冷凍時(shí)，速度為20、40 或60 ℃/min 和液氮熏蒸均能提高豬精液的凍融效果［28-29］。

2.3 豬冷凍精液解凍

解凍劑種類較多，物質(zhì)成分各不相同。因此凍精使用不同解凍劑進(jìn)行解凍時(shí)，解凍時(shí)間和溫度沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。解凍劑的研究主要集中在精漿和抗氧化劑方面。精漿作為精液的組成部分，是自然條件下輸送精子的必需介質(zhì)，主要由蛋白質(zhì)組成，還含有一系列無(wú)機(jī)離子、鹽、糖、檸檬酸、前列腺素和電解質(zhì)，精漿還為精子存活提供了適合的生理?xiàng)l件，如酸堿度和滲透壓等。此外，精漿含有清除小分子自由基的功能，包括維生素C、尿酸、酪氨酸、還原型谷胱甘肽和亞牛磺酸等［30］。因此，精漿在維持精子生存能力及代謝、運(yùn)動(dòng)和獲能調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。

在解凍劑中添加精漿是否有利于精子活力的恢復(fù)仍存在爭(zhēng)議。眾多學(xué)者認(rèn)為冷凍前應(yīng)通過(guò)離心盡可能去除精漿，只留下富含精子的部分進(jìn)行冷凍［31-33］。在解凍時(shí)添加精漿可防止質(zhì)膜不穩(wěn)定及其他類似獲能的變化，因而添加精漿作為解凍介質(zhì)有利于維持質(zhì)膜的完整性，且添加精漿作為解凍介質(zhì)可維持精子活力，有助于精液在體外保存過(guò)程中維持由快速和線性運(yùn)動(dòng)精子組成的亞群。研究表明，添加50% 精漿可以最有效地維持精子的活力［34］。但也有研究發(fā)現(xiàn)在精子體外保存時(shí)，添加10% 的精漿并沒(méi)有對(duì)精子保護(hù)起到實(shí)質(zhì)性作用，與精子體外儲(chǔ)存能力喪失相關(guān)的因素是精液稀釋程度而非精漿的有無(wú)，精液稀釋倍數(shù)越高精液活力喪失越快［33］。另有研究認(rèn)為精漿在凍精解凍后的體外保存過(guò)程中對(duì)精子的存活是有害的，精漿中含有的內(nèi)毒素（脂多糖）已被確定為損害公豬精子耐凍性的原因之一，當(dāng)內(nèi)毒素（脂多糖）與精子表面存在的Toll 樣受體4 結(jié)合后可破壞質(zhì)膜的穩(wěn)定性［32］。精漿在凍精中的作用存在不同看法的原因可能與精漿的來(lái)源、精漿添加量及與精子接觸的時(shí)間、培養(yǎng)溫度等因素相關(guān)。除添加一定比例抗氧化劑可提高豬凍精解凍效果外，其他能夠激活精子的物質(zhì)還包括咖啡因，但咖啡因作為解凍劑成分來(lái)添加時(shí)會(huì)造成嚴(yán)重的多精受精現(xiàn)象。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，使用肌酸和β-甲基環(huán)糊素聯(lián)合處理可以使體外受精雙原核率達(dá)到70% 左右［35］。筆者總結(jié)了近些年在解凍劑中添加不同類型解凍保護(hù)物質(zhì)對(duì)精子凍融后活力的影響，詳見表3。

此外，解凍速度對(duì)精子活力有很大的影響，因而尋找合適的解凍平衡點(diǎn)至關(guān)重要。解凍溫度包括低溫解凍（0～5 ℃）、中溫解凍（30～40 ℃）和高溫解凍（50～70 ℃），且不同的解凍溫度對(duì)應(yīng)不同的解凍時(shí)間，如37 ℃解凍20 s、50 ℃解凍16 s、70 ℃解凍8 s 等。低溫解凍可能會(huì)導(dǎo)致重結(jié)晶現(xiàn)象，對(duì)精子造成進(jìn)一步的損傷，但損傷更多是由于滲透性冷凍保護(hù)劑不能快速排出所導(dǎo)致。有研究指出70 ℃解凍8 s 后，精子曲線運(yùn)動(dòng)速度（curvilinear velocity，VCL）、直線運(yùn)動(dòng)速度（straight-line velocity，VSL）、平均運(yùn)動(dòng)速度（average path velocity，VAP）和頭部擺動(dòng)振幅（ampli?tude of lateral head displscement，ALH）等指標(biāo)均優(yōu)于37 ℃解凍20 s［41］。

3 豬精液凍融過(guò)程中冷凍損傷及抗凍機(jī)制

3.1 豬精液凍融過(guò)程中物理結(jié)構(gòu)損傷對(duì)精子質(zhì)量的影響

細(xì)胞在冷凍和解凍過(guò)程中的物理結(jié)構(gòu)損傷除了低溫?fù)p傷，還包括中等低溫范圍（-15 ℃和-5 ℃）的致死性。冷凍流程涉及幾個(gè)重要溫度節(jié)點(diǎn)：15～5 ℃冷凍沖擊和-5～-50 ℃冰晶形成。當(dāng)溶液被快速降溫至-5 ℃和-15 ℃時(shí)會(huì)產(chǎn)生自發(fā)性的冰核，一旦冰核產(chǎn)生，隨著溫度的繼續(xù)降低將向所有方向快速增大，導(dǎo)致精子和溶質(zhì)都將被限制在未凍結(jié)的部分中，從-15 ℃到-160 ℃會(huì)促使一些小冰晶和液態(tài)水轉(zhuǎn)化為較大的冰晶，隨著冰晶的不斷形成，精子細(xì)胞只能不斷堆積到狹窄的未凍結(jié)溶液通道中，不可避免地對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷［42］。

冷凍保護(hù)劑可防止冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷，如甘油可通過(guò)氫鍵相互作用實(shí)現(xiàn)高度溶于水，并能透過(guò)細(xì)胞的質(zhì)膜，隨著冰晶的不斷形成，冷凍液中未結(jié)晶部分中甘油的濃度逐漸升高，從而降低了這部分未凍結(jié)溶質(zhì)的冰點(diǎn)，進(jìn)而抑制了冰晶的形成。甘油與水之間的氫鍵相互作用還可以抑制冰晶的擴(kuò)散，隨著未冷凍部分甘油的濃度不斷升高，溶質(zhì)玻璃化逐漸形成，有效減少了冰晶對(duì)精子細(xì)胞造成的機(jī)械損傷。因此在冷凍過(guò)程中，控制冰晶形成的大小和數(shù)量，維持冰晶在微晶狀態(tài)，可以更好地保護(hù)精子。

3.2 豬精液凍融過(guò)程中功能性損傷對(duì)精子質(zhì)量的影響

1） 氧化應(yīng)激對(duì)精子凍融的影響。氧化應(yīng)激會(huì)引起DNA 損傷，電子呼吸鏈和線粒體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)都會(huì)被過(guò)量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）破壞，而向精液中添加抗氧化劑可抑制ROS 引起的氧化損傷［43］。研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍過(guò)程中產(chǎn)生的ROS 并不多，低溫保存可降低線粒體產(chǎn)生ROS 的能力［44］。ROS 產(chǎn)生的時(shí)間主要在精液采集后稀釋及降溫平衡過(guò)程和解凍過(guò)程，精子ROS 的形成受精子內(nèi)源性抗氧化物介導(dǎo)，如位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的超氧化物歧化酶，但致使超氧化物歧化酶濃度升高的確切機(jī)制尚不清楚。

與氧化應(yīng)激關(guān)系密切的生物化學(xué)反應(yīng)是脂質(zhì)過(guò)氧化，ROS 和精子功能之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系涉及脂質(zhì)過(guò)氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，冷凍精子比新鮮精子表現(xiàn)出更高的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，而脂質(zhì)過(guò)氧化水平與4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal， 4-HNE）有關(guān)。4-HNE 是一種細(xì)胞毒性醛類物質(zhì)，同時(shí)是精子衰老的標(biāo)志物［45］。4-HNE 是一種強(qiáng)氧化劑，可以與蛋白質(zhì)、DNA 和脂質(zhì)等生物分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而引起細(xì)胞損傷。由于ROS 的生成，精子線粒體基因編碼的ETC 蛋白（MT-ND1，MT-ND6）以及MT-TFA 和POLRMT 被4-HNE 修飾，這類蛋白質(zhì)修飾被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵誘因，造成線粒體DNA 片段降解，轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和ETC 呼吸鏈均受到影響，進(jìn)而影響精子功能［46-47］。冷凍保存過(guò)程中精子內(nèi)蛋白和DNA結(jié)構(gòu)的變化是凍融精子活力下降的原因，凍融會(huì)影響精子頭部核蛋白的功能，誘導(dǎo)DNA 結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化及魚精蛋白磷酸化水平發(fā)生降低，從而改變精子核中魚精蛋白-1 與DNA 的相互作用，并破壞核蛋白半胱氨酸基團(tuán)之間的二硫鍵，進(jìn)而影響核蛋白和DNA 之間的結(jié)合。因此，精子在凍融過(guò)程中，ROS升高會(huì)導(dǎo)致DNA 片段損傷和精子核內(nèi)染色質(zhì)的變化，從而影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，最終導(dǎo)致精子損傷。

2）質(zhì)膜變化對(duì)精子凍融的影響。細(xì)胞質(zhì)膜一般由磷脂、可變數(shù)量的甾醇如膽固醇、一定數(shù)量的蛋白質(zhì)等構(gòu)成，磷脂賦予細(xì)胞膜流動(dòng)性，膽固醇維持剛性和穩(wěn)定性。隨著溫度降低，膜脂質(zhì)會(huì)經(jīng)歷物理相的變化，由流體相變?yōu)槟z相，甾醇的存在可抑制這種脂質(zhì)相的變化，但豬精子質(zhì)膜上膽固醇與磷脂比例低（豬：0.26，牛：0.45），且膽固醇分布不對(duì)稱，導(dǎo)致精子質(zhì)膜對(duì)低溫引起的脂質(zhì)物理相的變化更敏感，造成豬精子凍融效果差［48］。豬精子質(zhì)膜含有高比例的多不飽和脂肪酸，極易受到自由基的攻擊，這使得它對(duì)氧化應(yīng)激以及隨后的脂質(zhì)過(guò)氧化更加敏感。不飽和磷脂比其他磷脂更早膠凝并發(fā)生相分離。因此，在冷凍過(guò)程中完整的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入到膜內(nèi)結(jié)晶凝膠結(jié)構(gòu)域內(nèi)，造成蛋白質(zhì)聚集到剩余的液體脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域中，導(dǎo)致許多蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用喪失，最終導(dǎo)致完整膜蛋白通過(guò)脂質(zhì)相分離變得不可逆地聚集，膜脂質(zhì)被重組，部分膽固醇分子被釋放。目前有研究使用環(huán)糊素負(fù)載膽固醇處理精液，通過(guò)增加精子膜的膽固醇含量提高精子對(duì)低溫的耐受性，這可能是提高凍融精子質(zhì)量的一種較好的策略［49］。

膜冷凍損傷會(huì)對(duì)離子通道的功能造成影響，這也是凍融精子受精能力下降的原因。冷凍會(huì)導(dǎo)致精子蛋白質(zhì)豐度變化，Chen 等［50］通過(guò)比較新鮮和凍融的豬精子蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)多達(dá)41 種蛋白質(zhì)的數(shù)量發(fā)生了改變，其中有6 種蛋白質(zhì)在冷凍保存后含量下降，35 種蛋白質(zhì)含量上升，這41 種蛋白質(zhì)可分為10 個(gè)不同類別，涉及到多種生理過(guò)程，如精子的過(guò)早獲能、粘連、能量供應(yīng)以及精子-卵母細(xì)胞的結(jié)合和融合等，用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步證實(shí)，在凍融精子中，激酶錨定蛋白（3AKAP3）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI1）和外周致密纖維蛋白2（ODF2）的表達(dá)增加。另有研究證實(shí)TPI1 可作為豬精子冷凍保存前的生物標(biāo)志物，TPI1 與解凍后精子活力具有高度相關(guān)性，被認(rèn)為能夠預(yù)測(cè)精子耐凍性的高低［7］。

3）酪氨酸磷酸化對(duì)精子凍融的影響。精子蛋白的酪氨酸磷酸化發(fā)生在輸卵管部位，是精子獲能的標(biāo)志。在冷凍過(guò)程中由于質(zhì)膜的相變以及脂質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用被破壞，導(dǎo)致質(zhì)膜不穩(wěn)定并失去選擇滲透性的能力，從而增加細(xì)胞外離子如Ca2+和HCO3-的流入水平。Ca2+和HCO3-的流入會(huì)導(dǎo)致凍融精子出現(xiàn)冷凍獲能或類似獲能的變化，這也是精子在凍融后受精率發(fā)生降低的原因之一。研究證明精子體外保存會(huì)導(dǎo)致酪氨酸磷酸化的總體增加，造成一種功能性的、過(guò)早發(fā)生的獲能樣狀態(tài)，這種低溫誘導(dǎo)的非調(diào)節(jié)性獲能被稱為“低溫獲能”［51］。

通常酪氨酸磷酸蛋白沿著鞭毛分布，可能參與精子的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)和超活化過(guò)程，而豬精子中與獲能相關(guān)的酪氨酸磷酸蛋白定位于頭部而不是鞭毛，表明精子頭部在獲能和頂體反應(yīng)中起到重要作用。同時(shí)，冷凍保存降低了豬精子中膽固醇的含量，又因豬精子質(zhì)膜的膽固醇、磷脂比例本來(lái)就比較低，導(dǎo)致抗凍能力進(jìn)一步下降，從而使豬精子更容易誘發(fā)這種獲能樣變化。與獲能同時(shí)出現(xiàn)的是一種酪氨酸磷酸蛋白復(fù)合物p32，這是一種前頂體蛋白酶結(jié)合蛋白sp32 的酪氨酸磷酸化形式，與頂體蛋白成熟相關(guān)，p32 的升高與精子Ca2+水平提高和頂體丟失相關(guān)。因此p32 可以作為頂體反應(yīng)的信號(hào)分子，在豬精子冷凍過(guò)程中，p32 出現(xiàn)可認(rèn)為精子發(fā)生頂體反應(yīng)，豬精子冷卻至5 ℃比僅冷卻至15 ℃產(chǎn)生更大程度的低溫獲能和自發(fā)頂體反應(yīng)，蛋黃的存在可以明顯減少自發(fā)的頂體反應(yīng)，提高解凍后精子的活力。

4 豬精液凍融過(guò)程中其他因素對(duì)精子質(zhì)量的影響

4.1 包裝形式對(duì)精子凍融的影響

冷凍精液常見的包裝儲(chǔ)存形式有安瓿瓶、顆粒型冷凍保存、鋁箔（塑料）袋和麥管灌裝。當(dāng)灌裝形式具有較大表面積與體積比時(shí)，精液凍融過(guò)程中溫度變化更加均勻，冷凍過(guò)程中有更大的表面來(lái)散熱，解凍過(guò)程中能夠迅速升溫，凍融效果更好。例如2 mL 扁平細(xì)管或5 mL 塑料細(xì)管，被稱為扁平包裝形式，在精子凍融后活力較0.25 mL 細(xì)管效果要好，并且其可容納更多精液，在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)減少解凍細(xì)管的根數(shù)，減少操作的復(fù)雜性。與0.5 mL 細(xì)管相比，扁平灌裝形式在精子冷凍保存過(guò)程中可更加均勻地脫水，但其體積大，所需精液劑量大也是該方法的弊端。

4.2 細(xì)菌對(duì)精子凍融的影響

精液中細(xì)菌的來(lái)源包括內(nèi)源性和外源性2 種。內(nèi)源性細(xì)菌通常包括公豬包皮、尿道、外生殖器，或泌尿生殖道感染導(dǎo)致的細(xì)菌，內(nèi)源性細(xì)菌通常對(duì)精液質(zhì)量影響較小。外源性細(xì)菌主要與采精過(guò)程相關(guān)，包括環(huán)境條件、采集手法、采精器具等。細(xì)菌對(duì)凍融精子的影響主要體現(xiàn)在對(duì)精子理化性質(zhì)的影響，如頂體完整性、質(zhì)膜性質(zhì)、蛋白質(zhì)變化等［52］。此外，細(xì)菌的存在會(huì)造成凍融精子發(fā)生凝集現(xiàn)象，進(jìn)而使精子的活力迅速喪失。為了避免細(xì)菌對(duì)凍融精子的影響，一般的處理方法是在冷凍液中添加抗生素，但長(zhǎng)期使用各種抗生素會(huì)增加細(xì)菌的耐藥性。因此，為盡量避免細(xì)菌造成的影響，最好的解決辦法是優(yōu)化收集精液的衛(wèi)生條件，在采精和冷凍保存過(guò)程中盡量減少細(xì)菌的污染。

4.3 其他因素對(duì)精子凍融的影響

溫度和光周期會(huì)影響公豬附睪中存儲(chǔ)精子的進(jìn)一步成熟。有研究證明，精液耐凍性取決于精子收集的季節(jié)，冬春兩季采集的精子比秋、夏兩季具有更高的耐凍性，更能耐受冷凍保存［53］。此外，采精的前半部分，尤其是最初的10 mL，比后半部分具有更高的耐凍性，可能的原因是前半部分含有較低水平的碳酸氫鹽，或者精液后半部分的精漿會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響［54］。

精液運(yùn)輸過(guò)程也會(huì)對(duì)精液質(zhì)量造成一定影響，有研究人員使用特定的模擬設(shè)備模擬豬精液運(yùn)輸過(guò)程中受振動(dòng)帶來(lái)的影響，結(jié)果顯示，精液在300 r/min頻率下、持續(xù)進(jìn)行6 h 圓形水平振動(dòng)處理，會(huì)導(dǎo)致精液介質(zhì)堿性化，堿性條件會(huì)損傷精子的質(zhì)量，在之后7 d 的儲(chǔ)存期間，持續(xù)振動(dòng)處理會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致精子線粒體活性、頂體和質(zhì)膜完整性降低［55］。因此在精液冷凍前收集和運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)該注重每一步細(xì)節(jié)，盡量降低對(duì)精子造成的不必要損害。

5 提高豬精液凍融效果新方法

5.1 基于納米技術(shù)提高豬精液凍融效果

近年來(lái)，納米技術(shù)被逐漸用于畜禽精液凈化選擇，即根據(jù)物質(zhì)的特性對(duì)其進(jìn)行納米技術(shù)處理，改變物質(zhì)狀態(tài)、賦予物質(zhì)新功能。有研究證實(shí)添加新型冷凍保護(hù)劑納米化紅景天多糖進(jìn)行精液冷凍，當(dāng)添加體積比為15% 時(shí)，可將精子凍融后的活力提高11%，達(dá)到69%［56］。另有研究在冷凍過(guò)程中添加40μg/mL 納米載體包含的抗氧化劑-白藜蘆醇，可減少精子冷凍引起的損傷［57］。此外，納米技術(shù)結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)可用于精子生存能力和形態(tài)（如頭部和尾部異常）檢測(cè)。通過(guò)將生物標(biāo)志物附著到用于選擇性靶向精子的納米顆粒上，可針對(duì)性篩選優(yōu)質(zhì)精子，如將磁性氧化鐵納米顆粒（magnetic iron oxidenanoparticles， MNP）與聯(lián)膜蛋白V 或凝集素結(jié)合，再同精液孵育30 min 后使用磁場(chǎng)分離，當(dāng)納米顆粒質(zhì)量為87.5 μg（約218 750 粒納米顆粒），精子數(shù)目為1.6×109～2.0×109 時(shí)，可有效去除3% 異常精子，保留97% 優(yōu)質(zhì)精子［58］。因此，納米技術(shù)的發(fā)展為開發(fā)新型豬精子篩選技術(shù)、精液選擇、精子冷凍提供了新的方向。

5.2 添加耐凍生物標(biāo)志物提高豬精液凍融效果

蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)可在特定條件下識(shí)別和量化相關(guān)分子，檢測(cè)出的分子可作為精子功能的潛在生物標(biāo)志物。目前較多研究聚焦分子生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)精子低溫耐受性、減輕冷凍和解凍對(duì)精子的不利影響。通過(guò)凝膠色譜分離技術(shù)將精漿分為2 類不同質(zhì)量組分：SP1（gt;40 ku）、SP2（lt;40 ku），將這2 種不同質(zhì)量等級(jí)的精漿分別添加在解凍液中，與不添加精漿組相比，這2 種精漿均可顯著（Plt;0.01）提高精子運(yùn)動(dòng)特性、膜完整性和活力［37］。有研究使用UHPLC-QTOF-MS 技術(shù)分析不同凍融能力公豬精漿代謝水平的差異，結(jié)果表明D-天冬氨酸、N-乙酰-L-谷氨酸和肌苷的含量存在顯著差異［6］。這些發(fā)現(xiàn)為探索不同凍融能力的精子代謝生物標(biāo)志物提供了研究方向。除此之外，精漿中C 型2 類尼曼-匹克蛋白（Niemanne Pick C2 ， NPC2）的含量也可預(yù)測(cè)精子的冷凍能力，這種蛋白對(duì)膽固醇有較高的親和力，在公豬精漿中發(fā)現(xiàn)NPC2 的16 ku 和19 ku 2 種亞型在PFE 中的相對(duì)水平高于GFE 中，PFE 中NPC2 的含量高于GFE，會(huì)導(dǎo)致膽固醇的外排，進(jìn)而影響質(zhì)膜的流動(dòng)性和冷凍效果［7］。針對(duì)不同個(gè)體豬精液體外長(zhǎng)時(shí)間保存效果存在差異性進(jìn)行研究，可篩選出顆粒蛋白前體（granulin precursor）、豆莢蛋白前體（legu?main）和AWN 前體蛋白（AWN precursor）3 種候選蛋白，并表明不同個(gè)體豬精液體外長(zhǎng)期保存能力間的差異可能與精子對(duì)自身SP 的耐受性不同相關(guān)，而不同個(gè)體SP 之間的差異又體現(xiàn)在所篩選出的3 種候選蛋白豐度間的差異。因此，3 種候選蛋白可作為不同個(gè)體精子體外保存的標(biāo)志蛋白，這有助于篩選適宜做精液凍存的公豬個(gè)體［59］?？傊?，應(yīng)用蛋白組學(xué)進(jìn)行豬精子冷凍損傷機(jī)理研究，有助于揭示精子冷凍損傷的分子機(jī)理，尋找合適的與精子冷凍性相關(guān)的生物標(biāo)志物，為實(shí)現(xiàn)豬精液高效的冷凍保存提供重要依據(jù)，筆者總結(jié)了豬精子的分子生物標(biāo)志物及其主要生物學(xué)功能（表4）。

6 展望

豬精液冷凍保存是豬精子長(zhǎng)期保存最有效的方法，但冷凍過(guò)程會(huì)對(duì)精子造成損害，使得解凍后精子活力、受胎率和窩產(chǎn)仔數(shù)方面比鮮精效果差。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)多家企業(yè)開展了凍精技術(shù)的探索，相繼研發(fā)了豬精液冷凍保存技術(shù)，并與相關(guān)生豬企業(yè)進(jìn)行凍精配種合作，取得了一定成果。有報(bào)道稱國(guó)內(nèi)某些企業(yè)凍精解凍后活力可達(dá)70%～80%，且受胎率實(shí)現(xiàn)了與鮮精配種同等效果的繁育水平，達(dá)90% 以上，使得我國(guó)冷凍精液解凍后活力及配種效果達(dá)到世界領(lǐng)先水平［62］。但我國(guó)目前在豬精液冷凍方面規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)體系建設(shè)上并不完善。因此，應(yīng)當(dāng)對(duì)豬精液凍融生產(chǎn)工藝中各個(gè)流程進(jìn)行優(yōu)化組合，刪繁就簡(jiǎn)后制定一套規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的豬精液冷凍體系，并建立快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的凍融精子質(zhì)量評(píng)估方法，以實(shí)現(xiàn)在生豬生產(chǎn)過(guò)程中大規(guī)模使用豬冷凍精液，從而降低種公豬引種和飼養(yǎng)管理的成本，減少不必要的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。