關(guān)鍵詞 加州鱸； 芽孢桿菌； 溶血特性； 產(chǎn)酶性能； 諾卡氏菌

加州鱸，又名大口黑鱸（Micropterus salmoides），原產(chǎn)于北美，20 世紀(jì)80 年代初引進(jìn)我國，因其肉質(zhì)鮮嫩，深受消費(fèi)者喜愛，需求量不斷增加。根據(jù)2023 年《中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》，我國2022 年加州鱸年產(chǎn)量達(dá)80.2 萬t。由于養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的增加，以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，養(yǎng)殖加州鱸病害頻發(fā)，不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重制約了加州鱸產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［1］。應(yīng)用抗生素是水產(chǎn)養(yǎng)殖中治療細(xì)菌感染的常見做法，但抗生素的不規(guī)范使用會(huì)加劇耐藥菌的出現(xiàn)［2］、污染養(yǎng)殖環(huán)境和危害養(yǎng)殖生物。因此，尋找安全、有效的新型水產(chǎn)養(yǎng)殖抗生素替代品至關(guān)重要。

益生菌隨食物或水進(jìn)入胃腸道，通過調(diào)節(jié)胃腸道內(nèi)部微生物平衡來促進(jìn)機(jī)體健康［3］。益生菌能夠維持健康的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境并提高養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)量［4-5］。芽孢桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生菌，作為飼料添加劑在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中已得到廣泛應(yīng)用。芽孢桿菌可以抑制多種細(xì)菌和真菌的活性，發(fā)揮拮抗作用，提高動(dòng)物抗病力［6］。芽孢桿菌可形成芽孢，耐高溫、耐酸堿，具有良好的穩(wěn)定性和抗逆性［7-8］。芽孢桿菌能夠分泌多種酶類如蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶等，增強(qiáng)動(dòng)物的腸道消化能力，促進(jìn)魚類生長［9-10］。在飼料中添加優(yōu)良益生菌對(duì)于提高養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)量和減少疾病非常重要。鑒于從非水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中分離的芽孢桿菌在魚腸道的定植表現(xiàn)出不確定性［10］，為了提高芽孢桿菌在魚類腸道中的定植概率并對(duì)宿主發(fā)揮最大益處，研究的重點(diǎn)應(yīng)從魚類的微生物群中分離益生菌。本研究探索以芽孢桿菌作為一種有效、環(huán)保的抗生素替代品來控制諾卡氏菌病，同時(shí)提高加州鱸的生長性能，以期為促進(jìn)加州鱸養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

用于篩選芽孢桿菌的加州鱸購自武漢市的農(nóng)貿(mào)市場、養(yǎng)殖場等。用于菌株投喂試驗(yàn)的加州鱸購自武漢市黃陂區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖場，初始體質(zhì)量（28.8±6.0） g。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、普通營養(yǎng)瓊脂、產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基、產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基和羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)公司。藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司。胃蛋白酶、胰蛋白酶購自上海麥克林生化科技有限公司。胃蛋白酶測(cè)定試劑盒、α-淀粉酶檢測(cè)試劑盒和脂肪酶檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。定量PCR 試劑2×TSINGKE Mas?ter qPCR Mix 購自武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.2 菌株分離鑒定

1）菌株分離。加州鱸用MS-222 麻醉、75% 乙醇消毒魚體表后取出腸道，放入一次性培養(yǎng)皿中。用PBS 緩沖液清洗腸壁的血液、脂肪及內(nèi)容物并剪碎，加到離心管中，加入PBS 緩沖液進(jìn)行勻漿。將勻漿液置于水浴鍋中80 ℃水浴20 min，涂布于TSA 培養(yǎng)平板，置28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。待菌落長出，根據(jù)菌落形態(tài)、大小和顏色，挑選單菌落并純化。

2）分子生物學(xué)鑒定。挑取劃線純化2 代后的單菌落到TSB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖菌8～16 h 至渾濁。菌液PCR 擴(kuò)增16S rDNA，16S rDNA 基因通用引物序列：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCA）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。在NC?BI 數(shù)據(jù)庫中對(duì)序列進(jìn)行同源性比較，確定待測(cè)菌的種屬分類。

1.3 潛在益生菌的篩選

1）溶血性檢測(cè)。根據(jù)《飼料添加劑品種目錄》，將允許添加到飼料的芽孢桿菌進(jìn)行溶血試驗(yàn)，用接種針挑取單菌落點(diǎn)種于哥倫比亞血平板上，并增加PBS 陰性對(duì)照、Triton X-100 和溶血菌株陽性對(duì)照，培養(yǎng)24 h 后觀察菌落周圍是否出現(xiàn)溶血環(huán)［11］。

2）產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和脂肪酶能力測(cè)定。采用點(diǎn)種法篩選產(chǎn)酶菌株，用消毒牙簽挑取單菌落，分別點(diǎn)接在酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、羧甲基纖維素培養(yǎng)基、三丁酸甘油酯培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d，觀察平板有無水解圈的產(chǎn)生并測(cè)量水解圈大小。以水解圈直徑（Dh，cm）與菌落直徑（Dc，cm）之比（Dh/Dc）判斷各菌株產(chǎn)酶能力［12］，比值越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

1.4 菌株形態(tài)及生理生化鑒定

1）菌株形態(tài)。將篩選的芽孢桿菌接種到TSA 固體平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜，觀察菌落形態(tài)特征。用革蘭氏染液處理菌株，在光學(xué)顯微鏡下觀察革蘭氏染色后的菌株形態(tài)特征。

2）生理生化鑒定。使用青島海博生物技術(shù)公司的枯草芽孢桿菌生理生化鑒定試劑，根據(jù)生化反應(yīng)特征，通過《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》鑒定菌株。

1.5 藥物敏感性評(píng)價(jià)

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)菌株對(duì)29 種常見抗菌藥物的敏感特性。用無菌PBS 調(diào)節(jié)菌液濃度至108 CFU/mL，然后均勻涂布于MH 培養(yǎng)皿，用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，藥敏性判定參考美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NC?CLS）的標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 生物被膜形成能力測(cè)定

將菌液接種在96 孔板中，37 °C 孵育36 h。吸出培養(yǎng)液，用無菌 PBS 緩沖液沖洗3 次。添加100 μL甲醇進(jìn)行固定，持續(xù)15 min，然后吸出甲醇，使其自然風(fēng)干。接著每孔加入100 μL 1% 的結(jié)晶紫溶液，室溫下染色5 min，吸出結(jié)晶紫染液并用無菌PBS 緩沖液沖洗干凈。將培養(yǎng)板倒扣在濾紙上去除殘余的水分，并放入37 ℃烘箱中烘干。每孔加入100 μL 33%的冰乙酸溶液，在37 °C 培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，以溶解結(jié)晶紫。通過酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)孔中溶液在595 nm 處的OD 值（D595 nm）。每種菌株做3 個(gè)孔的重復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)值取3 次的平均數(shù)值（D 值）。以未接種菌的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，陰性值的2 倍設(shè)定為界限值［13］。

1.7 體外拮抗諾卡氏菌試驗(yàn)

將諾卡氏菌接種于腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)4～7 d，用滅菌生理鹽水調(diào)節(jié)至一定濃度，取0.1 mL 菌懸液涂布于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上，然后用接種針挑取供試菌點(diǎn)種在培養(yǎng)基上。28 ℃條件下培養(yǎng)，觀察48 h 點(diǎn)種區(qū)菌落周圍是否出現(xiàn)明顯的抑菌環(huán)，并測(cè)量抑菌環(huán)直徑與菌落直徑，觀察供試菌對(duì)諾卡氏菌的抑菌情況。

1.8 人工胃腸液耐受試驗(yàn)

根據(jù)《中國藥典》中的配制方法配制人工胃液、人工腸液，將芽孢桿菌按一定比例接種于人工胃液或人工腸液中，培養(yǎng)2 h 后，將菌液稀釋并將各稀釋度涂布平板，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算存活率［14］。

1.9 對(duì)加州鱸體質(zhì)量增量及免疫基因表達(dá)水平的測(cè)定試驗(yàn)

將體質(zhì)量為（28.8±6.0） g 的加州鱸平均分為5組，分別為對(duì)照組、K-3 組、K-12 組、K-13 組、K-22組，進(jìn)行芽孢桿菌拌料飼喂試驗(yàn)。投喂飼料為商品化飼料，在飼料中分別添加芽孢桿菌的芽孢，使添加后飼料中芽孢桿菌芽孢的濃度為1×108 CFU/g。養(yǎng)殖缸每缸30 尾魚，養(yǎng)殖系統(tǒng)為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)新基地的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，養(yǎng)殖水24 h 曝氣，水體pH7.2±0.2，水溫（20±2） ℃。試驗(yàn)期間每天投喂1 次，投喂量為魚體質(zhì)量的3%，飼喂周期為42 d，試驗(yàn)正式開始前將所有加州鱸暫養(yǎng)2 周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件。喂養(yǎng)結(jié)束前后測(cè)加州鱸的體質(zhì)量，在喂養(yǎng)后每組選取3 尾魚采集脾臟、頭腎、后腸并用TRIZOL 提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 用于后續(xù)定量檢測(cè)免疫因子表達(dá)水平，免疫因子及 β-actin 引物序列見表1。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用Graphpad Prism 6.0 軟件作圖，利用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異比較，Plt;0.05 為差異顯著，Plt;0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離鑒定結(jié)果

根據(jù)分離菌的16S rDNA 序列結(jié)果，從加州鱸腸道分離出94 株芽孢桿菌，包括枯草芽孢桿菌22 株、短小芽孢桿菌13 株、高地芽孢桿菌15 株、蠟樣芽孢桿菌24 株和芽孢桿菌屬其他種20 株。

2.2 非溶血菌株的篩選

將分離的35 株芽孢桿菌（包括22 株枯草芽孢桿菌和13 株短小芽孢桿菌）點(diǎn)種在哥倫比亞血平板上，篩選出23 株不產(chǎn)生溶血環(huán)的芽孢桿菌，包括枯草芽孢桿菌20 株，分別為K-1、K-3、K-4、K-5、K-6、K-7、K-8、K-9、K-10、K-11、K-12、K-13、K-14、K-15、K-16、K-20、K-21、K-22、K-23、K-25。短小芽孢桿菌3株，分別為D-2、D-6、D-9（圖1）。

2.3 產(chǎn)酶菌株的篩選

產(chǎn)酶能力試驗(yàn)結(jié)果顯示菌株K-3、K-12、K-13、K-22 同時(shí)具備產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶的能力。由表2 可知，4 個(gè)菌株的產(chǎn)蛋白酶水解圈直徑/菌落直徑指標(biāo)大小排序?yàn)镵-13gt;K-12gt;K-3gt;K-22；產(chǎn)淀粉酶水解圈直徑/菌落直徑指標(biāo)大小排序?yàn)镵-3gt;K-12gt;K-13=K-22；產(chǎn)纖維素酶能力水解圈直徑/菌落直徑指標(biāo)大小排序?yàn)镵-12gt;K-22gt;K-13gt;K-3；產(chǎn)脂肪酶按能力大小排序?yàn)镵-12gt;K-22gt;K-13gt;K-3。

2.4 芽孢桿菌的鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定。菌株K-3、K-12、K-13、K-22 在TSA 固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12 h，呈現(xiàn)為圓形或者橢圓形，略微隆起、不透明、有黏液的白色菌落（圖2A）；4 株菌革蘭氏染色結(jié)果呈藍(lán)紫色，表明4 株菌為革蘭氏陽性菌（圖2B）；4 株菌的生長曲線在37 ℃呈指數(shù)型增長，K-3 和K-13 的生長能力比K-12 和K-22強(qiáng)（圖2C）。

2）生理生化特征鑒定。用枯草芽孢桿菌生理生化鑒定條對(duì)菌株K-3、K-12、K-13、K-22 進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表3 所示，V.P、D-木糖、L-阿拉伯糖和明膠液化等呈陽性，利用丙酸鹽、檸檬酸鹽和7%氯化鈉生長等呈陰性。通過《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》檢索和形態(tài)學(xué)鑒定確定這4 株菌株為枯草芽孢桿菌。

2.5 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)是檢測(cè)菌株安全性的重要指標(biāo)。菌株K-3、K-12、K-13、K-22 對(duì)常見的29 種抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果如表4 所示。K-3 菌株對(duì)22 種抗生素敏感、3 種抗生素中度敏感，對(duì)3 種抗生素不敏感；K-12 菌株對(duì)12 種抗生素敏感、8 種抗生素中度敏感，對(duì)8 種抗生素不敏感；K-13 菌株對(duì)19 種抗生素敏感、7 種抗生素中度敏感，對(duì)2 種抗生素不敏感；K-22 菌株對(duì)14種抗生素敏感、5 種抗生素中度敏感，對(duì)9 種抗生素不敏感。以上結(jié)果表明這4 株菌對(duì)大部分抗生素敏感。

2.6 生物被膜的形成能力

菌株形成生物被膜可以保持菌株穩(wěn)定以及耐受極端環(huán)境，利于菌株的生存。本研究中4 株芽孢桿菌可形成肉眼可見的生物被膜（圖3A）。測(cè)定結(jié)晶紫染色的生物膜在595 nm 波長處的吸光值，以未接種菌的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，以陰性值的2 倍作為界限值。經(jīng)計(jì)算，它們的OD595 nm 值均大于界限值（圖3B），表明它們均是強(qiáng)生物被膜形成菌株。

2.7 體外拮抗諾卡氏菌試驗(yàn)

諾卡氏菌是加州鱸的重要病原菌，對(duì)病原菌的拮抗作用是評(píng)價(jià)益生菌株的一個(gè)重要方面。從圖4可以看出菌株K-3、K-13 對(duì)諾卡氏菌有明顯的拮抗作用，能夠形成抑菌圈；菌株K-12、K-22 對(duì)諾卡氏菌沒有形成抑菌圈，沒有拮抗作用。表明菌株K-3、K-13 能夠在體外拮抗諾卡氏菌。

2.8 對(duì)人工胃腸液的耐受能力

為明確菌株在胃腸道的耐受能力，對(duì)4 株菌在人工胃液（pH 2～4）和人工腸液處理下的生存情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如表5 所示，菌株K-3、K-12、K-13、K-22 能夠在人工胃液和人工腸液中存活，4 株菌在pH 2的人工胃液中2 h 的存活率較低，在pH 3～4 的人工胃液中2 h，K-12 和K-13 的存活率接近100%，高于K-3 和K-22 的存活率；4 株菌在人工腸液中2 h 的存活率達(dá)到100%。表明4 株菌能一定程度耐受低pH的胃液和腸液。

2.9 對(duì)加州鱸體質(zhì)量、腸道消化酶及炎癥因子的影響

1）芽孢桿菌對(duì)加州鱸體質(zhì)量的影響。由圖5 可見，將菌株K-3、K-12、K-13、K-22 的芽孢拌料飼喂加州鱸42 d 后，K-13 試驗(yàn)組體質(zhì)量增長率顯著高于對(duì)照組（Plt;0.05），K-3、K-12、K-22 試驗(yàn)組體質(zhì)量增長率相比于對(duì)照組沒有顯著變化（Pgt;0.05）。這表明在飼料中添加K-13 菌株能夠顯著提高加州鱸體質(zhì)量。

2）芽孢桿菌對(duì)加州鱸腸道消化酶的影響。將菌株K-3、K-12、K-13、K-22 的芽孢拌料飼喂加州鱸42 d，檢測(cè)加州鱸腸道的酶活性。如圖6 所示，K-3、K-12、K-13 組的魚腸道蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組（Plt;0.01），K-12、K-13 組加州鱸腸道脂肪酶活性顯著高于對(duì)照組（Plt;0.01）。試驗(yàn)組與對(duì)照組的加州鱸腸道淀粉酶活性沒有顯著性差異。表明飼料中添加K-12、K-13 菌株能夠增強(qiáng)加州鱸腸道消化酶的活性。

3）芽孢桿菌對(duì)加州鱸炎癥因子的影響。將菌株K-3、K-12、K-13、K-22 的芽孢拌料飼喂加州鱸42 d，檢測(cè)加州鱸主要免疫器官的炎癥因子表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，K-3 組的后腸、脾臟和頭腎的抑炎因子IL-10、促炎因子IL-8 表達(dá)水平顯著上調(diào)，促炎因子TNF-α 表達(dá)水平顯著下調(diào)（Plt;0.05）；K-12 組后腸、脾臟和頭腎的促炎因子IL-8、抑炎因子IL-10 表達(dá)水平顯著上調(diào)（Plt;0.05）；K-13 組的后腸、脾臟和頭腎的促炎因子IL-8、IL-1β 表達(dá)水平顯著下調(diào)（Plt;0.05）。抑炎因子IL-10 表達(dá)水平顯著上調(diào)（Plt;0.05）；K-22 組脾臟和頭腎促炎因子IL-8、TNF-α，抑炎因子IL-10 表達(dá)水平顯著上調(diào)（Plt;0.05）（圖7）?？傮w而言，K-13 試驗(yàn)組的加州鱸主要免疫器官中促炎因子表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組下調(diào)，抑炎因子表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組上調(diào)。這提示K-13 菌株添加在飼料中，能夠抑制加州鱸炎癥反應(yīng)。

3 討論

益生菌作為飼料添加劑，可以調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高動(dòng)物對(duì)飼料的消化吸收能力及動(dòng)物對(duì)疾病的抵抗力［4，15-16］，同宿主來源益生菌在宿主腸道中更容易定植和發(fā)揮作用。因此，本研究從加州鱸腸道分離出芽孢桿菌，通過溶血性、產(chǎn)酶性能、拮抗諾卡氏菌、人工胃腸液耐受能力和藥物敏感性等方面篩選出性狀優(yōu)良的菌株，并將芽孢桿菌添加在飼料中飼喂加州鱸，評(píng)價(jià)芽孢桿菌對(duì)加州鱸的益生效果，篩選對(duì)加州鱸生長性能促進(jìn)效果最顯著益生芽孢桿菌。

本研究從加州鱸腸道中分離到96 株芽孢桿菌，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《飼料添加劑品種目錄》，我們將枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌作為試驗(yàn)菌株添加到飼料中。溶血性測(cè)定被認(rèn)為是益生菌篩選過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。溶血素是一種非常常見的毒力因子，經(jīng)常引起宿主貧血和水腫，因此非溶血菌株更適合作為益生菌使用［15］。基于此，我們篩選出了23株無溶血性的芽孢桿菌。微生物在宿主腸道中產(chǎn)生的酶對(duì)消化系統(tǒng)有積極作用［17］。微生物進(jìn)入腸道后可利用腸道環(huán)境中的碳水化合物生長并產(chǎn)生大量的消化酶，包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶等，它們可以提高食物的消化率，并促進(jìn)生長［3］。據(jù)報(bào)道，已有許多可以產(chǎn)生消化酶的益生芽孢桿菌應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，如鱖魚源的貝萊斯芽胞桿菌能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶［18］；從淡水蝦中分離的3 株益生芽孢桿菌能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，并能夠增加腸道消化酶的活性［19］；從虹鱒中分離的枯草芽孢桿菌具有產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的能力［20］。在本研究中，分離菌株K-3、K-12、K-13 和K-22 均能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶，具有益生菌的潛力。

判定益生菌安全性的一個(gè)重要方面是是否具有耐藥性。耐藥細(xì)菌可以將耐藥基因轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌上，對(duì)人類和自然環(huán)境造成潛在的危害，因此，益生菌在投入生產(chǎn)使用前，必須確保菌株的安全性。在本研究中，4 株芽孢桿菌對(duì)29 種抗生素中的多種抗生素表現(xiàn)出敏感性。這表明菌株在作為添加劑時(shí)可以安全使用。若以菌株為載體表達(dá)病毒蛋白或者制備口服疫苗時(shí)，盡量避開敏感抗生素，有助于建立以該菌株為主的菌群環(huán)境。有研究表明芽孢桿菌能形成生物被膜，且生物被膜穩(wěn)定、耐受能力強(qiáng)，有助于保護(hù)菌株在腸道極端環(huán)境中生存［21］。本研究的4 株菌均能形成強(qiáng)生物被膜，這對(duì)菌株在腸道內(nèi)環(huán)境的生存起促進(jìn)作用。具有抑制病原菌活性也被認(rèn)為是篩選益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)之一［22］。諾卡氏菌是引起加州鱸發(fā)病的一種常見致病菌，魚體感染后死亡率極高［23］。有報(bào)道從加州鱸養(yǎng)殖基地的土樣中篩選到1株拮抗諾卡氏菌的芽孢桿菌［24］。從黃顙魚腸道中分離出1 株芽孢桿菌能夠拮抗溫和氣單胞菌（Aeromonassobria）、嗜水氣單胞菌等水產(chǎn)病原菌［25］。本研究結(jié)果顯示，菌株K-3、K-13 能夠明顯拮抗諾卡氏菌，但是還需要在魚體水平進(jìn)一步研究菌株K-3、K-13 拮抗諾卡氏菌的能力。在腸道中存活的能力是另一個(gè)重要的益生菌標(biāo)準(zhǔn)。本研究中，菌株在pH 4 的人工胃液和人工腸液中2 h 的存活率均超過80%，表明菌株能夠耐受低pH 的人工胃液。

腸道消化酶活性是衡量飼料利用率和宿主消化率的一種被廣泛接受的指標(biāo)［26］，我們發(fā)現(xiàn)K-13 試驗(yàn)組中的魚腸道蛋白酶、脂肪酶活性顯著高于對(duì)照組。而K-13 試驗(yàn)組的增重率顯著高于對(duì)照組，表明試驗(yàn)組的生長改善可能是魚腸道酶活性增強(qiáng)的結(jié)果，這些酶有助于分解食物分子，有助于更好地吸收營養(yǎng)［27］。Adorian 等［28］和Reda 等［29］在飼料中添加109CFU/g 地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌或1010CFU/kg 蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），飼喂亞洲鱸和非洲鯰60 d 后，亞洲鱸和非洲鯰的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均增加，這與本研究的觀察結(jié)果一致。IL-10 作為一種抗炎因子，在抑制炎癥因子的釋放、緩解炎癥方面起重要作用，TGF-β 的主要功能是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和細(xì)胞增殖［30-31］。IL-8、IL-1β 和TNF-α可以誘導(dǎo)炎癥和抵抗細(xì)菌和病毒的入侵［30，32］。本研究中，在K-13 試驗(yàn)組加州鱸的主要免疫器官頭腎、腸和脾中促炎因子mRNA 表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組下調(diào)，抑炎因子mRNA 表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組上調(diào)。促炎因子和抑炎因子mRNA 的表達(dá)在一定程度上反映了加州鱸的免疫能力。這與在飼糧中添加以沙棘為底物的枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和啤酒酵母固體發(fā)酵產(chǎn)物投喂加州鱸［4］和用枯草芽孢桿菌PB6 治療老鼠腸炎疾病 的結(jié)果［33］一致。因此，我們推測(cè)K-13 菌株在加州鱸體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)腸道的炎癥反應(yīng)，使養(yǎng)殖動(dòng)物腸道保持健康狀態(tài)。