關(guān)鍵詞：象草；花青素；16S rRNA；葉際微生物；細(xì)菌群落

中圖分類號(hào)：S543 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

定殖于葉際（phyllosphere，植物地上部分）的細(xì)菌和真菌等微生物被稱為葉際微生物（phyllosphere microorganisms），其中以細(xì)菌的豐度最大[1-4]。依據(jù)定殖位置的不同，可將葉際微生物分為兩類，一類是附生在植物表面的微生物，稱為附生微生物（epiphytes）；另一類是定殖于植物內(nèi)部的微生物，稱為內(nèi)生微生物（endophytes）[5]。研究表明，附生微生物的豐度和豐富度遠(yuǎn)大于內(nèi)生微生物，而內(nèi)生微生物與植物細(xì)胞的關(guān)系較附生微生物更密切[6]。葉際微生物主要來源于土壤，部分來源于空氣[7-9]。對(duì)于微生物來說，葉際并不是一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境，其組成受環(huán)境因素的影響，這些因素包括氣候、土壤類型、地理位置、溫度、光照和濕度等[10-12]。此外，宿主植物的基因型、年齡以及宿主植物內(nèi)部的次生代謝物也會(huì)對(duì)葉際微生物群有較大影響[13-15]。

多項(xiàng)研究表明，植物葉片內(nèi)部的次生代謝產(chǎn)物和有機(jī)揮發(fā)物會(huì)影響葉際微生物群落的構(gòu)成[15-18]。黃酮類化合物——花青素是植物體內(nèi)重要的水溶性次生代謝產(chǎn)物，影響植物果實(shí)、花朵和葉片的顏色[19]?；ㄇ嗨鼐哂袇⑴c植物體內(nèi)非生物脅迫和生物脅迫抗逆反應(yīng)，減輕植物受環(huán)境、病害的傷害等功能[20-21]。此外，花青素還具有抗氧化、抗癌、軟化血管和降低血糖等多種功效，具有極高的藥用價(jià)值，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[22]。目前對(duì)花青素合成及調(diào)控的分子機(jī)制已有較為深入的研究[19， 22]，但植物中的花青素對(duì)植物葉際微生物群落是否產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究。

象草（Pennisetum purpureum）是狼尾草屬多年生草本植物，廣泛種植于熱帶亞熱帶地區(qū)[23]。象草具有產(chǎn)量高、生長速度快等特性，常用作飼料、青貯飼料、生物乙醇和紙張的原料以及生態(tài)修復(fù)等[23]。紫色象草（P. purpureum cv. Purple）葉片為紫色，其葉片較矮象草（P. purpureum cv.Mott）富含多種花青素[24]。因花青素的諸多優(yōu)點(diǎn)，紫色象草被視為比綠色象草更佳的飼用品種[25-26]。

本研究采用16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)紫色象草和矮象草的葉際細(xì)菌群落進(jìn)行比較分析，從細(xì)菌多樣性、群落結(jié)構(gòu)等方面對(duì)比紫色象草和矮象草葉際細(xì)菌群落，探究不同花青素含量的象草葉際細(xì)菌的差異性，為花青素與植物葉際微生物群落相互作用的研究和實(shí)際利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為摩特矮象草（P. purpureum cv.Mott，Mott）和紫色象草（P. purpureum cv. Purple，Purple），種植于廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系引種園（23°10'N， 113°22'E），2 種象草種植距離約為4 m。

1.2 方法

1.2.1 象草葉片花青素含量測(cè)定 用0.1%鹽酸-甲醇溶液配制矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（Sigma-Aldrich，#52976）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為20.0、12.5、10.0、5.0、2.5 mg/L。使用分光光度計(jì)Nano-Photometer NP80（implen）測(cè)530 nm 處吸光度，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取1 g 象草葉片用于花青素濃度測(cè)定。低溫破碎葉片組織后，加入10 mL 0.1%鹽酸-甲醇溶液，震蕩后超聲5 min，4 ℃避光保存過夜。5000 r/min離心10 min，取上清液，加入5 mL 氯仿及5 mLddH2O，搖勻后5000 r/min 離心10 min，取上層紅色液體，測(cè)530 nm 處OD 值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品花青素濃度。

1.2.2 象草葉際微生物取樣 于2022 年6 月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系引種園采集象草樣本，選取長勢(shì)一致的象草作為試驗(yàn)材料，每株象草作為一個(gè)獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)，每種材料設(shè)置5～7 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將所取葉片組織浸沒于無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）中，室溫震蕩洗滌20 min，收集液體并重復(fù)1 次。取出植物組織，加入無菌PBS，超聲洗滌10 min，收集上述洗滌液，于0.22 μm 濾膜過濾，濾膜保存于–80 ℃，用于提取葉表面附生微生物DNA。剩余植物組織使用5%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無菌水漂洗3 次后儲(chǔ)存于–80 ℃，用于提取葉內(nèi)生微生物總DNA。

1.2.3 擴(kuò)增子文庫構(gòu)建及測(cè)序 選用FastDNA?SPIN Kit for soil（MP Biomedicals）試劑盒提取樣本DNA。使用引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）、1193R（5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′）和1392R（5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′）對(duì)細(xì)菌16S rDNA V5～V7 區(qū)域進(jìn)行巢式擴(kuò)增。第一輪PCR 擴(kuò)增使用引物799F 和1392R，程序?yàn)椋航?jīng)95 ℃ 3 min 預(yù)變性后，95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行27 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min。第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences）回收純化后作為第二輪PCR 反應(yīng)的模板。第二輪PCR 使用引物799F 和1193R，除循環(huán)數(shù)變更為13 外，其余程序同第一輪PCR。PCR反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStartFastPfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，用ddH2O 補(bǔ)足至20 μL，每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)。將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠純化回收PCR 產(chǎn)物。純化后的PCR 產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并檢測(cè)DNA 濃度。PCR 產(chǎn)物質(zhì)量及濃度合格后，使用NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit 進(jìn)行建庫，利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)使用QIIME2-2022.2 平臺(tái)進(jìn)行質(zhì)量過濾和分類學(xué)分析[27]。利用DADA2 軟件去除引物，對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)量過濾和校正，鑒別出操作分類單元（operational taxonomicunits，OTU）的代表序列，生成OTU 表[28]。每個(gè)OTU 的代表序列使用Greengenes（13_8）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類學(xué)注釋。依據(jù)OTU 表，使用QIIME2軟件計(jì)算出樣本α 多樣性的Shannon 多樣性指數(shù)和Faith 系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)；使用QIIME2 軟件構(gòu)建樣本間的Bray-Curtis 距離矩陣，基于該矩陣進(jìn)行主成分分析（PCoA），并使用非加權(quán)組平均法（UPGMA）對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析。通過置換多元方差分析（permutational multivariate analysis ofvariance，PERMANOVA）計(jì)算微生物群落結(jié)構(gòu)的差異以及微生物群落組成分析（analysis of compositionof microbiomes，ANCOM）探究樣本間OTU 的差異[29-30]。利用OriginPro 2022b 軟件中的Welch’s t 檢驗(yàn)分析屬水平相對(duì)豐度的差異，通過Spearman 相關(guān)性分析檢驗(yàn)屬水平相對(duì)豐度與花青素含量的相關(guān)性，并繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 象草花青素含量定量分析

紫色象草與矮象草的葉型相似，但顏色差異很大。由于花青素的積累，紫色象草的葉片正面和背面均為紫色，而矮象草葉片整體為綠色（圖1A，圖1B）。為進(jìn)一步探究2 種象草葉片花青素含量的差異，分別對(duì)2 種象草葉片的花青素含量進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，紫色象草葉片中的花青素含量為（150.15±3.41）μg/g，矮象草為（7.80±0.29）μg/g，2 種象草葉片花青素含量呈極顯著差異（Plt;0.001），紫色象草葉片中的花青素含量是矮象草的近20 倍（圖1C）。

2.2 象草葉際細(xì)菌α 多樣性分析

采用16S rRNA 測(cè)序技術(shù)對(duì)2 種象草葉片表面附生細(xì)菌及葉片內(nèi)生細(xì)菌群落進(jìn)行分析，共得到2 994 242 條reads，經(jīng)分析得到26 門、45 綱、76 目、120 科、155 屬和881 個(gè)OTU。Shannon指數(shù)是反映物種豐富度和均勻度的一個(gè)均勻指標(biāo)；Faith 系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)反映群落的豐富度。本研究利用這2 個(gè)指數(shù)在OTU 水平分別對(duì)兩類樣本進(jìn)行α 多樣性分析。結(jié)果表明，紫色象草和矮象草同一區(qū)室的α 多樣性均無顯著差異（圖2）。

2.3 象草葉際細(xì)菌β多樣性分析

為進(jìn)一步探究花青素對(duì)象草葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，根據(jù)OTU 水平的相對(duì)豐度，對(duì)紫色象草和矮象草的葉際細(xì)菌群落進(jìn)行主成分分析（圖3A）。主成分1 解釋度為40.48%，主成分2 解釋度為19.29%，總解釋度為59.77%。其中，葉表面附生細(xì)菌樣本和葉內(nèi)生細(xì)菌樣本在X 軸（主成分1）出現(xiàn)分離。進(jìn)一步分析2 種象草的葉際細(xì)菌群落發(fā)現(xiàn)，2 種象草葉片內(nèi)部細(xì)菌樣本距離較近，而葉片表面附生細(xì)菌樣本在Y 軸（主成分2）出現(xiàn)分離，紫色象草和矮象草樣品明顯分開。使用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group methodwith arithmetic means， UPGMA）對(duì)葉際細(xì)菌樣本進(jìn)行聚類分析也得出相似結(jié)果：所有樣本可以聚類為3個(gè)分支，分支1包含所有葉片內(nèi)部細(xì)菌樣本，分支2 為紫色象草表面細(xì)菌樣本，分支3 為矮象草表面細(xì)菌樣本（圖3B）。此外，通過置換多元方差分析（permutational multivariate analysisof variance， PERMANOVA）發(fā)現(xiàn)，2 種象草葉片表面附生細(xì)菌樣本的差異較葉片內(nèi)生細(xì)菌更顯著（表1）。以上結(jié)果顯示，紫色象草和矮象草葉表細(xì)菌群落存在較大差異。

2.4 象草葉際細(xì)菌組成分析

為解析象草葉際細(xì)菌組成，在細(xì)菌門水平上對(duì)不同樣本進(jìn)行相對(duì)豐度分析（圖4，表2）。結(jié)果顯示，葉片內(nèi)部細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門（占比≥1%）為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）；葉片表面細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門除上述3 種外，還包括放線菌門（Actinobacteria）和異常球菌-棲熱菌門（Deinococus-Thermus）。紫色象草葉片表面變形菌門和異常球菌-棲熱菌門的相對(duì)豐度顯著大于矮象草，而擬桿菌門相對(duì)豐度則顯著小于矮象草。以上結(jié)果表明，紫色象草和矮象草葉際微生物優(yōu)勢(shì)菌門及其相對(duì)豐度存在差異。

2.5 象草葉際細(xì)菌差異OTU 及差異屬分析

對(duì)紫色象草和矮象草的OTU 相對(duì)豐度進(jìn)行組間差異分析（圖5）。圖中橫軸clr 統(tǒng)計(jì)量表示差異量的大小，當(dāng)其為正值時(shí)，表示紫色象草中該OTU 的相對(duì)豐度高于矮象草，負(fù)值則相反；縱軸W 統(tǒng)計(jì)量表示顯著度。在2 種象草葉片內(nèi)部細(xì)菌群落中未發(fā)現(xiàn)相對(duì)豐度差異顯著的OTU，而在葉片表面細(xì)菌群落中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)相對(duì)豐度顯著差異的OTU，紫色象草OTU7（甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium）、OTU8（異常球菌屬Deinococcus）和OTU69（Unclassified_Methylobacteriaceae）的相對(duì)豐度均高于矮象草（表3）。在細(xì)菌屬水平上，紫色象草表面細(xì)菌群落中的甲基桿菌屬、異常球菌和Unclassified_Methylobacteriaceae 的相對(duì)豐度顯著高于矮象草。同時(shí)，Spearman 相關(guān)性分析得出，象草表面甲基桿菌屬、異常球菌和Unclassified_Methylobacteriaceae 的相對(duì)豐度與花青素含量呈正相關(guān)（圖6，表4）。

3 討論

3.1 紫色象草和矮象草葉片花青素含量差異顯著

花青素是植物的重要次生代謝物，是影響植物顏色的關(guān)鍵色素之一[22]。多項(xiàng)研究表明，花青素參與植物抗逆反應(yīng)，能提高植物耐逆境脅迫能力[31-32]。目前，學(xué)界對(duì)于花青素的生物合成通路以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已有較為清晰的認(rèn)識(shí)，已發(fā)現(xiàn)多種轉(zhuǎn)錄因子參與花青素合成的調(diào)控，如MYB家族、bHLH 家族和WD 蛋白等。多項(xiàng)研究解析了作物中影響花青素合成的關(guān)鍵調(diào)控因子[33-35]，如蒺藜苜蓿中過表達(dá)LAP1 基因可促進(jìn)花青素在葉片中的積累[36]；玉米中ZmR1 基因的序列變異及表達(dá)水平影響了花青素在整個(gè)植株上的積累[37]；白色葡萄中VvmybA1 基因啟動(dòng)子區(qū)域存在反轉(zhuǎn)座子插入，導(dǎo)致花色素苷合成基因轉(zhuǎn)錄受阻，影響了漿果著色，從而使果實(shí)呈現(xiàn)白色[38]。

紫色象草是葉片高花青素含量的象草品種。本研究發(fā)現(xiàn)，紫色象草葉片中的花青素含量是矮象草葉片中花青素含量的近20倍。研究表明，2種象草花青素種類不同，紫色象草花青素多為天竺葵素和錦葵色素的衍生物，矮象草花青素多為矢車菊素的衍生物[24]。目前對(duì)于紫色象草葉片高花青素含量的遺傳機(jī)理已有一定的解析。紫色象草葉片中花青素合成基因表達(dá)水平較綠色葉片的矮象草顯著上調(diào)，多個(gè)調(diào)控花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子的序列具有多態(tài)性，其表達(dá)水平與矮象草差異顯著[24]，這些重要基因的多態(tài)性及差異表達(dá)可能是導(dǎo)致紫色象草葉片花青素高積累的重要原因。

3.2 紫色象草和矮象草葉表面附生細(xì)菌群落存在差異

植物的次生代謝物可影響其葉際微生物群落結(jié)構(gòu)[15-18]。為探究不同花青素含量植物葉際微生物群落的差異性，本研究選取2 個(gè)不同花青素含量的象草品種（紫色象草和綠色葉片的矮象草），通過對(duì)2 個(gè)品種葉際細(xì)菌進(jìn)行α 多樣性分析、β多樣性分析、OTU 相對(duì)豐度分析以及細(xì)菌群落組成分析，比較紫色象草和矮象草葉際細(xì)菌結(jié)構(gòu)。2種象草葉際細(xì)菌高通量測(cè)序結(jié)果表明，紫色象草與矮象草葉際細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)菌門及其相對(duì)豐度均存在差異。PCoA 分析、樣本聚類分析以及PERMANOVA 分析結(jié)果表明，紫色象草和矮象草表面的附生細(xì)菌群落出現(xiàn)顯著分離，提示葉片表面附生細(xì)菌群落可能與花青素含量及種類相關(guān)。此外，花青素可改變?nèi)~片對(duì)光的吸收[39]。因此，推測(cè)紫色象草葉片中的花青素可能通過影響葉片中光線的透過率，改變?nèi)~片背部的光線強(qiáng)度，進(jìn)而影響葉面附生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。

3.3 紫色象草葉片表面甲基桿菌和異常球菌富集

本研究在葉片附生細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)OTUs 的相對(duì)豐度差異顯著，這些OTUs 分別來自甲基桿菌屬（Methylobacterium）、異常球菌屬（Deinococcus）和Unclassified_Methylobacteriaceae，其中甲基桿菌屬從屬于甲基桿菌科。研究發(fā)現(xiàn)，紫色象草葉表面甲基桿菌屬的相對(duì)豐度較矮象草顯著提升，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，甲基桿菌屬的相對(duì)豐度與花青素含量呈正相關(guān)。研究表明，根際和葉際的甲基桿菌可以提高作物的產(chǎn)量、增強(qiáng)植物的抗逆性[40-41]。紫色象草適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)草量高[26]，其葉表面附生的甲基桿菌相對(duì)豐度的增加，可能促進(jìn)紫色象草的生長，進(jìn)一步提高紫色象草的產(chǎn)量和抗逆性，這也為植物與葉際微生物的相互作用提供一定的證據(jù)。異常球菌屬具有抗輻射、抗氧化等特性[42]。已有研究報(bào)道，銀杏葉片中異常球菌屬的相對(duì)豐度與葉片中類黃酮物質(zhì)的濃度具有正相關(guān)效應(yīng)，體外培養(yǎng)異常球菌屬細(xì)菌時(shí)添加黃酮類化合物可提高其增殖速度[17]。異常球菌屬的細(xì)菌具有蔗糖-4-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（amylosucrase），以槲皮素（quercetin，一種黃酮類化合物）為底物，可以生成多種槲皮素糖苷（quercetin glucosides），提示異常球菌屬細(xì)菌可有效利用黃酮類化合物[43]。本研究中，異常球菌屬的相對(duì)豐度在富含花青素的紫色象草葉片表面上更高，表明其相對(duì)豐度與花青素濃度相關(guān)，為黃酮類化合物促進(jìn)異常球菌屬細(xì)菌增殖提供了新證據(jù)。

3.4 花青素對(duì)微生物與宿主相互關(guān)系的影響

研究表明，與綠色象草相比，使用高花青素含量的紫色象草喂養(yǎng)動(dòng)物可提高動(dòng)物的產(chǎn)量[25]。此外，在飼料中添加紅酒多酚物質(zhì)可改變動(dòng)物的腸道菌群結(jié)構(gòu)[44]，腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)會(huì)影響宿主的健康狀況[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與葉片花青素含量存在聯(lián)系，提示多酚物質(zhì)可能對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生影響，改變其群落結(jié)構(gòu)，為解析紫色象草對(duì)動(dòng)物生長的促進(jìn)作用提供了新的研究方向。

4 結(jié)論

研究表明，紫色象草葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與矮象草存在顯著差異，表明象草葉片中的花青素含量和象草葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)。在紫色象草葉片表面，能促進(jìn)植物生長的甲基桿菌屬以及抗輻射、抗氧化的異常球菌屬的相對(duì)豐度更高，表明花青素含量的提升可能促進(jìn)這類對(duì)宿主有積極作用的細(xì)菌的生長，進(jìn)而輔助植物的抗逆反應(yīng)。本研究從細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的角度解析了象草葉片中的花青素與葉際細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，為解析紫色象草的優(yōu)良生產(chǎn)性能及飼用價(jià)值提供了新思路。