摘 要：以肉鴿血液為原料，采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對其中的血紅素鐵進行提取。以血紅素鐵含量為主要評價指標(biāo)，篩選出木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶進行復(fù)配酶解，以血紅素鐵含量和水解度為評價指標(biāo)，通過單因素和正交試驗優(yōu)化確定肉鴿血液血紅素鐵的最佳提取工藝，結(jié)果表明：木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶配比2∶1、pH 7.0、溫度50 ℃、血水比1∶2、總加酶量8 000 U/g、酶解時間3 h工藝下，肉鴿血液中血紅素鐵的提取量達到95.43 μg/mL，與單酶提取法相比血紅素鐵得率顯著提高，可實現(xiàn)肉鴿血液的高附加值利用。

關(guān)鍵詞：肉鴿血液；血紅素鐵；酶法提??；工藝優(yōu)化

Optimization of the Enzymatic Extraction of Heme Iron from Pigeon Blood

ZHANG Yuanhong1， ZHANG Weijia1， LI Ying1， CHEN Liting1， CHEN Weibo2， ZENG Xiaofang1，*

（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Lingnan Specialty Food Science and Technology， College of Light Industry and

Food Sciences， Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou 510225， China;

2. Meizhou Golden Green Modern Agriculture Development Co. Ltd.， Meizhou 514500， China）

Abstract： In this research， heme iron from meat-type pigeon blood was extracted by enzymatic hydrolysis using papain， neutral protease， alkaline protease， flavourzyme or protamex. Based on heme iron content， papain and protamex were selected for dual-enzymatic hydrolysis. Employing one-factor-at-a-time （OFAT） method and orthogonal array design （OAD） with heme iron content and hydrolysis degree as evaluation indicators， the optimum extraction conditions were determined as follows： papain-to-protamex ratio 2：1， pH 7.0， temperature 50 ℃， blood-to-water ratio of 1：2， enzyme dosage 8 000 U/g， and hydrolysis time 3 h. Under these conditions， the extraction yield of heme iron was 95.43 μg/mL， which was significantly increased compared with that obtained using single enzymes.

Keywords： pigeon blood; heme iron; enzymatic extraction; process optimization

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240320-059

中圖分類號：TS251.93" " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）04-0017-06

引文格式：

張遠紅， 張緯嘉， 李瀅， 等. 酶解提取肉鴿血液中血紅素鐵的工藝優(yōu)化[J]. 肉類研究， 2024， 38（4）： 17-22. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240320-059. http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Yuanhong， ZHANG Weijia， LI Ying， et al. Optimization of the enzymatic extraction of heme iron from pigeon blood[J]. Meat Research， 2024， 38（4）： 17-22. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240320-059. http：//www.rlyj.net.cn

肉鴿是我國廣東省特色優(yōu)勢家禽產(chǎn)業(yè)，其營養(yǎng)豐富，素有“一鴿勝九雞”的美譽[1]，已逐步發(fā)展成為繼雞、鴨、鵝之后的第四大家禽[2]。2022年全國乳鴿出欄5.84億 只，年產(chǎn)量約30萬 t。肉鴿屠宰加工過程中產(chǎn)生大量的血液，約占肉鴿體質(zhì)量6%～8%，由于難保存、血腥味重等原因，這部分血液資源通常被當(dāng)作廢棄物直接排放，鮮少加工利用，造成大量的資源浪費和嚴(yán)重的環(huán)境污染[3]。

畜禽血液中含有豐富的蛋白質(zhì)，約占血液干基的90%，其中60%～65%為血紅蛋白。血紅素鐵是血紅蛋白中的重要活性成分，其攜帶的鐵離子具有良好的補鐵功效[4]。缺鐵性貧血是目前臨床上最常見的貧血癥，目前全球約20%的人口存在缺鐵性貧血的癥狀[5-7]。與非血紅素鐵相比，血液中的血紅素鐵更易于被吸收和利用，其吸收率比一般補鐵劑高3 倍，生物轉(zhuǎn)化利用率高，可作為鐵強化劑的更優(yōu)選擇，應(yīng)用于改善缺鐵性貧血[8-9]。因此，從畜禽血液中提取血紅素鐵并將其開發(fā)為鐵強化劑應(yīng)用于各類食品基質(zhì)中，不僅可以顯著改善缺鐵性貧血人群的健康狀況，還能提升畜禽加工副產(chǎn)物的綜合利用率和附加值。

目前，血液中血紅素鐵的提取方法主要有冰醋酸法、酶水解法、鞣酸法、選擇溶劑法和羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）法等，每種方法得到的產(chǎn)物有所差異，工藝也存在不同的優(yōu)缺點[10]。

其中冰醋酸法主要利用2 價鐵與組氨酸的配位鍵在pH＜3.5時發(fā)生斷裂、解離提取血紅素鐵，但存在溶劑使用量大、成本高、不易回收等問題；鞣酸法提取純度高達90%，通常采用5%的鞣酸作為提取劑，但所用鞣酸無法回收，生產(chǎn)成本較高；CMC-Na法工藝過程相對簡單，不需要使用有機溶劑，但提取純度低。酶水解法是通過蛋白酶對血紅蛋白進行水解，把蛋白質(zhì)水解成多肽和氨基酸，血紅素鐵連接在多肽鏈上，一定程度上克服單體血紅素的不足，同時產(chǎn)生的多肽具有一定的生理功能，可以增強水解產(chǎn)物的功能活性和應(yīng)用范圍[11-12]，且該法反應(yīng)條件溫和，是目前最為綠色、環(huán)保的血紅素鐵提取方法[13]。

因此，本研究以肉鴿血液為原料，采用酶法水解提取肉鴿血液中的血紅素鐵，以血紅素鐵含量為主要篩選指標(biāo)，對蛋白酶種類、酶添加量、血水比、酶解時間等工藝條件進行優(yōu)化，以期得到最佳的肉鴿血液血紅素鐵酶法提取工藝，為肉鴿血液資源的開發(fā)和高附加值綜合利用提供理論和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉鴿血液由梅州市金綠現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。

木瓜蛋白酶（800 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（20 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）、四硼酸鈉、乙醇、鄰苯二甲醛、二硫蘇糖醇、絲氨酸、十二烷基硫酸鈉 上海源葉生物科技有限公司；氯化高鐵血紅素（純度≥90%） 美國Sigma公司；酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸銅（均為分析純） 天津大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C pH計 上海雷磁儀器有限公司；Neo 15R高速冷凍離心機 上海力申科學(xué)儀器有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博迅實業(yè)有限公司；UV-1780紫外分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國宇儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶水解提取鴿血血紅素鐵技術(shù)路線

新鮮鴿血→預(yù)處理→溶血→調(diào)節(jié)血水比→調(diào)節(jié)pH值→酶解→滅酶（95 ℃、10 min）→離心（4 ℃、10 000 r/min、20 min）→取上清液→酶解液待測。

1.3.2 血紅蛋白制備

抗凝處理：以5 g/100 mL檸檬酸三鈉溶液為抗凝劑，將抗凝劑與新鮮鴿血按體積比1∶9混勻，冷藏作抗凝處理，用紗布過濾除去雜質(zhì)后，密封保存于4 ℃冷藏備用。

凍融破碎：將鴿血置于－18 ℃冰箱，2 h后取出，在室溫下緩慢溶解，以破碎大部分動物性的細胞及細胞內(nèi)的顆粒，并于5 000 r/min下離心20 min，收集上層紅細胞液，并將其作為原料進行酶解實驗。

1.3.3 血紅蛋白含量的測定

采用雙縮脲法對紅細胞液中的蛋白質(zhì)含量進行測定[14]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：首先配制10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液備用，分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL配制好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液于試管中，加入超純水補充至1 mL，最后在各樣液試管中分別加入4 mL的雙縮脲試劑，渦旋混勻后，反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，使用分光光度計于540 nm波長處快速進行比色測定。采用3 組平行的實驗方法分別進行測定，并以其蛋白含量和測得吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為

y＝0.046 7x＋0.079 4（R2＝0.999 2）。將樣品的質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至曲線的線性范圍內(nèi)，血紅蛋白含量按式（1）計算：

（1）

式中：ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為血清樣品體積/mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 血紅素鐵含量的測定

采用紫外-可見分光光度法測定血紅素鐵含量[15]。準(zhǔn)確稱取1.0 mg氯化高鐵血紅素，使用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液進行溶解，稀釋并定容至100 mL后，充分搖勻，以此作為10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別取0、1、2、4、6、8、10 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液定容至10 mL，稀釋為不同質(zhì)量濃度，渦旋混勻后，用

0.1 mol/L氫氧化鈉溶液作空白調(diào)零，從低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度依次于385 nm波長處測定吸光度[16]。繪制的卟啉鐵濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.055 1x＋0.017 9（R2＝0.997 4）。將樣品質(zhì)量濃度調(diào)整到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)即可測定其血紅素鐵含量。

1.3.5 水解度（degree of hydrolysis，DH）的測定

參考張建萍等[17]方法，采用鄰苯二甲醛法測定DH。DH是指特定條件下蛋白質(zhì)被水解為小分子肽時，斷裂的肽鍵數(shù)在蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)中的占比[18]，通過

式（2）～（4）計算：

（2）

（3）

（4）

式中：Cserine-NH2為L-絲氨酸含量/（mmol/g）；V為原始水解液體積/μL；n為水解液稀釋倍數(shù)；X為制備樣品體積/μL；Y為樣品中蛋白含量/（mmol/g）；h為每克蛋白斷裂產(chǎn)生的肽鍵數(shù)/（mmol/g）；Htot為蛋白中總肽鍵數(shù)

（Htot＝8 mmol/g）；α、β均為修正因子，α＝1.00，β＝0.4。

1.3.6 酶解工藝條件優(yōu)化

1.3.6.1 酶種類篩選試驗

選取木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶，參照表1的酶解條件對上述處理的肉鴿血液樣品進行酶解。肉鴿血液樣品的pH值分別調(diào)節(jié)至各酶的最適pH值條件。酶解結(jié)束后測定各酶解產(chǎn)物的DH，并以血紅素鐵含量作為主要評價指標(biāo)，從中選取2 種酶作為復(fù)配用酶進行雙酶酶解。

1.3.6.2 酶配比對肉鴿血液酶解的影響

在總加酶量6 000 U/g、酶解時間3 h、血水比1∶3（m/m）、溫度50 ℃、pH 7.0下，探究不同酶（木瓜蛋白酶∶復(fù)合蛋白酶）配比（1∶0、1∶1、1∶2、2∶1、0∶1）對肉鴿血液蛋白質(zhì)DH與血紅素鐵含量的影響。

1.3.6.3 pH值對肉鴿血液酶解的影響

在不同pH值（6.5、7.0、7.5、8.0）下進行酶解，其余酶解條件為總加酶量6 000 U/g、酶配比2∶1、酶解時間3 h、血水比1∶3（m/m）、溫度50 ℃。

1.3.6.4 血水比對肉鴿血液酶解的影響

在不同血水比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，m/m）下分別酶解，其余酶解條件為酶配比2∶1、總加酶量6 000 U/g、酶解時間3 h、溫度50 ℃、pH 7.0。

1.3.6.5 總加酶量對肉鴿血液酶解的影響

在不同總加酶量（2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g）下分別酶解，其余酶解條件為酶配比2∶1、酶解時間3 h、血水比1∶3（m/m）、溫度50 ℃、pH 7.0。

1.3.6.6 酶解時間對肉鴿血液酶解的影響

酶解不同時間（2、3、4、5 h），其余酶解條件為酶配比2∶1（m/m）、總加酶量6 000 U/g、血水比1∶3（m/m）、溫度50 ℃、pH 7.0。

1.3.6.7 正交試驗工藝優(yōu)化設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取血水比（A）、酶解時間（B）和總加酶量（C）為試驗因素，以血紅素鐵含量、DH為篩選指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗確定最佳酶解工藝。正交試驗因素水平見表2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)經(jīng)過3 次平行測定，結(jié)果使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，采用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2022軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

酶種類的選擇是影響蛋白質(zhì)酶解效率的關(guān)鍵因素[19]，不同酶作用于不同水解肽鍵位點，從而得到不同酶解特性的水解產(chǎn)物[20-21]。如圖1所示，5 種酶中DH最大的是風(fēng)味蛋白酶，其次是木瓜蛋白酶，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的DH差異不顯著（P＞0.05），中性蛋白酶DH最低。風(fēng)味蛋白酶因其同時存在內(nèi)切酶和外切酶2 種酶的酶切位點，酶外切作用產(chǎn)生更多游離氨基酸[22]，其DH顯著高于其他蛋白酶（P＜0.05），但是其酶解上清液含量較少，蛋白回收率較低。從酶解后得到的血紅素鐵含量可以看出，木瓜蛋白酶得率最高，含量為57.23 μg/mL；其次是風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶?？紤]到風(fēng)味蛋白酶蛋白回收率較低，本研究選用木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶進行后續(xù)雙酶酶解試驗。

小寫字母不同表示DH差異顯著（P＜0.05）；大寫字母不同表示血紅素鐵含量差異顯著（P＜0.05）。下同。

2.2 酶配比對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

如圖2所示，木瓜蛋白酶與復(fù)合蛋白酶的配比不同，肉鴿血液的DH與血紅素鐵含量也產(chǎn)生相應(yīng)變化，在酶配比為2∶1時達到最高，分別為13.93%與70.24 μg/mL，顯著高于其他酶配比（P＜0.05）。說明在給定pH值和溫度下，增大木瓜蛋白酶的比例有助于酶解效率的提高。而使用單一蛋白酶進行酶解的效果不如雙酶酶解，后者從肉鴿血液中提取出的血紅素鐵含量比單酶酶解提升約22.73%。原因是組合使用蛋白酶進行酶解時能夠增加酶切位點，擴大作用范圍[23-24]。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇酶配比為2∶1作為后續(xù)試驗條件。

2.3 pH值對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

不同pH值對酶解效率有較大的影響，當(dāng)pH值處于最適范圍時，酶活性會有所提高[25]。因此有必要對雙酶酶解作用的pH值進行優(yōu)化。如圖3所示，隨著pH值的增加，肉鴿血液的DH呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在pH 7.0時達到最大值，且差異顯著（P＜0.05）。這和木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的最適pH值在中性附近有關(guān)[26]。血紅素鐵的含量隨pH值、DH的變化規(guī)律類似，表明血紅素鐵的含量和肉鴿血紅蛋白的水解程度密切相關(guān)。根據(jù)試驗結(jié)果，2 種指標(biāo)在pH 7.0時達到最大值，故選擇pH 7.0作為下一步的試驗條件。

2.4 血水比對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

肉鴿血液和水的混合比例關(guān)系到酶解反應(yīng)的底物濃度，直接影響蛋白酶對底物的水解效果[27]。如圖4所示，血水比1∶1時，因底物即血紅蛋白濃度過高，酶的擴散受到限制，部分血紅蛋白沒有被有效水解，酶的水解反應(yīng)發(fā)生抑制效應(yīng)[28]，從而使血紅素鐵含量和DH較低；當(dāng)血水比為1∶2時，底物濃度最合適，此時底物可以與酶進行充分反應(yīng)，血紅蛋白可以在此條件下進行充分、有效的水解。之后，隨著血水比增加至1∶3、1∶4時，底物濃度逐步降低，酶與底物的接觸減少，反應(yīng)效率也下降。因此，選擇血水比1∶2酶解效果最好。

2.5 總加酶量對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

當(dāng)酶用量過少時，反應(yīng)速率會受到限制，隨著酶用量增大，酶水解效率提高。由圖5可知，隨著總加酶量的提高，能參與底物反應(yīng)的酶也較多，因此整體有正向促進作用，水解效率隨之增加?？偧用噶繛? 000 U/mg時，所提取出的血紅素鐵含量達到最大，為69.64 μg/mL。當(dāng)總加酶量繼續(xù)增大時，由于底物濃度不變，底物與酶作用趨于飽和，這時再提高酶用量并不能明顯提高酶促效應(yīng)，相反，此時過高的酶濃度會引起酶自溶，反而產(chǎn)生一定的負效應(yīng)[29-30]。說明6 000 U/g是一個重要的拐點，超過這個點反而會產(chǎn)生負效應(yīng)。因此，選用6 000 U/g作為酶添加量。

2.6 酶解時間對血紅蛋白DH和血紅素鐵含量的影響

由圖6可知，隨著酶解時間的延長，DH不斷增加，酶解至4 h時，DH達到13.51%，進一步延長酶解時間，DH無顯著增加（P＞0.05），說明此時底物蛋白質(zhì)的有效酶切部位已得到較充分地水解。血紅素鐵含量隨著酶解時間的延長緩慢增加。在酶解至4 h時，血紅素鐵含量達到最大，為71.4 μg/mL。此后，血紅素鐵含量呈現(xiàn)下降的趨勢。這可能是由于蛋白質(zhì)在降解過程中產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物，從而產(chǎn)生產(chǎn)物抑制，使得血紅素鐵得率降低[31]。為提高血紅素鐵含量，必須控制好酶解時間，綜合考慮，4 h為最佳水解時間。

2.7 正交試驗結(jié)果

選取對血紅素鐵含量和DH影響較大的工藝條件：血水比、酶解時間和總加酶量3 個因素進行3水平正交試驗，由表3可知，R值說明不同因素對血紅素鐵含量的影響次序為A＞C＞B，即血水比＞總加酶量＞酶解時間。通過K值可知，以血紅素鐵含量為篩選指標(biāo)得到的最佳酶解工藝為A2B1C3，即血水比1∶2、酶解時間3 h、總加酶量8 000 U/g；同時，以DH為評價指標(biāo)得出R’值，可知在DH的影響因素中，血水比同樣是第1位，酶解時間作用次之，而總加酶量對DH的影響最小，主次順序為A＞B＞C，最佳工藝條件為A1B3C2，即血水比1∶1、酶解時間5 h、總加酶量6 000 U/g。

對正交試驗所得的2 組最優(yōu)條件組合進行驗證。其中以酶解后所提取的血紅素鐵含量為指標(biāo)所得出的A2B1C3組合的血紅素鐵提取量為95.43 μg/mL，DH為18.41%。以DH為指標(biāo)得出的A1B3C2組合條件進行酶解后，所得血紅素鐵提取量為56.72 μg/mL，DH為30.93%。因此正交試驗得到的2 組最優(yōu)組合條件下血紅素鐵含量和DH均最高，說明正交試驗結(jié)果可信。2 個指標(biāo)之間以血紅素鐵含量為首要評價指標(biāo)，因此得到最佳血紅素鐵提取工藝為A2B1C3，即血水比1∶2、酶解時間3 h、總加酶量8 000 U/g，在此條件下得到的血紅素鐵含量比單一酶解所得的含量提高66.74%，顯著提升了肉鴿血液中血紅素鐵的提取量。

3 結(jié) 論

利用生物蛋白酶水解從肉鴿血液中提取血紅素鐵，以DH和血紅素鐵含量作為優(yōu)化指標(biāo)，對酶解工藝條件進行優(yōu)化。雙酶復(fù)配酶解工藝研究結(jié)果表明，不同血水比產(chǎn)生的血紅素鐵含量差異較顯著，水解效果明顯；酶添加量對血紅素鐵產(chǎn)量影響較大，對于DH影響不顯著，在4 000～8 000 U/g范圍內(nèi)均可進行有效水解。最終確定雙酶酶解血紅素鐵的最佳提取工藝為：木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶配比2∶1、pH 7.0、血水比1∶2、總加酶量8 000 U/g、溫度50 ℃、酶解時間3 h，在此條件下對肉鴿血液進行雙酶酶解后，血紅素鐵提取量為95.43 μg/mL，DH為18.41%，效果最佳。與單酶酶解相比，雙酶酶解的血紅素鐵提取率提高約66.74%，說明雙酶酶解能夠有效提高血紅素鐵的提取量。

雙酶酶解法能夠提高血紅素鐵提取量，并且適用于工業(yè)化方法和設(shè)備，適合大規(guī)模生產(chǎn)，為提高肉鴿血液資源利用及減少資源、環(huán)境污染提供一條合理的新途徑，對經(jīng)濟、環(huán)保具有重大的可持續(xù)發(fā)展意義。未來針對血紅素鐵在不同提取條件下的穩(wěn)定性及產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用方面仍需更進一步的研究。

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