關(guān)鍵詞細胞色素P450；除草劑；鑒定手段；抗性雜草；P450基因

依賴除草劑的雜草防除模式驅(qū)動了雜草抗藥性的迅速發(fā)展。目前，雜草對除草劑的抗藥性問題日益突出，新的抗性生物型和抗性機理不斷被發(fā)現(xiàn)。在雜草抗藥性研究中，前期研究主要集中在靶標抗性（target-site resistance，TSR）方面，但隨著研究的深入和技術(shù)的進步，人們認識到非靶標抗性（non-target-site resistance，NTSR）更加普遍，非靶標抗性逐漸成為了研究的熱點?，F(xiàn)有研究表明，P450、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transfer-ase，GST）、ABC（ATP-binding

cassette）轉(zhuǎn)運蛋白、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronyltransferase，UGT）等均與非靶標抗性有關(guān)。其中，P450催化的反應(yīng)是大多數(shù)除草劑代謝的起始步驟，在雜草對除草劑抗性形成過程中發(fā)揮著重要作用。研究除草劑代謝與P450的關(guān)系，有助于解析除草劑選擇性和雜草抗藥性的機理，為除草劑及安全劑的開發(fā)，抗性雜草的防除提供理論基礎(chǔ)和現(xiàn)實指導。本文論述了P450基本特性，闡明了P450在雜草抗藥性形成中的重要作用，歸納總結(jié)了P450介導抗藥性雜草的發(fā)生情況和抗性相關(guān)P450基因資源，有望對該領(lǐng)域的相關(guān)研究提供幫助。

1 P450及其分類命名

細胞色素P450，因其還原型與一氧化碳的結(jié)合體在450 nm處有吸收峰而得名，最早在大鼠肝微粒體中發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)其在微生物、動物、植物等生物中廣泛分布。隨著越來越多的P450基因被分離克隆，發(fā)現(xiàn)P450蛋白有4個氨基酸位點相對保守，即血紅素結(jié)合區(qū)的苯丙氨酸（Phe）和半胱氨酸（Cys）和螺旋K區(qū)的谷氨酸（Glu）和精氨酸（Arg）。植物細胞色素P450是亞鐵血紅素一硫醇鹽蛋白，其功能的發(fā)揮依賴一個多酶復合體，該多酶復合體由P450、還原性輔酶Ⅱ（NADPH）-P450還原酶、細胞色素b、還原性輔酶I （NADH）-細胞色素b5還原酶、磷脂成分組成。P450為整個酶復合體的關(guān)鍵組分，它不僅負責氧分子活化，同時還負責底物結(jié)合，并最終決定酶底物的專一性。與原核生物中可溶性P450蛋白不同，真核生物的P450在N末段有一段疏水序列，因此植物細胞色素P450經(jīng)常以膜結(jié)合態(tài)的形式存在，加之植物中P450蛋白具有含量低、不穩(wěn)定、易水解、分離易受干擾等特點，植物細胞色素P450的研究一直進展緩慢。

不同生物體所含P450數(shù)量差異極大。有些細菌只含有個位數(shù)的P450基因，一些植物含有數(shù)千個P450基因，如2倍體植物番茄、擬南芥Arabidopsis thaliana和水稻所含P450基因個數(shù)分別為233、244個和355個，多倍體植物中棉花（4倍體）和小麥（6倍體）所含P450基因個數(shù)分別為622個和1285個，稻田常見雜草稗Echi-nochloa crus-galli含有917個P450基因。

P450基因是一個古老的超基因家族。分類命名主要依據(jù)氨基酸序列的相似性及系統(tǒng)進化關(guān)系，分為家族（CYP1，2，3…）、亞家族（A，B，C…）、單個基因（A1，2，3…）、等位基因（v1，v2，v3…）等。如果兩個P450基因的序列相似性大于40%，它們就被劃到一個家族，表示為CYP加阿拉伯數(shù)字；當兩個基因的序列相似性大于55%，被認為是一個亞族的基因；當兩個基因的序列相似性大于97%時被認為是同一個基因；等位基因的命名是在上述基因名稱后面附加v1，v2，v3...。

2 P450的功能與除草劑代謝

自P450被發(fā)現(xiàn)以后，對其功能的研究從未間斷。植物細胞色素P450催化的反應(yīng)廣泛而復雜，其在皂苷、苯丙烷、芥子油苷、植物激素等生物合成途徑中發(fā)揮了重要的作用，如油菜素甾醇生物合成途徑中的關(guān)鍵基因大多是P450基因。由P450催化合成的生物堿類、脂肪酸、色素等代謝產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和抵御不良脅迫方面具有重要的作用。1969年，F(xiàn)rear等發(fā)現(xiàn)棉花的微粒體能夠降解滅草隆，而P450位于微粒體內(nèi)，說明該降解過程可能與P450作用有關(guān)。后續(xù)發(fā)現(xiàn)此降解過程需要NADPH和O2，CO和P450抑制劑能抑制該反應(yīng)，進一步證實降解與P450作用相關(guān)。P450催化反應(yīng)時通常在底物分子中加入一個氧原子，因此P450又被叫做單加氧酶系或羥化酶。羥基化依據(jù)發(fā)生的位置主要分為烷基羥基化和芳基羥基化（圖1）。Y asuor等在研究水田稗Echinoclzloa oryzoide.s（異名：E．phyllopogon）代謝異噁草松過程中．發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物大多為芳基或者烷基的羥基化產(chǎn)物，這些產(chǎn)物與P450的作用有關(guān)。Hofer等在釀酒酵母中表達擬南芥中的CYP76C1、CYP76C2、CYP76C4，發(fā)現(xiàn)其表達產(chǎn)物能夠?qū)惐〉漠惐u基化。P450另一個重要功能是脫烷基作用，主要是從N-、O、S-等位置上脫甲基、乙基、異丙基等（圖1）。如早在1987年，Cabanne等報道小麥能夠?qū)惐『途G麥隆代謝成N-脫甲基的產(chǎn)物，該作用受1-氨基苯并三唑（l-aminobenzotri-azole，1-ABT）抑制，表明P450參與了除草劑的脫甲基反應(yīng)。2014年，Iwakami等發(fā)現(xiàn)克隆自水田稗的P450基因CYP8IA12和CYP8IA21能夠催化芐嘧磺隆O-脫甲基化反應(yīng)。除了羥基化和脫烷基作用以外，P450還具有催化脫硫氧化、酯鍵斷裂、氧化脫氨等多種能力，但這些反應(yīng)主要存在于在微生物和動物中。

3 P450抗性的鑒定手段

P450催化的反應(yīng)是大多數(shù)除草劑代謝的起始步驟，P450介導的雜草抗藥性問題引起了研究人員的極大興趣。P450激活劑和抑制劑的引入為探究雜草是否涉及P450抗性提供了便利。P450激活劑和抑制劑作用如同除草劑的安全劑和增效劑。研究表明，乙醇、苯巴比妥、氯菲酸、解草酯、解草唑、1，8-萘酐（1，8-naphthalic anhydride，NA）等化合物能夠激活P450的活性，增強植物對除草劑的代謝（圖2）。如經(jīng)過NA預(yù)處理的玉米Zea rnays根部微粒體對丙草丹和乙草胺的代謝活性增強。NA處理后的綠豆Vigna radiata體內(nèi)P450含量顯著提高。以上研究證明了P450激活劑對P450的誘導作用，同時也說明P450參與了除草劑的代謝過程。在P450抑制劑方面，目前發(fā)現(xiàn)的P450抑制劑主要有：馬拉硫磷、四環(huán)唑、殺草強、增效醚（piperonylbutoxide，PBO）、1-氨基苯并三唑（ABT）等（圖2）。馬拉硫磷是一種有機磷殺蟲劑，作用機理是馬拉硫磷發(fā)生氧化脫硫作用后，脫下的硫與P450結(jié)合進而降低P450含量。ABT是P450不可逆失活劑，因其氧化產(chǎn)物苯炔具有占位小和活性高等特點，所以它對P450異構(gòu)體具有較小的選擇性。利用P450抑制劑對雜草抗藥性的影響，可以初步判斷雜草是否具有P450抗性。如Zhang等研究發(fā)現(xiàn)對精嗯唑禾草靈產(chǎn)生抗性的多花黑麥草種群（HZYC-6）經(jīng)3種抑制劑（馬拉硫磷、ABT、PBO）處理后，ED50均顯著下降，抗性水平顯著降低。表明該多花黑麥草種群產(chǎn)生抗性的原因與P450的作用有關(guān)?？狗前凡菝训拈L芒莧種群（RCA）經(jīng)馬拉硫磷十氟磺胺草醚處理后，存活率和生物量較單用氟磺胺草醚顯著下降，證明長芒莧RCA種群對氟磺胺草醚的抗藥性與P450有關(guān)。試驗中研究人員發(fā)現(xiàn)殺草強十氟磺胺草醚和PBO+氟磺胺草醚處理的防效變化不大，表明不同的P450抑制劑存在選擇性。若僅試驗部分P450抑制劑，可能得出錯誤的結(jié)論。

隨著技術(shù)的進步，越來越多的檢測手段可直接證明存在“代謝”抗性。利用色譜技術(shù)對經(jīng)同位素標記的除草劑進行跟蹤監(jiān)測，分析除草劑的代謝過程。應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對其代謝產(chǎn)物進行鑒定，解析P450參與催化的具體反應(yīng)。如Cao等利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrome-tric，LC-MS/MS）技術(shù)手段，發(fā)現(xiàn)抗性圓葉牽牛Ip-omoea DurDurea對噻吩磺隆的代謝速度更快，馬拉硫磷的加入抑制了代謝產(chǎn)物的形成，說明P450與該雜草抗藥性有關(guān)。Kupper等發(fā)現(xiàn)抗性長芒莧種群（NER）對氟磺草酮的代謝速度更快，LC-MS檢測到9個代謝產(chǎn)物（M1～M9），大多為羥基化產(chǎn)物，表明P450主要催化羥基化反應(yīng)。

除了上述方法以外，對于通過圖位克隆、同源序列克隆、轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白組測序等手段獲得的疑似P450抗性資源，利用基因敲除、轉(zhuǎn)基因（擬南芥、煙草、水稻、大豆、異源表達（大腸桿菌Escherichia coli、酵母）、傳代分離等方法對其功能進行驗證也是常用的方法。如Iwakami等從水田稗中克隆到12個CYP8IA基因，其中3個基因CYP8IA12、CYP8IA21、CYP8IA22的表達在抗／敏材料之間存在差異。高表達水田稗CYP8IA12和CYP8IA21的擬南芥對芐嘧磺隆和五氟磺草胺產(chǎn)生了抗藥性。抗性分離試驗進一步表明芐嘧磺隆、五氟磺草胺抗藥性與CYP8IA12、CYP8IA21表達水平密切相關(guān)。

4涉及P450抗性的雜草

目前已報道的抗性雜草的抗性機理大多屬于靶標抗性，但雜草防除中由P450引發(fā)的非靶標抗性問題更為棘手。同一P450蛋白不僅能夠降解作用方式相同的幾種除草劑，而且還可能降解作用方式不同的幾類除草劑，因此這類抗性具有較大的危害性和不可預(yù)測性。早在20世紀80年代，就有報道指出大穗看麥娘和硬直黑麥草對幾種不同作用方式的除草劑表現(xiàn)出非靶標抗性，甚至對從未使用過的除草劑產(chǎn)生了抗藥性。此后，隨著研究的深入和P450抑制劑的廣泛使用，越來越多涉及P450抗性的雜草被報道。據(jù)統(tǒng)計，2015年至今，禾本科雜草中光頭稗、稗、硬稃稗、千金子、馬唐、看麥娘、日本看麥娘、多花黑麥草、硬直黑麥草、茼草、節(jié)節(jié)麥、貧育雀麥、棒頭草、狗尾草等均涉及P450抗性（表1）。除了以上雜草以外，早期還發(fā)現(xiàn)水田稗、旱雀麥、野燕麥、不實野燕麥、等禾本科雜草也對除草劑產(chǎn)生了P450抗性。由于闊葉雜草所含P450基因比禾本科雜草少，闊葉雜草中涉及P450抗性的物種較少，主要有糙果莧，長芒莧、反枝莧、綠穗莧A.、繁縷、牛繁縷、播娘蒿、野蘿卜、圓葉牽牛、虞美人、新疆白芥等（表1）。

從涉及的除草劑來看，以上雜草對乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）抑制劑、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）抑制劑、對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（4-hydroxypheny-lpyruvate dioxygenase，4-HPPD）抑制劑、合成激素（synthetic auxlns）、原卟啉原氧化酶（protoporphy-rinogen oxidase，PPO）抑制劑、極長鏈脂肪酸（verylong chain fatty acid，VLCFA）合成抑制劑、光系統(tǒng)Ⅱ（photosystemⅡ，PSⅡ）抑制劑、微管組裝（micro-tubule assembly）抑制劑、八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）抑制劑等類除草劑產(chǎn)生了P450介導抗藥性。其中對ALS抑制劑產(chǎn)生抗性的雜草最多，涉及除草劑包括磺酰脲類的甲基二磺隆、苯磺隆和噻吩磺隆等，三唑并嘧啶磺酰胺類的啶磺草胺、五氟磺草胺等，咪唑啉酮類的甲氧咪草煙等。對ACCase抑制劑產(chǎn)生抗性的雜草次之，包括禾草靈、精嗯唑禾草靈、氰氟草酯等常用除草劑。以上研究中，抗藥性與P450的相關(guān)性主要通過代謝分析和P450抑制劑來證明（表1）。應(yīng)用P450抑制劑來證明雜草是否涉及P450抗性可能會出現(xiàn)誤判，某些抑制劑不僅抑制P450，還影響與除草劑敏感性有關(guān)的其他酶。

5參與除草劑代謝的植物細胞色素P450基因

盡管大量證據(jù)表明除草劑代謝與P450有關(guān)，但具體涉及哪些P450卻知之甚少。1994年，Pierrel等將菊芋Helianthus tuberosus CYP 73AI基因在酵母中異源表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因酵母的微粒體能夠?qū)⒕G麥隆羥基化，但催化活性很弱。此后，研究人員克隆到越來越多與除草劑代謝有關(guān)的P450基因，并對其功能進行了驗證。目前，從大豆、水稻、小麥、大麥Hordeurn;vulgare、玉米、煙草、菊芋、棉花、人參、油棕、北美喬柏、北美金柏、甜葉桉、擬南芥、水田稗、稗、茼草、硬直黑麥草等植物中克隆到35個相關(guān)P450基因（表2～3）。這些基因?qū)儆贑YP71、CYP72、CYP73、CYP76、CYP81、CYP706、CYP749等家族，與PSⅡ抑制劑、AIJ，S抑制劑、ACCase抑制劑、4-HPPD抑制劑、1-脫氧-d-木酮糖5-磷酸合成酶（1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase，DXPS）抑制劑、PPO抑制劑、PDS抑制劑、合成激素等類除草劑的代謝有關(guān)。值得一提的是大多數(shù)基因與PSⅡ抑制劑、ALS抑制劑類除草劑代謝相關(guān)，這可能與PSⅡ抑制劑、ALS抑制劑類除草劑更容易被降解，研究人員根據(jù)以往報道偏向選擇這兩類除草劑作底物有關(guān)。如Siminsz-ky等從大豆中克隆的CYP71A10能夠代謝利谷隆、伏草隆、綠麥隆、敵草隆等4種PSⅡ抑制劑類除草劑。其中綠麥隆被代謝為羥基化和脫甲基產(chǎn)物，其他3種除草劑被代謝成脫甲基產(chǎn)物。從菊芋克隆的CYP76BI與CYP71A10具有類似的功能，能夠?qū)⒗嚷?、綠麥隆、異丙隆等除草劑羥基化和脫甲基化。克隆自水稻中的CYP81A6 （Bel）能夠代謝滅草松、芐嘧磺隆、丙嗪嘧磺隆、甲嘧磺隆、甲磺隆、醚磺隆、吡嘧磺隆、四唑嘧磺隆、氯磺隆、五氟磺草胺等PSⅡ抑制劑和ALS抑制劑類除草劑，賦予了水稻對相應(yīng)除草劑的耐藥性，是稻田利用以上除草劑防控雜草的關(guān)鍵。同樣，水稻中的CYP72A31決定了秈稻和粳稻對ALS抑制劑類除草劑雙草醚的敏感性。大豆中CYP81E22決定了大豆對滅草松的敏感性。

除了從耐受作物、模式生物等材料克隆相關(guān)P450基因以外，從抗性雜草中克隆具有除草劑代謝功能的P450，進而解析雜草的抗性機理，也是當前的研究熱點。由于雜草微粒體難以分離、P450數(shù)量眾多、遺傳信息缺乏等原因，從雜草中克隆的P450基因數(shù)量并不多（表3）。CYP81A12和CYP81A21是第一次從雜草水田稗中克隆的P450基因，兩者具有很高的序列相似性和底物譜，能夠代謝4種以上作用方式不同的除草劑，具體代謝的除草劑多達十幾種。后續(xù)發(fā)現(xiàn)同樣來自水田稗的CYP81A14和CYP81A18僅能代謝ALS抑制劑類除草劑；CYP81A15能夠代謝ALS抑制劑、DXPS抑制劑、PSⅡ抑制劑等3類除草劑；CYP81A24能夠代謝除草劑種類最多，包含ALS抑制劑、PSⅡ抑制劑、PDS抑制劑、4-HPPD抑制劑、DXPS抑制劑、PPO制劑、ACCase抑制劑劑等7類16種除草劑。最近，Pan等從稗草中克隆到CYP81A68基因，該基因在抗性生物型中的表達量明顯高于敏感生物型，CYP81A68轉(zhuǎn)基因水稻對五氟磺草胺、氰氟草酯、嗯唑酰草胺等除草劑具有抗藥性，表明CYP81A68具有代謝上述除草劑的功能。同樣來自藺草中的CYP81Q32具有代謝甲基二磺隆、嘧草醚、雙草醚等除草劑功能。來自硬直黑麥草的CYP8IA10v7能夠代謝5類作用方式不同的除草劑。雜草中分離鑒定的P450多數(shù)屬于CYP81A亞家族蛋白，具有靈活的底物譜，具體原因值得深入分析。

6存在問題及研究展望

近年來，國內(nèi)外在植物細胞色素P450的研究方面取得了顯著的成績，但是也面臨著許多挑戰(zhàn)。首先，植物細胞色素P450分離非常困難，這嚴重阻礙了P450基因克隆和功能鑒定。目前植物中分離鑒定的具有除草劑代謝功能的P450基因只有30多個，繼續(xù)分離克隆新的植物源P450基因已成為當前研究的熱點之一。其次，因為許多雜草沒有可供參考的全基因組信息，雜草抗藥性機理研究中，通過轉(zhuǎn)錄組測序比對獲得抗性基因仍是常用的研究方法。利用該方法已經(jīng)獲得了若干疑似抗性P450基因。但是，由于許多P450表達易受外界環(huán)境的影響，利用該方法獲得的P450基因不一定與抗藥性有關(guān)。如Dimaano等發(fā)現(xiàn)CYP71AK2和CYP72A254在水田稗抗性生物型中高表達，但轉(zhuǎn)基因試驗表明這兩個基因與抗藥性無關(guān)。序列高度相似的CYP81家族蛋白基因具有不同除草劑代謝活性（表3），這一特性表明某些氨基酸位點對底物的選擇性至關(guān)重要。雖然在雜草中尚未發(fā)現(xiàn)由P450氨基酸取代或者突變導致的抗藥性，但昆蟲中已有相關(guān)報道，后續(xù)研究需加以重視。最后，目前雖然已經(jīng)克隆到若干個因自身過量表達而產(chǎn)生抗性的P450基因。但大多缺乏過量表達原因的研究。P450基因過量表達可能與自身復制和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控有關(guān)。對P450表達調(diào)控進行研究有助于對安全劑的作用機理和除草劑抗性機理的理解。植物細胞色素P450基因的表達和調(diào)控將是今后一段時間的研究熱點。

P450是一把“雙刃劍”。在作物中，P450可以代謝外源化合物，增強作物抗性，降低農(nóng)藥殘留。在雜草中，增強的除草劑代謝能力使雜草泛濫成災(zāi)，導致作物減產(chǎn)。部分CYP81s能夠代謝多種除草劑，導致雜草防除工作異常復雜。未來，解析P450蛋白3D結(jié)構(gòu)，揭示P450蛋白與除草劑互作的關(guān)系，依據(jù)P450底物特異性構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，預(yù)測P450底物譜。針對不同的P450基因，開發(fā)快速檢測技術(shù)，預(yù)測雜草的抗性譜。相信，P450介導抗性雜草的防除必將有的放矢，事半功倍。另一方面，底物廣、活性強的P450也是優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因資源。目前，已經(jīng)克隆到的基因除了極少一部分用于發(fā)展耐除草劑作物以外，大多數(shù)基因依然處于未利用狀態(tài)。將現(xiàn)有P450基因的代謝特性研究清楚，定向克隆、優(yōu)化改造P450，可望培育出更符合要求的優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因植物，不僅能提高除草劑對作物的安全性、擴大除草劑的應(yīng)用范圍，而且還可應(yīng)用于生物修復、選擇性標記等方面，應(yīng)用前景廣闊。