關(guān)鍵詞葡萄；葡萄潰瘍?。豢煽擅?；酵母雙雜交；表達模式

葡萄是世界范圍內(nèi)廣泛栽植的古老果樹之一，其品種多、用途廣，既可以鮮食，也被廣泛用于釀酒、制干等商品加工，已經(jīng)成為我國果樹產(chǎn)業(yè)的重要組成部分之一。葡萄枝干病害（grapevine trunk diseases）是一類由多種病原真菌復(fù)合侵染引起的病害的總稱，可危害葡萄果實、葉片、嫩梢等，造成不同程度的維管束變色、腐爛，葉片壞死等癥狀，嚴(yán)重時引起整個植株樹勢減弱甚至死亡。座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄潰瘍病在我國多個省份普遍發(fā)生。Li等在2010年首次報道了葡萄潰瘍病在我國的發(fā)生，該病害造成葡萄枝干及果實褐變，樹干潰瘍，果實干縮掉粒，樹勢減弱等現(xiàn)象。在已報道的研究中，葡萄座腔菌、可可毛色二孢、色二孢、小新殼梭孢和7種病原菌可引起我國葡萄潰瘍病，其中優(yōu)勢種是B．dothidea和L. theobromae，致病力最強的為L．theobr07tnae。

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor．TF），又稱反式作用因子，是一種能與基因啟動子上的特定序列專一性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控靶標(biāo)基因表達，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和逆境脅迫過程的蛋白質(zhì)分子。目前，植物中已發(fā)現(xiàn)多種轉(zhuǎn)錄因子，其中WRKY、AP2/ERF、MYB、NAC等是研究較多的轉(zhuǎn)錄因子。AP2/ERF是植物中數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。目前已在擬南芥、水稻、玉米、小麥、大豆等多種植物中分離鑒定到大量AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，參與植物的生長發(fā)育以及非生物與生物脅迫反應(yīng)。根據(jù)其所包含的AP2結(jié)構(gòu)域數(shù)量，通常將AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員分為AP2、ERF、RAV以及Soloist 4個家族。其中ERF家族進一步分為DREB亞家族（I一Ⅳ組）和ERF亞家族（V-X、Ⅵ-L和X b-L組）。研究發(fā)現(xiàn)，ERF家族成員主要參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫響應(yīng)、代謝調(diào)控以及生長發(fā)育等過程。在擬南芥中，Dubois等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子AtERF6和AtERF11可以通過拮抗作用來調(diào)節(jié)由甘露醇導(dǎo)致的擬南芥生長抑制現(xiàn)象。Yu等發(fā)現(xiàn)，在黃花蒿中，轉(zhuǎn)錄因子AaERF1和AaERF2響應(yīng)茉莉酸并且正調(diào)控青蒿素合成過程。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，中國野生葡萄中3個ERF轉(zhuǎn)錄因子參與不同的生物與非生物脅迫途徑，其中VqERF1在干旱和高溫脅迫下會顯著表達，過表達VqERF2和VqERF3可以提高葡萄對青枯雷爾氏菌和疫霉的抗性。

課題組前期研究表明，VvoWRKY75可以負調(diào)控葡萄潰瘍病的發(fā)生，通過權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）發(fā)現(xiàn)VvERF655與VvWRKY75共表達。本文主要探究VvERF655是否參與葡萄對葡萄潰瘍病的調(diào)控過程，分析VzERF655的表達模式，明確其是否與VvWRKY75存在互作關(guān)系，為進一步解析VvERF655在葡萄中的生物學(xué)功能及葡萄枝干病害防控提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

葡萄‘夏黑’種植于北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所溫室；‘無核白’葡萄組培苗由本實驗室培養(yǎng)和保存。可可毛色二孢菌株CSS-01s由實驗室分離并保存。酵母菌株Y2HGo1d由實驗室保存。用于酵母雙雜交的AD載體pGADT7和BD載體pGBKT7，以及pGBKT7-53、pGBKT7-Lam和pGADT7-T均由實驗室保存。

20%葡萄糖：經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，4℃冰箱保存。0.2%腺嘌呤硫酸鹽（0.2%Ade）：121℃高壓滅菌15min，4℃冰箱保存。YPDA培養(yǎng)基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，瓊脂20g，定容至880mL，pH6.5，121℃高壓滅菌15min，再加入過濾除菌的20%葡萄糖100mL，0.2% Ade 20mL。SD培養(yǎng)基：無氨基氮源6.7g，瓊脂20g，定容至800mL，pH調(diào)至5.8。10×-Leu/-Trp母液：1.28gDOsupplement-Leu/-Trp粉末溶于200mL滅菌水。10×-Ade/-His/-Leu/-Trp母液：1.2gDOsupplement-Ade/-His/-Leu/-Trp粉末溶于200mL滅菌水。向SD培養(yǎng)基中加入100mL20%葡萄糖和100mL相應(yīng)的缺陷型母液即配成SD/-Leu/-Trp二缺培養(yǎng)基和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，定容至1L。上述培養(yǎng)基和試劑均121℃高壓滅菌20min，常溫保存。植物總RNA提取試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司。SuperScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen公司。酵母轉(zhuǎn)化試劑盒購于TaKaRa公司。

1.2試驗方法

1.2.1目的基因克隆

根據(jù)VvERF655和VvWRKY75基因的CDS序列設(shè)計特異性引物（表1），在引物上添加EcoR和Xho酶切序列，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取‘無核白’葡萄幼嫩葉片，按照RNA提取試劑盒說明書提取葉片總RNA，利用SuperScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以‘無核白’cDNA為模板，利用表1中引物克隆VvERF655和VvWRKY75全長CDS片段。反應(yīng)體系為反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，32個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小正確后回收目的片段。

1.2.2生物信息學(xué)分析

利用ExPASY數(shù)據(jù)庫中的ProtParam在線工具（https：∥web. expasy. org/protparam/）對VvER655進行蛋白理化性質(zhì)分析；利用PlantCARE網(wǎng)站（http：∥bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/ht-ml/）對VvERF655啟動子上游2000bp的序列進行順式作用元件分析；通過在線網(wǎng)站Prabi（https：∥npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page＝npsa_sopma．htmL）對VvERF655的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；利用ProtComp v．9．0在線網(wǎng)站（http：∥linuxl.softberry. com/berry. phtm1？ topic=protcompp1amp;group=programsamp;subgroup=proloc）進行亞細胞定位預(yù)測。

保守結(jié)構(gòu)域分析：將VvERF655的蛋白序列在NCBI網(wǎng)站進行BLASTp比對，獲得擬南芥Arabi-、擬絨毛煙草、銀白楊、棉花、茶樹的同源蛋白序列，利用DNAMAN對6個物種的蛋白序列進行多重序列比對，并利用SMART網(wǎng)站對6個物種的蛋白進行結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

系統(tǒng)進化樹構(gòu)建：為了揭示葡萄VvERF655在ERF家族中的分類地位，本研究選用已報道的擬南芥和葡萄ERF家族各小組成員與VvERF655一起進行蛋白序列比對，并利用MEGA7.0軟件按照鄰接法（neighbor-j oining，NJ），bootstrap設(shè)定為1000，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3VvERF655的相對表達量分析

1.2.3.1接種可可毛色二孢后VvERF655的相對表達量

為探究VvERF655基因是否響應(yīng)可可毛色二孢侵染，參照張瑋等的接種方法對葡萄枝條進行接種：將可可毛色二孢菌株CSS-01s在PDA培養(yǎng)基上28℃條件下培養(yǎng)2d，葡萄枝條為采集于北京市農(nóng)林科學(xué)院溫室培養(yǎng)的‘夏黑’葡萄半木質(zhì)化枝條，經(jīng)75%乙醇擦拭枝條進行表面消毒后，用直徑4mm滅菌打孔器于莖節(jié)中間打孔，接種CSS-01s菌餅并固定，以接種無菌PDA為對照。接種后置于26℃，相對濕度80%的溫室，分別于接種后0、12、24、36h和48h，在以傷口為中心4cm范圍內(nèi)取韌皮組織，液氮速凍后于-80℃保存。

將-80℃保存的樣品按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA，并利用SuperScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用設(shè)計的熒光定量特異性引物655-qF/655-qR（表1）擴增VvERF655基因，以VvEF1-y基因為內(nèi)參基因。反應(yīng)程序為：95℃ 30s；95℃5s．60℃34s，共40個循環(huán)；60～95℃記錄熔解曲線。每個樣品3個技術(shù)重復(fù)，用2法計算VvERF655基因的相對表達量，以接種PDA的枝條為空白對照組處理，用于排除試驗操作的影響。在時間序列分析中，以oh的表達量為對照計算各時間點的相對表達量。利用SPSS中單因素方差分析（One-way ANOVA）進行差異顯著性分析（a=0.05），并利用GraphPad Prism 8作圖。

1.2.3.2激素處理后VvERF655基因的相對表達量

參照Wang等的方法，選擇在26℃L∥D=16h∥8h的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2個月左右的‘無核白’組培葡萄苗，用1.5mL濃度為100umol/L的茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MejA）、脫落酸（abscisicacid，ABA）、水楊酸（salicylic acid， SA）和氨基環(huán)丙烷羧酸（aminocyclopropane-l-carboxylic acid，ACC）分別噴施葡萄葉片，以噴施等體積滅菌水的葡萄葉片為對照組，在處理后0、1、3、6、12、24 h采集葡萄葉片，液氮速凍后于-80℃保存。熒光定量PCR擴增及相對表達量計算同1.2.3.1。

1.2.4VvWRKY75與VvERF655在酵母中的互作

1.2.4.1酵母雙雜載體構(gòu)建與鑒定

用E-coR工和Xho IXt pGADT7（AD載體）進行雙酶切，膠回收后與VvERF655擴增產(chǎn)物進行In-Fusion連接反應(yīng)。用EcoRI和Sal I對pGBKT7（BD載體）雙酶切，將其與VvWRKY75片段進行In-Fusion連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5a感受態(tài)細胞后分別在含有Amp和Kana的LB平板上生長。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒。酶切檢驗重組質(zhì)粒后，將條帶大小與預(yù)期符合的陽性克隆菌液送北京擎科生物科技股份有限公司測序。使用DNAMAN9.0軟件比對測序結(jié)果，序列正確的誘餌載體命名為BD-VvWRKY75，獵物載體命名為AD-VvERF655，菌液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2載體的毒性和自激活檢測

挑取酵母菌株Y2HGold劃線于YPDA固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)3d，參照酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（TaKaRa）說明書制備感受態(tài)細胞。利用PEG/LiAc法將獵物載體AD-VvERF655與BD載體pGBKT7配對共轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)細胞，將誘餌載體BD-VvWRKY75與AD載體pGADT7配對共轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4d，進行自激活與毒性檢測。以pGBKT7-53和pGADT7-T組合配對為陽性對照，pGBKT7-Lam和pGADT7-T組合配對為陰性對照。

1.2.4.3酵母雙雜交系統(tǒng)互作驗證

使用PEG/LiAc法將獵物載體AD-VvERF655與誘餌載體BD-VvVVRKY75共轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/-Leu/-Trp平板，30℃培養(yǎng)2d。挑取單克隆于SD/-Leu/-Trp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD60為0.5，稀釋10、100倍后分別點在SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上，30℃培養(yǎng)3～5d，觀察菌落生長狀況。陽性對照（pGBKT7-53和pGADT7-T配對）在SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上均能生長，表明存在相互作用；陰性對照（pGBKT7-Lam和pGADT7-T配對）可在SD/-Leu/-Trp平板上生長，但在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上無法生長，表明不存在相互作用。

2結(jié)果與分析

2.1VvERF655基因克隆與分析

以‘無核白’葡萄cDNA為模板，通過PCR擴增獲得VvERF655基因片段。測序結(jié)果顯示，目的基因VvERF655的開放閱讀框（ORF） 738bp，編碼246個氨基酸。蛋白理化性質(zhì)分析表明，其分子量為62.7kD，等電點5.08，不穩(wěn)定指數(shù)67.89，脂肪系數(shù)29.00，平均疏水指數(shù)0.986。通過Prabi在線網(wǎng)站預(yù)測VvERF655的二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其以無規(guī)則卷曲（60.98%）和a螺旋（26.83%）為主，延伸鏈和折疊各占7.32%和4.88%。亞細胞定位預(yù)測其位于細胞核。通過PlantCARE網(wǎng)站對VvERF655啟動子的順式作用元件進行分析發(fā)現(xiàn)，該基因啟動子上存在脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）、水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）等。

2.2保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進化樹分析

利用SMART網(wǎng)站預(yù)測VvERF655的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其含有1個典型的AP2結(jié)構(gòu)域。對VvERF655蛋白及其同源序列進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)它們共同含有一個長度為64個氨基酸的保守AP2結(jié)構(gòu)域（圖1）。

對擬南芥和葡萄ERF家族各小組的蛋白序列采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，VvERF655與AtERF114（NCBI reference sequence： NP_200995.1）和VvERF099 （GenBank登錄號：CBI18230.3）聚在一支，該分支為ERF亞家族X組（圖2）。

2.3接種可可毛色二孢后VvERF655的相對表達量分析

通過RT-qPCR檢測接種可可毛色二孢的‘夏黑’葡萄枝條中VvERF655相對表達水平變化，Oh為對照，結(jié)果表明，在接種后48h內(nèi)該基因的相對表達量逐漸增加，24h時其相對表達水平相較0h時有顯著差異，48h時可達對照的3.5倍（圖3）。

2.4激素處理后VvERF655的相對表達量分析

對噴施不同激素的‘無核白’葡萄葉片中VvERF655相對表達量進行檢測發(fā)現(xiàn)，ABA處理后0～24h，該基因的相對表達水平逐漸上升，處理后6h即有顯著誘導(dǎo)表達，處理后24 h其相對表達量達到0h的8倍左右（圖4a）。MeJA處理后0～3hVvERF655相對表達水平下降，處理后6h相對表達量上調(diào)，隨后逐漸減少至0h水平（圖4b）。ACC處理后1h時VvERF655的相對表達量顯著上升，隨后逐漸下降至0h水平（圖4c）。SA處理后0～3h VvERF655相對表達量顯著上升，處理后24h達到0h的23倍左右（圖4d）。

2.5酵母雙雜交分析

與對照組相比，經(jīng)自激活檢驗可以觀察到AD-VvERF655與BD載體pGBKT7配對可以在SD/-Leu/-Trp平板上生長，但在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上無法生長，表明VvERF655無自激活效應(yīng)。將BD-VvWRKY75與AD-VvERF655共轉(zhuǎn)酵母菌株進行酵母雙雜交互作鑒定，結(jié)果顯示其在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上能正常生長，表明VvERF655與VvWRKY75在酵母中可發(fā)生互作（圖5）。

3結(jié)論與討論

植物在其整個生命周期內(nèi)不可避免地會遇到各種各樣的生物與非生物脅迫，在長期進化過程中形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合特定靶基因啟動子中的順式作用元件來啟動反應(yīng)，可以與調(diào)節(jié)基因表達的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的不同蛋白質(zhì)相互作用，其中一些轉(zhuǎn)錄因子是生物響應(yīng)脅迫過程中信號傳遞和調(diào)節(jié)途徑的主要調(diào)節(jié)因子。在植物中，約10%的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，它們在不同階段具有不同功能。因此，破譯轉(zhuǎn)錄因子的作用對于未來的研究至關(guān)重要。本研究從負調(diào)控葡萄潰瘍病的VvWRKY75人手，研究了與其共表達的轉(zhuǎn)錄因子VvERF655，通過對其結(jié)構(gòu)域進行分析發(fā)現(xiàn)，VvERF655含有1個典型的AP2結(jié)構(gòu)域，屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)VvERF655屬于ERF亞家族X組。

近年來，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子得到廣泛研究，該類轉(zhuǎn)錄因子可以參與調(diào)控植物生長發(fā)育，調(diào)控植物代謝產(chǎn)物合成，以及響應(yīng)生物與非生物脅迫等過程。栗麗等通過對歐洲葡萄基因組中的124個AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子在葡萄組織中的表達模式分析發(fā)現(xiàn)，該類轉(zhuǎn)錄因子在根、葉、花莖、花及果實中表達較強，在其他的組織或器官中表達較弱。Zhu等通過全基因組鑒定與表達分析發(fā)現(xiàn)ERF家族基因在葡萄響應(yīng)灰葡萄孢侵染以及胚珠發(fā)育方面具有潛在作用。王嵐等篩選到3個響應(yīng)白粉菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子VqERF112、VqERF1l4和VqERF072，在擬南芥中過表達后可以增強對丁香假單胞菌的抗性。

本實驗室前期利用共表達網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)Vv積F655與共同表達。本研究通過對接種的‘夏黑’葡萄枝條中的轉(zhuǎn)錄水平進行測定，發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)VvERF655基因的上調(diào)表達，表明該基因很可能參與寄主對可可毛色二孢的侵染調(diào)控過程。通過對噴施ABA、SA、MeJA、ACC等激素的‘無核白’葡萄葉片中VvERF655的轉(zhuǎn)錄水平進行測定，發(fā)現(xiàn)在0～24h內(nèi)，ABA和SA可以顯著誘導(dǎo)VvERF655基因的上調(diào)表達，但VvERF655的相對表達水平基本不受MeJA和ACC的調(diào)控，該結(jié)果表明，VvERF655很可能參與ABA和SA激素調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。此外，酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)廣泛用于蛋白互作研究。Zhu等通過酵母雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子VaERF16與VaMYB306在酵母中存在相互作用，并且可以增強葡萄對灰葡萄孢的抗性。Wang等利用酵母雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)VqWRKY53與中國野生葡萄VqMYB14和VqMYB15在酵母中互作，提高二苯乙烯合成并增強對Pseudomonas syrzngae pv. tornato DC3000的抗性。本研究通過酵母雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)VvERF655與VvWRKY75在酵母中可以發(fā)生相互作用，說明VvERF655與VvWRKY75可能存在直接相互作用。以上結(jié)果表明，VvERF655很可能參與植物對病原菌的調(diào)控過程，但其具體作用機制尚不明確，后續(xù)將對VvERF655的生物學(xué)功能展開進一步研究。