關(guān)鍵詞反枝莧；氟磺胺草醚；咪唑乙煙酸；多抗性機(jī)理

反枝莧是我國夏季作物田主要雜草之一，在大豆、棉花、花生、玉米等作物田發(fā)生普遍。在我國東北大豆產(chǎn)區(qū)，乙酰乳酸合酶（ALS）抑制劑類除草劑、原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑類除草劑是防除該雜草的主要品種。但是，由于此類除草劑的長期使用，反枝莧對這兩種除草劑均產(chǎn)生了抗性。

在全球范圍內(nèi)，雜草對ALS抑制劑類除草劑的抗性較為嚴(yán)重，表現(xiàn)為抗性雜草種類多且抗性發(fā)展快，例如磺酰脲類（SU）類除草劑甲磺隆、氯磺隆應(yīng)用4年便可導(dǎo)致雜草產(chǎn)生抗性。目前，已有269種雜草對各類ALS抑制劑產(chǎn)生了抗性。咪唑乙煙酸屬咪唑啉酮類ALS抑制劑，由美國氰氨公司（現(xiàn)為巴斯夫公司）于1984年開發(fā)。1987年在美國發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了第一例抗咪唑乙煙酸的雜草一野萵苣Lactucaserriola。咪唑乙煙酸在我國于1993年獲得登記，用以防除闊葉類及禾本科雜草，在我國東北大豆田應(yīng)用廣泛。我國于2013年首次發(fā)現(xiàn)了抗咪唑乙煙酸的反枝莧種群。與ALS抑制劑類除草劑相比，雜草對PPO抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的風(fēng)險較低。PPO抑制劑類除草劑自20世紀(jì)60年代上市應(yīng)用，直到2001年才在大豆田發(fā)現(xiàn)了第一例對此類除草劑（三氟羧草醚）產(chǎn)生抗性的雜草一西部莧Arnaranthus rudis，同時該種群對氟磺胺草醚、乳氟禾草靈、甲磺草胺等多種PPO抑制劑類除草劑也普遍產(chǎn)生了抗性。目前已報(bào)道白苞猩猩草、豚草、長芒莧、反枝莧等共15種抗性雜草相繼被報(bào)道對此類除草劑產(chǎn)生了抗性。

雜草對除草劑的抗性可分為靶標(biāo)抗性和非靶標(biāo)抗性，靶標(biāo)抗性主要涉及靶標(biāo)基因突變、表達(dá)量變化，是雜草對除草劑產(chǎn)生抗性最常見的機(jī)理之一。目前，已發(fā)現(xiàn)雜草ALS基因5個保守區(qū)的9個位點(diǎn)的突變導(dǎo)致29種氨基酸替換可導(dǎo)致雜草抗藥性。雜草PPO有質(zhì)體型（PP01）和線粒體型（PPO2）兩種類型，分別由PPX1、PPX2基因編碼。目前，共發(fā)現(xiàn)兩個基因5個位點(diǎn)上共8種氨基酸突變可導(dǎo)致雜草抗藥性，其中PPX1上1種突變Ala212Thr，PPX2上7種突變，分別為Gly210缺失、Arg128Leu/Gly/Met/Lys、Va136IAla及Gly399Ala。靶標(biāo)突變導(dǎo)致的雜草抗藥性，抗性倍數(shù)普遍較高，增加了抗性雜草防除的難度。

本研究以化學(xué)防除失敗的黑龍江大豆田反枝莧種群為材料，采用整株生物測定的方法檢測其對咪唑乙煙酸及氟磺胺草醚抗性水平，克隆并比對抗性、敏感種群ALS和PPO基因差異，并進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，明確其靶標(biāo)抗性機(jī)理，為抗性反枝莧防除提供參考。

1材料與方法

1.1材料

供試反枝莧種子：于2018年9月-10月，在應(yīng)用氟磺胺草醚、咪唑乙煙酸防除雜草均失敗的黑龍江嫩江流域大豆田和齊齊哈爾市郊非耕地采集成熟未落的反枝莧種子，自然晾干后儲存于低溫種子柜，分別標(biāo)記為抗性種群（R）和敏感種群（S）。

除草劑：95%氟磺胺草醚原藥，青島瀚生生物科技股份有限公司；96%咪唑乙煙酸原藥，濰坊中農(nóng)聯(lián)合化工有限公司。

試劑盒及儀器：RNA提取試劑盒（EasyPure PlantRNA Kit），膠回收試劑盒（EasyPure Quick Gel Ex-traction Kit），T4連接酶，北京全式金；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScriptⅢlst Strand cDNA Synthesis Kit），高保真Taq酶（Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase），南京諾唯贊；內(nèi)切酶Kpnl、Sal， NEB公司（北京）；3WP-2000型行走式噴霧塔，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南京農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所；TlOO PCR儀，美國Bio-Rad。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1反枝莧種群的抗性測定

采用整株生物測定法。將采集到的疑似抗性（R）及敏感（S）的反枝莧種子于避光25℃條件下催芽至露白，然后將露白種子均勻點(diǎn)播于10cm×10cm方形塑料盆缽內(nèi)，每盆12粒，置于人工氣候室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度（20±5）℃，相對濕度75%，光照強(qiáng)度11500lx，光周期L∥D=16h∥8h。待幼苗生長至3葉期進(jìn)行間苗，每盆留9株。幼苗4葉期進(jìn)行莖葉噴霧處理，噴液量450L/hm2，噴霧壓力0.15MPa。咪唑乙煙酸處理劑量：對疑似抗性種群設(shè)置為0、25、75、225、675、2025g/hm2，其中75g/hm2為推薦劑量；對敏感種群設(shè)置為0、0.31、0.93、2.78、8.33、25g/hm2。氟磺胺草醚處理劑量：對疑似抗性種群設(shè)置為0、13. 89、41. 67、125、375、1125g/hm2，其中375g/hm2為推薦劑量；對敏感種群設(shè)置為0、1.54、4.63、13.89、41.67、125g/hm2。藥劑處理后21d剪取植株地上部分，烘干后稱重，計(jì)算抑制百分比。試驗(yàn)采取完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每處理4個重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.2靶標(biāo)酶基因擴(kuò)增及比對

在疑似抗性種群和敏感種群中各挑選20株反枝莧，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參考NCBI中反枝莧ALS基因序列（AF363369.1）、PPO基因序列（DQ386112、MK798105）設(shè)計(jì)引物（表1），擴(kuò)增A/S保守區(qū)、PPXI近全長及PPX2全長序列。引物由青島蔚來生物科技有限公司合成。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物后回收目的片段，純化后送至上海派森諾進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DMAMAN9.0軟件進(jìn)行序列比對。

1.2.3轉(zhuǎn)抗性、敏感種群PPX2基因擬南芥對氟磺胺草醚敏感性驗(yàn)證

利用引物PPX2-Fq/PPX2-Rq和高保真Taq酶擴(kuò)增反枝莧抗性和敏感種群的PPX2全長基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收擴(kuò)增片段，用SalI、KpnI雙酶切，利用T4連接酶將純化后的酶切產(chǎn)物克隆至pCAMBIA1301表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)人大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上于37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，篩選陽性克隆。提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，涂布于含30mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落培養(yǎng)后采用引物PPX2-F/PPX2-R進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，篩選陽性克隆轉(zhuǎn)染農(nóng)桿菌。將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌二次活化后5000r/min離心，用5%蔗糖溶液（含0.4‰的Silwet-70）重懸，剪去擬南芥已開放的花和已形成的果莢，將花序浸沒到菌液中0.5～1min，暗培養(yǎng)24h后正常培養(yǎng)至成熟，收集To代種子。在含30mg/L卡那霉素的植物培養(yǎng)基（plant agar）上篩選陽性擬南芥苗，培養(yǎng)至成株后提取植株總DNA，用PPX2-F/PPX2-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證PPX2是否轉(zhuǎn)入，陽性苗培養(yǎng)至成熟，收集T1代擬南芥種子。將轉(zhuǎn)抗性和敏感種群PPX2基因的T1代擬南芥種子分別在含30mg/L卡那霉素的植物培養(yǎng)基上篩選，選擇陽性苗轉(zhuǎn)入盆缽培養(yǎng)，測定轉(zhuǎn)基因擬南芥對氟磺胺草醚的敏感性，氟磺胺草醚濃度為0、1. 54、4.63、13. 89、41. 67、125、375、1125g/hm2。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS20.0（IBM SPSS）通過方差分析對劑量一反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在5%的概率水平下，使用LSD檢驗(yàn)對平均值進(jìn)行分析，如果兩個試驗(yàn)之間沒有顯著差異，則將數(shù)據(jù)匯總。使用SigmaPlot12.5（Systat，San Jose，CA，USA）對劑量一反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行4參數(shù)邏輯方程（式1）擬合，計(jì)算GR50。按式（2）計(jì)算抗性倍數(shù)（RI）。

2結(jié)果與分析

2.1反枝莧對咪唑乙煙酸、氟磺胺草醚的抗性水平

施用咪唑乙煙酸和氟磺胺草醚后的反枝莧癥狀存在明顯差異，對敏感種群，氟磺胺草醚125g/hm2（1/3推薦劑量）處理后1d，反枝莧葉片即出現(xiàn)水漬化癥狀，而咪唑乙煙酸25g/hm2（1/3推薦劑量）處理后6d，反枝莧才開始出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。咪唑乙煙酸對反枝莧抗性、敏感種群的GR50分別為152.60、2.76g/hm2，抗性種群對咪唑乙煙酸的抗性倍數(shù)為55.29倍。氟磺胺草醚對抗性、敏感種群的GR50分別為202.11、11.54g/hm2，抗性種群對氟磺胺草醚的抗性倍數(shù)為17.51倍（圖1～2）。

2.2抗性反枝莧的ALS、PPO突變

對反枝莧抗性及敏感種群的A/S基因的比對分析結(jié)果顯示：抗性種群ALS基因存在兩種突變形式，分別為第714位堿基由C突變?yōu)門，導(dǎo)致第205位氨基酸由丙氨酸（Ala，GCT）突變?yōu)槔i氨酸（Val，GTT），第1958位堿基由G突變?yōu)锳，導(dǎo)致第653位氨基酸由絲氨酸（Ser，AGC）突變?yōu)樘於０罚ˋsn，AAC）。在其他常見的可導(dǎo)致抗性的位點(diǎn)沒有發(fā)生堿基突變。抗性種群中，13株為Ala20 5Val純合突變，7株為Ser653Asn純合突變，且兩種突變形式均未在同一株上出現(xiàn)。對抗性和敏感種群的PPX1、PPX2進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，其SNPs位點(diǎn)較A/S基因少，測序的20株抗性反枝莧植株的PPX1均未發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致氨基酸變化的堿基突變，僅在PPX2上檢測到了突變，第382位堿基由A突變?yōu)镚，導(dǎo)致第128位氨基酸由精氨酸（Arg，AGG）突變?yōu)楦拾彼幔℅ly，GGG）（圖3～4）。

2.3轉(zhuǎn)抗性、敏感種群PPX2基因擬南芥對氟磺胺草醚的敏感性

在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)抗性、敏感反枝莧PPX2基因的擬南芥（分別標(biāo)記為AT-PPX2-R、AT-PPX2-S）對氟磺胺草醚反應(yīng)差異明顯。AT-PPX2-S植株在13.89g/hm2劑量下，生長開始受到強(qiáng)烈抑制，在41.67g/hm2劑量下完全死亡，而AT-PPX2-R植株在125g/hm2劑量下生長開始被抑制，在375g/hm2劑量下完全死亡。氟磺胺草醚對AT-PPX2-R、AT-PPX2-S的GR50分別為126.8、12.3g/hm2，與AT-PPX2-S植株相比，AT-PPX2-R植株抗性倍數(shù)為10.3倍（圖5～6）。

3結(jié)論與討論

咪唑乙煙酸因其用量低、高效、低成本、殺草譜寬等優(yōu)點(diǎn)，在很長時間內(nèi)是我國東北大豆田使用的主要除草劑品種之一。但是，伴隨著咪唑乙煙酸的持續(xù)使用，開始出現(xiàn)抗咪唑乙煙酸的反枝莧，導(dǎo)致除草效果下降。通常情況下，靶標(biāo)突變易導(dǎo)致雜草產(chǎn)生較高抗性，而在某些關(guān)鍵位點(diǎn)上發(fā)生氨基酸替換是最為普遍的形式。目前，已發(fā)現(xiàn)ALS在9個位點(diǎn)（Ala122、Pr0197、Ala205、Phe206、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653及Gly654）突變導(dǎo)致的29種氨基酸替換可導(dǎo)致雜草產(chǎn)生抗藥性。在反枝莧中，已報(bào)道的抗性ALS突變有Ala122Thr、His197Pro、Ala205Val、Trp 574Leu、Ser653Thr.本研究發(fā)現(xiàn)抗性反枝莧種群的ALS存在兩種氨基酸突變方式：Ala205Val及Ser653Asn，其中后者是首次在反枝莧中報(bào)道。雖然本研究未對發(fā)生Ser653Asn的ALS功能進(jìn)行驗(yàn)證，但是該突變導(dǎo)致的雜草抗性已在糙果莧、綠穗莧、狗尾草、豬殃殃、野燕麥、長芒莧、旱雀麥中證實(shí)，且對咪唑乙煙酸的抗性倍數(shù)均gt;10。因此，ALS發(fā)生Ala205Val或Ser653Asn突變是該種群產(chǎn)生對咪唑乙煙酸抗性的主要原因之一。另外，該兩種突變分別存在于不同反枝莧植株，未在同一植株同時發(fā)現(xiàn)，其原因可能是測序樣本數(shù)量較少，也可能與反枝莧是自花授粉相關(guān)。測序植株中，兩種突變均以純合形式出現(xiàn)，推測在咪唑乙煙酸選擇壓力下，雜合突變植株可能存在適合度代價，從而使田間反枝莧逐漸演化為以純合突變植株為主的種群。

由于反枝莧對咪唑乙煙酸等ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生了抗性，因此，生產(chǎn)中對氟磺胺草醚等PPO抑制劑類除草劑的依賴增強(qiáng)，增強(qiáng)的選擇壓力加速了反枝莧對PPO抑制劑類除草劑抗性的產(chǎn)生。近幾年，我國學(xué)者相繼報(bào)道了反枝莧對氟磺胺草醚的抗性，并對抗性機(jī)理進(jìn)行了解析，其中線粒體型PPO（PPX2）發(fā)生突變導(dǎo)致Arg128Gly氨基酸替換是產(chǎn)生靶標(biāo)抗性的最主要因素之一，部分案例中伴隨著P450，GSTs活性增強(qiáng)導(dǎo)致的非靶標(biāo)抗性。本研究中，未對非靶標(biāo)抗性機(jī)理進(jìn)行深入探究，為準(zhǔn)確評價PPX2 Arg128Gly突變導(dǎo)致的植株對氟磺胺草醚的抗性，進(jìn)行了擬南芥轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)該突變可導(dǎo)致敏感植株對氟磺胺草醚產(chǎn)生高水平（gt;10倍）抗性。

咪唑乙煙酸、氟磺胺草醚是東北大豆田最常見的除草劑，反枝莧ALS、PPO突變將極大降低這兩種藥劑的防除效果。下一步將對抗性種群非靶標(biāo)機(jī)理進(jìn)行深入研究，同時評價抗性種群對不同作用機(jī)理除草劑的敏感性，對多抗性反枝莧防除提供指導(dǎo)。