關(guān)鍵詞煙草；云南；煙草花葉病毒；CP基因；遺傳多樣性

煙草花葉病毒（tobacco mosalc virus）屬帚狀病毒科煙草花葉病毒屬，在田間可通過汁液傳播侵染煙草、番茄、黃瓜和蘭花等65科885余種植物，造成嚴重的經(jīng)濟損失。TMV是目前云南煙草上發(fā)生最普遍、分布最廣的病毒。TMV破壞葉綠素，使光合作用減弱，造成煙草發(fā)育不良，葉片厚薄不均、葉緣向下卷曲、明脈、矮化、花葉、斑駁、黃化畸形甚至死亡，嚴重影響煙草的經(jīng)濟效益。

培育抗性品種是目前防治病毒病的主要措施之一，但植物病毒在面臨不同寄主和環(huán)境時會不斷產(chǎn)生新的變異以增強適應(yīng)性，導(dǎo)致抗性品種的抗性減弱。分析云南不同地區(qū)煙草TMV分離物的群體遺傳多樣性，對了解云南煙草TMV的起源、進化以及流行途徑具有重要的作用。病毒群體的遺傳多樣性受到多種因素的影響，例如突變、基因重組、基因流和選擇壓力等，研究病毒群體的遺傳多樣性和分子變異有助于了解病毒群體的動態(tài)變化和進化機制。目前，關(guān)于番茄斑萎病毒（tomatospotted wilt virus，TSWV）、番茄花葉病毒（to-mato mosaic virus．ToMV）、蘋果銹果類病毒（apple scar skin viroid，ASSVd）、番茄褪綠病毒（tomato chlorosis vlrus，ToCV）等多種植物病毒的群體遺傳多樣性已有報道。TMV的CP基因序列保守性較高，常被用于分子變異等遺傳進化研究：TMV在20世紀初傳人我國云南，隨后擴散至北方，并在北方發(fā)生群體擴張；李凡等、秦西云等及丁銘等對來自云南煙草的TMV CP基因進行分析，均發(fā)現(xiàn)云南煙草TMV歸屬為TMV-UI株系；2012年宋麗云和2016年Wu等對我國不同地理來源的TMV CP基因進行了分析，認為我國煙草上TMV變異程度低，群體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且無基因重組現(xiàn)象；Pagan等認為在一個相對較近的時間框架內(nèi)，TMV的進化特征是頻繁的跨物種傳播；Alishiri等對伊朗116個不同地理和寄主來源的TMV CP基因的分析顯示，遺傳距離、地理來源和寄主種之間無相關(guān)性，負選擇壓力是進化的主要驅(qū)動力。

了解病毒群體結(jié)構(gòu)對抗病育種和制定防治策略尤為重要。煙草是云南的支柱產(chǎn)業(yè)．受TMV危害嚴重，關(guān)于云南煙草TMV群體遺傳變異情況，目前尚未有任何報道。為此，本研究從云南玉溪、保山、楚雄、大理等11個植煙區(qū)收集了疑似感染TMV的煙葉樣本，通過RT-PCR鑒定樣本中的TMV，通過突變、重組、系統(tǒng)發(fā)育、錯配分布、遺傳分化分析等方法來評估云南煙草TMV群體的遺傳多樣性，以期為煙草TMV的抗病育種和防治提供理論依據(jù)，為更好地了解TMV的進化機制提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

煙葉樣品的采集時間為2022年10月至2023年6月，采集地點包括云南省的玉溪、保山、楚雄、大理、昆明、昭通、普洱、曲靖、文山、紅河、臨滄等11個植煙區(qū)，樣品采集后立即液氮速凍，隨后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒購自全式金生物（北京）有限公司；PrimeScript'rMⅡlst Strand cDNA SynthesisKit、克隆載體pMD-rM 19-T、LA Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司（日本）；大腸桿菌Escherichia coliTrans 5a感受態(tài)細胞購于北京全式金生物有限公司；LB培養(yǎng)基、通用型DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；其他常規(guī)試劑購自中國醫(yī)藥集團（北京）有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1RNA提取及TMV CP基因的RT-PCR擴增與測序

取0.1g煙葉樣品按照試劑盒說明書提取總RNA。以總RNA為模板，使用PrimeScriptⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，并將其存放于-20℃冰箱中備用。為避免測序誤差，根據(jù)TMV全基因組序列（GenBank登錄號：NC_001367）設(shè)計包含CP基因全序列的引物TMV-CPF：5'-ATGATTCG-GAGGCTACTGTC-3，TMV-CPR：5，-CGTGTGA-TTACGGACACAA-3．目的片段長度為570bp，引物由生工生物工程（昆明）股份有限公司合成。以cDNA為模板，參照LA Taq說明書擴增TMV CP基因。PCR反應(yīng)體系：擴增程序：94℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸35s，30個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

用DNA純化回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，然后將其連人pMD19-T載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans 5a感受態(tài)細胞中，對PCR檢測為陽性的單菌落進行測序得到TMV的CP基因序列。每個樣品測定3個克隆的序列，若序列完全相同，則選擇任意一條序列，按“TMV/采樣地點／序列編號”命名，如“TMV/BS/I\"代表“TMV/保山／1號序列”。

1.2.2云南煙草TMV CP基因序列多樣性比對

將獲得的138個云南煙草TMV分離物的序列（570bp）在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST后，使用軟件MEGA11.0進行多重比對并刪除前后的多余序列，獲得138個TMV分離物的完整CP基因序列（480 bp）。應(yīng)用軟件MEGA11.0中的ClustalW對其氨基酸序列進行多重比對并手動校正，點擊“DNA Sequences”獲得相應(yīng)的DNA序列比對結(jié)果。采用SDT1.2軟件對獲得的138個TMV分離物的CP基因進行比較，計算核苷酸序列和氨基酸序列的一致性。

1.2.3云南煙草TMV CP基因變異位點和保守區(qū)域分析

使用DnaSP5.0軟件分析138個TMV分離物的CP基因單倍型、變異情況和保守區(qū)域。

1.2.4云南煙草TMV CP基因重組及系統(tǒng)發(fā)育分析

使用軟件RDP 4.101中的7個檢測程序（R，RDP; G，

GeneConv; B，

Bootscan;M，MaxChi;C，Chimaera；S，SiScan；3S，3SEQ）檢測可能存在的重組位點；植物病毒的發(fā)生、進化和變異與不同寄主、地理位置、生長環(huán)境等因素有關(guān)，為探究地理因素和寄主因素對云南煙草TMV進化的影響，本研究以以下兩種特征的序列作為參考序列：1）NCBI上其他地區(qū)TMV煙草分離物的CP基因；2）云南地區(qū)其他寄主TMV分離物的CP基因（表5）。將本試驗所獲得的云南煙草TMV分離物的CP基因與參考序列一起進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。使用MEGA11.0軟件先評估所用序列的最佳核苷酸替代模型及相關(guān)參數(shù)，然后用最大似然法（maximum likelihood，ML）建樹，bootstrap設(shè)定為1000。

1.2.5云南煙草TMV CP基因中性檢驗及錯配分布分析

利用DnaSP5.0軟件計算云南煙草TMV群體的單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（P），以Arlequin 3.11軟件計算煙草TMV群體的Tajima'sD和Fu，s Fs，進行中性檢驗分析，若某群體中性檢驗結(jié)果為顯著偏離中性突變（即數(shù)值為負，且Plt;0.05），則使用DnaSP 5.0軟件對該群體進行錯配分布分析。錯配分布（mismatch distribution）能夠以可視化方式體現(xiàn)群體歷史動態(tài)，理論上當群體處于擴張時，可計算出擴張前后的群體大小及擴張發(fā)生的時間。在群體中性檢驗結(jié)果顯著偏離中性突變的情況下：若錯配分布曲線呈單峰泊松分布，則該群體在過去曾經(jīng)歷擴張；若錯配分布曲線呈多峰分布，則群體大小穩(wěn)定。

1.2.6云南煙草TMV群體CP基因選擇壓力分析

使用MEGA11.0軟件中的Ne-Goiobon meth-od（Jukes-Cantor）計算TMV CP基因的非同義突變（dN）和同義突變（dS），判斷各TMV群體CP基因所承受的選擇壓力。dN/dSlt;1時該群體CP基因進化受純化或負向選擇壓力驅(qū)動；dN/dS=1時該群體CP基因進化受中性壓力選擇；dN/dSgt;1時該群體CP基因受正向選擇或多樣化選擇。

1.2.7基于CP基因分析云南煙草TMV群體間的遺傳分化

使用Arlequin 3.11軟件對云南煙草TMV群體進行分子變異分析（analysis of molecular vari-ance，AMOVA）以計算遺傳分化系數(shù)（K、Z和Snn等）參數(shù)，若K、Z和S3個統(tǒng)計量同時顯著，則群體間的遺傳分化是顯著的。群體間的基因交流程度采用F和N值來反應(yīng)，理論上01表明基因流的水平較高可抵制遺傳漂變，以防止群體分化發(fā)生；N=1表明群體較為穩(wěn)定，基因流與遺傳漂變不易發(fā)生。最后使用MEGA11.0軟件的最大組成似然模型自舉法進行1000次模擬，以計算不同群體的遺傳距離，群體間的遺傳距離越大多樣性越高。

2結(jié)果與分析

2.1樣品中TMV檢測結(jié)果及CP基因序列多樣性比對

從云南省玉溪、保山、楚雄、大理、昆明、昭通、普洱、曲靖、文山、紅河、臨滄、麗江11個植煙區(qū)獲得了138個TMV CP基因序列（表1），長度均為480bp，將所得序列提交到GenBank中，獲得的登錄號為OR360644～OR360730（表2）。SDT1.2對138個TMV CP基因的多樣性比對結(jié)果表明：來自不同種植區(qū)的煙草TMV分離物CP基因的核苷酸和氨基酸序列一致性均在96%～100%之間，說明云南煙草TMV CP蛋白在進化中具有較高保守性。

2.2云南煙草TMV分離物CP基因的單倍型及變異分析

利用DnaSP 5.0軟件對TMV CP基因序列進行單倍型分析，發(fā)現(xiàn)云南煙草TMV分離物具有較高的單倍型多樣性，玉溪24個分離物有16種單倍型，昭通23個分離物有15種單倍型，曲靖16個分離物有12種單倍型，昆明10個分離物有6種單倍型，臨滄2個分離物有2種單倍型，保山10個分離物有7種單倍型，文山1 5個分離物有14種單倍型，大理6個分離物有6種單倍型，楚雄19個分離物有12種單倍型，紅河4個分離物有4種單倍型，普洱9個分離物有8種單倍型，整體多樣性較高。

在87個單倍型中，Hap_3、Hap_12和Hap_13是主要的單倍型。Hap_3單倍型分布在玉溪、保山、楚雄、昆明、普洱和文山6個植煙區(qū)中；Hap_12單倍型出現(xiàn)在玉溪、大理、楚雄、昭通和曲靖5個植煙區(qū)中，Hap_13單倍型出現(xiàn)在玉溪、楚雄、昆明、普洱和曲靖5個植煙區(qū)中；Hap_2單倍型同時出現(xiàn)在玉溪和文山2個植煙區(qū)；Hap_8單倍型同時出現(xiàn)在玉溪和曲靖2個植煙區(qū)共享；Hap_22單倍型同時出現(xiàn)在保山和楚雄2個植煙區(qū)，其余均為特有單倍型（表2）。

利用DnaSP 5.0軟件對TMV CP基因序列進行保守性分析，發(fā)現(xiàn)云南煙草TMV CP基因有2個保守區(qū)域，保守性分別為0.859和0.842（表3），表明云南煙草TMV CP基因比較保守。

突變分析顯示，138條CP基因序列平均G+C含量43.5%。轉(zhuǎn)換／顛換比率（Ts/Tv）為6.6。變異位點122個占總位點的25.42%，包括簡約信息位點（parsimony informative sites）

48個和單突變位點（singleton variable sites）74個，沒有堿基插入和缺失，變異類型只有核苷酸替換（表4）。

2.3TMV CP基因重組和系統(tǒng)發(fā)育分析

重組檢測結(jié)果顯示，138個分離物的CP基因中均未發(fā)現(xiàn)明顯的重組事件。

植物病毒的發(fā)生、進化和變異與不同寄主、地理位置、生長環(huán)境等因素有關(guān)，為研究地理因素和寄主因素對云南煙草TMV進化的影響，本研究使用MEGA11.0軟件進行評估，獲得最佳核苷酸替代模型為“T92+G”。采用最大似然法及T92+G模型，以NCBI上其他地區(qū)煙草分離物的CP基因、及云南地區(qū)其他寄主分離物的CP基因作為參考序列（表5），以齒蘭環(huán)斑病毒（odontoglossum rlng spotvlrus，C）RSV）的參考序列（AB693990）作為外類群，構(gòu)建了TMV分離物CP基因的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明：所有TMV分離物可分為4組，本研究所獲得的138個分離物分布于1、2、3組，其中來自昭通地區(qū)的分離物聚集較為明顯，23個中有20個分布在第2組（圖1）。來自陜西煙草、廣西煙草、四川煙草、越南煙草、云南喀西茄、云南青蒿、遼寧煙草、云南滇重樓、云南微小扇頭蜱、泰國煙草、重慶煙草、云南香料煙的TMV CP基因聚集在第1組；來自河南、貴州、廣東的煙草TMV CP基因聚集在第3組；來自日本、韓國、巴西、福建、美國、南非、英國、北京煙草及云南滇黃精的TMV CP基因分布在第4組。即TMV在云南昭通及英國、南非、美國、巴西、韓國、北京等地區(qū)的煙草寄主上具有一定的地理特異性，但在整個云南地區(qū)的不同寄主上都不具備寄主特異性，這表明云南煙草TMV分離物的適應(yīng)性進化受地理適應(yīng)性所驅(qū)動，與寄主適應(yīng)性基本無關(guān)。

2.4TMV CP基因遺傳多樣性分析

使用DnaSP 5.10.1軟件計算11個云南煙草TMV群體的遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果顯示，11個群體的總體單倍型多樣性（ Hd）和核酸多樣性（Pi）分別為（0.970±0.009） （0.018±0.004），所有群體均滿足Hdgt;0.5，Pigt;0.005。在11個群體中，保山TMV群體的Pi較低，為（0.011±0.002）；昭通TMV群體的Pi最高，為（0.040±0.009）；昆明TMV群體Hd最低，為（0.867±0.107）；昭通TMV群體Hd最高，為（1.000±0.500）；昭通TMV群體的Pi和H均為最高（表6）。

使用Arlequin 3.11計算Tajima's D和Fu'sFs，對11個煙區(qū)TMV群體進行中性檢驗，結(jié)果顯示除曲靖、紅河、昆明、臨滄、普洱外所有群體的Tajima's D和Fu's Fs均為負值，且整體和昭通群體的Tajima's D和Fu，s Fs經(jīng)檢驗其P分別小于0.001和0.01（表6），表明整體和昭通群體偏離中性突變，存在選擇壓力。

將中性檢驗結(jié)果顯著偏離中性突變（即數(shù)值為負，且Plt;0.05）的整體和昭通TMV群體進行錯配分布分析，結(jié)果顯示，這2個TMV群體CP基因的期望觀測曲線均是比較平滑的，但實際觀測擴張曲線均呈多峰分布（圖2），即所有云南煙草TMV群體的CP基因過去保持大小穩(wěn)定，未曾經(jīng)歷過群體擴張事件。

2.5TMV CP基因選擇壓力分析

利用MEGA11.0中Ne-Goiobon method（Jukes-Cantor）分別計算TMV群體的CP基因的非同義突變（dN）和同義突變（dS），判斷各TMV群體CP基因所承受的選擇壓力。結(jié)果顯示，1 1個煙區(qū)TMV群體的dN/dS值均小于1（表7），說明這1 1個TMV群體的突變大多為同義突變，云南煙草TMV群體的CP基因進化主要受負選擇壓力作用。

2.6云南煙草TMV群體間遺傳分化分析

群體間的遺傳分化差異用K、Z和S3個統(tǒng)計量進行分析，當3個統(tǒng)計量同時顯著，則遺傳差異顯著。結(jié)果表明：昭通與玉溪、文山、楚雄、曲靖、昆明、保山、普洱群體之間的遺傳分化差異顯著；曲靖與玉溪、文山、昭通、楚雄、昆明、保山、普洱群體之間的遺傳分化差異顯著；玉溪與保山群體之間的遺傳分化差異顯著；總體而言，昭通、曲靖與其他群體之間的遺傳分化差異較為顯著（表8）。

群體間的基因交流程度采用值來反應(yīng)。昆明與玉溪、文山、大理、昭通、楚雄、普洱TMV群體之間的大于0.33，基因交流的頻率很低；臨滄與玉溪、文山、楚雄、普洱TMV群體之間的大于0.33，基因交流的頻率也很低，其余所有群體間的都小于0.33，存在較為頻繁的基因交流。其中文山與昆明TMV群體之間的基因交流頻率最低，普洱與楚雄、玉溪TMV群體之間地理位置距離較近，基因交流頻率也最高（表8）。

從N值來看，除昭通與所有TMV群體之間，曲靖與普洱、保山、昆明、楚雄、文山TMV群體之間很容易發(fā)生遺傳漂變促使群體發(fā)生遺傳分化以外，其余群體之間的基因流都可以抵制遺傳漂變（表8）。

在11個煙草TMV群體中，昭通和臨滄之間的遺傳距離最大，為0.106，楚雄和普洱群體之間，保山和普洱群體之間的遺傳距離最小，均為0.044（表8），表現(xiàn)出地理距離更近的群體間遺傳距離更小，地理距離更遠的群體間遺傳距離更大的現(xiàn)象。

3結(jié)論與討論

TMV是全球最具破壞性的植物病毒之一，是目前云南煙草上發(fā)生最普遍、分布最廣的病毒。開展TMV群體遺傳多樣性研究，探明TMV的分子進化特征，對科學(xué)精準防控TMV意義重大。本研究從云南全省各煙區(qū)獲得138個TMV分離物的CP基因序列，分析了各煙區(qū)分離物群體的突變、選擇壓力、基因重組、系統(tǒng)發(fā)育和基因流等情況。

突變和選擇壓力是病毒群體變異的重要驅(qū)動力。本試驗中來自云南不同種植區(qū)的138個煙草TMV分離物CP基因的核苷酸與氨基酸序列一致性均為96%～100%，Alishiri等分析了伊朗TMV不同寄主分離物的CP基因，發(fā)現(xiàn)其序列間的一致性為93%～94.5%，表明TMV云南煙草離物的CP基因在進化中具有更高保守性。突變分析表明，云南煙草TMV分離物的CP基因遺傳多樣性很低，比較保守，變異類型只有核苷酸替換，這與宋麗云和Wu等的研究結(jié)果一致。負選擇壓力會加快基因中有害突變的消除和穩(wěn)定群體結(jié)構(gòu)的形成速度，云南不同地理來源煙草上的TMV整體處于負選擇壓力作用中，負選擇壓力是限制云南煙草TMV群體變異的主要因素。

基因重組被作為植物病毒遺傳多樣性的主要來源之一，已在草莓潛隱環(huán)斑病毒（strawberry la-tent ringspot virus，SLRSV）、番茄斑萎病毒（to-mato spotted wilt virus．TSWV）等多種病毒中被報道。本研究的重組分析結(jié)果表明，在138個TMV分離物CP基因中均未發(fā)現(xiàn)明顯的重組事件，這與2012年宋麗云和2016年Wu等對我國不同地理來源的TMV分離物CP基因分析發(fā)現(xiàn)無基因重組現(xiàn)象的結(jié)果一致，推測不易發(fā)生基因重組可能是TMV群體結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定的原因之一。

寄主差異和地理隔離是影響病毒群體結(jié)構(gòu)的一個重要因素。為探明主要影響云南煙草TMV群體適應(yīng)性進化的因素，本研究對來自云南煙草、NC-BI上其他地區(qū)煙草及云南地區(qū)其他寄主TMV分離物的CP基因進行了系統(tǒng)進化分析，結(jié)果證明，云南煙草TMV分離物的適應(yīng)性進化受地理適應(yīng)性所驅(qū)動，與寄主適應(yīng)性基本無關(guān)。

對云南煙草TMV群體間遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，云南煙草TMV分離物由一個大而穩(wěn)定的群體經(jīng)過長時間演化所產(chǎn)生。昭通群體的變異比較明顯，核苷酸多樣性和單倍型多樣性均為最高。中性檢驗結(jié)合錯配分布結(jié)果表明，云南煙草TMV群體大小穩(wěn)定，未曾經(jīng)歷過群體擴張事件。遺傳分化及基因流分析結(jié)果表明，云南煙草TMV群體具有總體遺傳變異度較低的特征，昭通和曲靖與云南其他群體之間遺傳分化差異較為顯著、很容易發(fā)生遺傳漂變促使群體發(fā)生遺傳分化，而昭通和曲靖群體之外的其余大部分群體之間的基因流都可抵制遺傳漂變。推測原因可能是昭通與曲靖境內(nèi)海拔差異較大，氣候復(fù)雜多樣，致使這兩個地區(qū)的TMV發(fā)生適應(yīng)性進化；

本研究首次報道了云南煙草TMV群體的遺傳變異情況，明確了云南煙草TMV總體遺傳變異度較低，適應(yīng)性進化主要受負向選擇壓力、地理適應(yīng)性所驅(qū)動，未經(jīng)歷過群體擴張事件，未發(fā)現(xiàn)重組現(xiàn)象，昭通與曲靖地區(qū)容易發(fā)生遺傳漂變促使群體發(fā)生遺傳分化以適應(yīng)環(huán)境，對于云南煙草TMV防控和抗性品種培育具有重要意義。