關(guān)鍵詞氯蟲苯甲酰胺；廣雙瘤蚜繭蜂；存活率；存活時(shí)間；共生菌

氯蟲苯甲酰胺（chlorantraniliprole）是美國杜邦公司研制的一種新型鄰甲酰胺基苯甲酰胺類殺蟲劑，通過激活昆蟲魚尼?。╮yanodine receptor）受體，使昆蟲麻痹抽搐致死。已有的研究表明，氯蟲苯甲酰胺對(duì)環(huán)境生物蚯蚓和蜜蜂等表現(xiàn)為低毒，對(duì)家蠶表現(xiàn)為劇毒，而對(duì)天敵瓢蟲則屬于中風(fēng)險(xiǎn)。隨著生物防治技術(shù)的廣泛推廣，殺蟲劑對(duì)天敵昆蟲的威脅也逐漸受到了關(guān)注，因此，了解氯蟲苯甲酰胺對(duì)天敵昆蟲的影響是非常重要的。

棉蚜Aphis gossypii Glover廣泛分布于世界各國，是棉花的重要害蟲。廣雙瘤蚜繭蜂廣泛分布于棉田，是棉蚜優(yōu)勢寄生蜂。在田間施用化學(xué)農(nóng)藥能減少病蟲草害的發(fā)生，有利于作物的生長，但同時(shí)也影響農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的其他成分，例如會(huì)導(dǎo)致廣雙瘤蚜繭蜂直接或間接地接觸到農(nóng)藥。

在蚜蟲和寄生蜂之間可能存在一種由共生菌調(diào)控的協(xié)同進(jìn)化競爭的關(guān)系。有學(xué)者研究了小菜蛾（抗氟苯蟲酰胺品系）腸道細(xì)菌對(duì)氟苯蟲酰胺的耐受性以及生物降解能力，發(fā)現(xiàn)腸桿菌、沙雷氏菌和肉桿菌等組成的混合菌對(duì)氟苯蟲酰胺具有生物降解功能，證實(shí)了腸道微生物在小菜蛾的抗藥性中發(fā)揮了作用。感染沙雷氏菌可以提高桃蚜對(duì)短翅蚜小蜂的防御作用與高溫耐受性，共生菌能夠明顯縮短桃蚜發(fā)育時(shí)間，增加蚜蟲的繁殖力。目前，雖然昆蟲體內(nèi)的微生物多樣性已經(jīng)被廣泛研究，但大多數(shù)研究都集中在腸道微生物。而關(guān)于評(píng)價(jià)寄生性天敵昆蟲在接觸到殺蟲劑時(shí)體內(nèi)微生物種群是否會(huì)受到影響仍不清楚。

本研究旨在明確氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量（66.7mg/L）對(duì)廣雙瘤蚜繭蜂當(dāng)代和子代存活率和存活時(shí)間的影響以及體內(nèi)共生菌組成的變化情況，為更好地了解氯蟲苯甲酰胺對(duì)寄生性天敵的影響和氯蟲苯甲酰胺的安全應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

廣雙瘤蚜繭蜂和棉蚜均采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗(yàn)農(nóng)場（36°05'N．114°31'E）。廣雙瘤蚜繭蜂成蜂以棉蚜2齡若蚜為寄主進(jìn)行擴(kuò)繁，供試棉蚜為單個(gè)棉蚜在棉花上孤雌繁殖形成的種群，用網(wǎng)籠（30cm×30cm×30cm）飼養(yǎng)。試驗(yàn)昆蟲均為繼代飼養(yǎng)10代以上無農(nóng)藥背景的種群，飼養(yǎng)條件為：溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度（65±5）%，光周期L∥D=14h∥10h。

棉花品種為‘中棉所49'，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所種質(zhì)資源庫提供，在（26±1）℃，相對(duì)濕度（75±5）%，光周期L∥D=14h∥10h條件下培育。氯蟲苯甲酰胺原藥購自安陽全豐生物科技有限公司（CAS號(hào)：500008-45-7），田間推薦劑量為66.7mg/L，本文的試驗(yàn)均采用此濃度。

1.2氯蟲苯甲酰胺暴露對(duì)F0和F1代廣雙瘤蚜繭蜂的影響

使用藥膜法進(jìn)行試驗(yàn)。氯蟲苯甲酰胺原藥用丙酮溶解后配制成濃度為66.7mg/L的藥液，吸取2～3ml藥劑于離心管中（7mL），快速轉(zhuǎn)動(dòng)離心管使藥液均勻分布于離心管內(nèi)壁，然后靜置，待管內(nèi)壁藥劑全部蒸發(fā)干燥后得到有均勻藥膜的干燥離心管，以0.1% Triton X-100溶液處理的離心管為對(duì)照。將羽化24h內(nèi)的廣雙瘤蚜繭蜂成蜂20頭接入離心管內(nèi)使其充分爬行1h，然后收集雌蜂和雄蜂，按寄生蜂：棉蚜=1：10的比例將成對(duì)寄生蜂移人接有30頭2齡棉蚜若蚜的新鮮棉花真葉上使其充分寄生8h，然后轉(zhuǎn)移至自制干凈無藥劑且有足夠多氣孔的離心管內(nèi)，為確保充足的營養(yǎng)供給，用含有20%蜂蜜水溶液的棉球飼喂廣雙瘤蚜繭蜂。每24h觀察并統(tǒng)計(jì)寄生蜂的存活率和存活時(shí)間，直至其死亡。每處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。同時(shí)，將棉蚜轉(zhuǎn)移到1.8%瓊脂培養(yǎng)皿中（皿內(nèi)放有棉花子葉），于溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度（75±5）%，光周期L∥D=14h∥10h的人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)。每48h更換1次培養(yǎng)皿和棉花葉片，至F1代廣雙瘤蚜繭蜂羽化后，收集雌蜂和雄蜂，使其在不接觸藥劑的條件下寄生棉蚜，處理方法同前，統(tǒng)計(jì)F1代廣雙瘤蚜繭蜂的存活率和存活時(shí)間等生物學(xué)數(shù)據(jù)。

1.3氯蟲苯甲酰胺暴露對(duì)廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共生茵多樣性的影響

1.3.1廣雙瘤蚜繭蜂總DNA提取

分別用氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量處理廣雙瘤蚜繭蜂1h和3d，然后將30頭存活的廣雙瘤蚜繭蜂（統(tǒng)稱為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)）保存在無酶離心管中。以0.1% Triton X-100溶液制備的藥膜離心管處理為空白對(duì)照。每處理組均包含6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將廣雙瘤蚜繭蜂樣本用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，再用無菌ddH2O反復(fù)沖洗，晾干后使用FastDNA⑥Spin Kitfor Soil（MP Biomedicals，Arnerica）提取并純化DNA。

1.3.2共生菌的多樣性分析

通過Miseq測序技術(shù)得到雙端序列數(shù)據(jù)（paired-end reads．PE reads）。采取基于窗口的低質(zhì)量數(shù)據(jù)去除策略進(jìn)行質(zhì)控，窗口大小設(shè)定為50bp，去除低于Q20質(zhì)量的reads，長度不足50bp的reads以及包含N堿基的reads，以確保數(shù)據(jù)的純凈性。將得到的高質(zhì)量PE reads，以overlap長度至少為10 bp進(jìn)行拼接，在拼接過程中允許一定程度的錯(cuò)配，但將錯(cuò)配比率控制在0.2以下，剔除所有不符合這一標(biāo)準(zhǔn)的序列，根據(jù)序列兩端的barcode和引物信息對(duì)樣品進(jìn)行區(qū)分。barcode序列與reads要求完全匹配，不允許任何錯(cuò)配；而引物的錯(cuò)配數(shù)則不得超過2。最后，基于序列間的重疊關(guān)系用FLASH軟件將雙末端測序所得的成對(duì)reads組裝為單一序列，進(jìn)而獲取了高變區(qū)的Tags。在拼接過程中設(shè)定15bp為最小匹配長度且允許重疊區(qū)域存在0.1以內(nèi)的錯(cuò)配率，以確保組裝結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過處理后，在97%相似性閾值下，按相似性進(jìn)行聚類，獲得ASV（amplicon sequence variant），每個(gè)ASV對(duì)應(yīng)1個(gè)物種。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用GraphPad Prism 8軟件分析存活率和存活時(shí)間數(shù)據(jù)并繪制圖表，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析處理和對(duì)照之間的差異顯著性。

針對(duì)每個(gè)ASV所對(duì)應(yīng)物種采用多種方法進(jìn)行a多樣性分析，包括classify-sklearn（基于樸素貝葉斯）、classify-consensus-Vsearch（基于Vsearch）、classify-consensus-Blast（基于Blast）以及RDP clas-sifier貝葉斯算法。為評(píng)估菌群豐度，采用Ace指數(shù)和Chao指數(shù)作為關(guān)鍵度量標(biāo)準(zhǔn)，其數(shù)值升高表明群落物種豐富度增加。菌群多樣性通過Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)來評(píng)估，Shannon指數(shù)與群落多樣性之間存在正相關(guān)性，即指數(shù)值越高多樣性越豐富；而Simpson指數(shù)則與多樣性呈負(fù)相關(guān)，即指數(shù)值越低多樣性越高。此外，為全面評(píng)估菌群多樣性加入了覆蓋率這一指標(biāo)來衡量測序深度。

2結(jié)果與分析

2.1氯蟲苯甲酰胺暴露后F0代廣雙瘤蚜繭蜂的存活率和存活時(shí)間

接觸田間推薦劑量的氯蟲苯甲酰胺（CAP）1h對(duì)廣雙瘤蚜繭蜂的存活率沒有顯著影響（t=0.923，P=0.408），對(duì)照組和處理組的存活率分別為62.20%、69.45%（圖1a）；但廣雙瘤蚜繭蜂的存活時(shí)間顯著縮短（t=6.326，P=0.003），CAP暴露1h存活時(shí)間僅為2.9d，對(duì)照組存活時(shí)間為4.6d（圖1b）。

2.2氯蟲苯甲酰胺暴露后Fi代廣雙瘤蚜繭蜂的存活率和存活時(shí)間

為明確接觸氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量對(duì)廣雙瘤蚜繭蜂是否存在代際傳遞效應(yīng)，對(duì)接觸氯蟲苯甲酰胺1h后正常寄生產(chǎn)生的F1代寄生蜂的存活率和存活時(shí)間進(jìn)行了測定。結(jié)果（圖2）表明，與對(duì)照組F1代廣雙瘤蚜繭蜂存活率（83.33%）相比，CAP處理組F1代的存活率（61.31%）呈現(xiàn)出下降的趨勢，但未達(dá)到顯著水平（t=1.781，P=0.150）。廣雙瘤蚜繭蜂F1代的存活時(shí)間縮短至3.4d，與對(duì)照組的4.6d相比顯著降低（t=4.47．P=0.011）。

2.3接觸氯蟲苯甲酰胺后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共生菌的alpha多樣性分析

對(duì)氯蟲苯甲酰胺暴露1h處理的廣雙瘤蚜繭蜂的16SrDNA進(jìn)行測序，質(zhì)控和拼接，獲得537099條有效序列，聚類后得到894個(gè)ASV；暴露3d處理組獲得603218條有效序列，聚類后得到266個(gè)ASV。在97%相似性閾值下，依據(jù)ASV信息，采用多樣性指標(biāo)Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)對(duì)樣品微生物物種豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)Ace指數(shù)和Chao指數(shù)分析結(jié)果，氯蟲苯甲酰胺暴露1h處理組中微生物的物種豐富度低于對(duì)照組，根據(jù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分析結(jié)果，暴露1h處理組的群落多樣性高于對(duì)照組；延長接觸暴露時(shí)間至3d后，與對(duì)照組相比處理組的物種豐富度和群落多樣性增加。廣雙瘤蚜繭蜂經(jīng)66.7mg/L氯蟲苯甲酰胺處理后的ASV覆蓋率達(dá)到100%，覆蓋度指數(shù)均為1，表明不存在未被測序檢測到的物種，測序數(shù)據(jù)量合理。

2.4接觸氯蟲苯甲酰胺后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共生茵的ASV Venn圖分析

Venn圖可以更加清晰地顯示出氯蟲苯甲酰胺（CAP）處理和對(duì)照組中廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共有和特有的微生物種類數(shù)量。對(duì)基于屬水平的微生物種類進(jìn)行分析可知，暴露th時(shí)，對(duì)照組和處理組分別有232個(gè)和156個(gè)物種是特有的，有34個(gè)物種是共有的；暴露3d時(shí)對(duì)照組和處理組分別有18個(gè)和58個(gè)物種是特有的，有4個(gè)物種是共有的。由此可知，CAP暴露1h后，與對(duì)照組相比，CAP處理組降低了寄生蜂體內(nèi)微生物豐富度和多樣性；而延長暴露時(shí)間至3d，寄生蜂體內(nèi)微生物多樣性和豐富度增加。

2.5接觸氯蟲苯甲酰胺后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共生茵組成分析

門水平上，氯蟲苯甲酰胺暴露1h和3d，廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)微生物的核心群落組成均為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinomycetota和芽胞桿菌門Bacillota（gt;99%），但相對(duì)豐度不同，其中，暴露1h處理，變形菌門（CK：98.42%；CAP：99.28%）、放線菌門（CK：0.29%；CAP：0.20%）、芽胞桿菌門（CK：0.47%; CAP：0.30%）相對(duì)豐度沒有明顯變化。氯蟲苯甲酰胺暴露3d，與對(duì)照相比，變形菌門相對(duì)豐度由35.5%升高至99.68%，放線菌門的相對(duì)豐度由64.54%降低至0.04%；芽胞桿菌門的相對(duì)豐度變化不大，由0.03%變?yōu)?.22%（圖4）。

在屬水平上，對(duì)照和氯蟲苯甲酰胺暴露處理的廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)共生菌的優(yōu)勢菌屬均為沙雷氏菌屬Serratia。對(duì)照組共生菌主要由沙雷氏菌屬（71.64%）、克雷伯氏菌屬（12.45%）、未分類（Unclassified） （8.33%）、志賀氏菌屬ShigeLla（5.86%）組成。而氯蟲苯甲酰胺暴露1h，各屬占比分別為：沙雷氏菌屬71.05%、克雷伯氏菌屬11.60%、志賀氏菌5.36%、紅球菌屬Rhodococcuts0.01%。延長暴露時(shí)間至3d后，對(duì)照組中共生菌由沙雷氏菌屬（7.84%）、紅球菌屬（64.43%）和葡萄桿菌屬Gluconobacter（27.43%）組成，CAP處理組中，沙雷氏菌屬占比36.82%，葡萄桿菌屬升高至44.5%，克雷伯氏菌屬占比2.46%，志賀氏菌屬占比1.64%，紅球菌屬的含量降低至0（圖4）。

3討論

在田間使用農(nóng)藥的過程中，害蟲和非靶標(biāo)昆蟲都暴露于殺蟲劑中，殺蟲劑會(huì)對(duì)它們產(chǎn)生多種效應(yīng)，甚至對(duì)其后代造成一定的威脅。因此，研究殺蟲劑對(duì)天敵昆蟲的影響能夠更好地了解殺蟲劑施用過程中環(huán)境昆蟲，尤其是天敵昆蟲的風(fēng)險(xiǎn)。農(nóng)藥對(duì)寄生性天敵及其代際效應(yīng)的影響研究較少。氯蟲苯甲酰胺因其廣譜、高效低毒和環(huán)境友好等特性被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。本研究評(píng)價(jià)了氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量對(duì)廣雙瘤蚜繭蜂當(dāng)代及后代的影響，并通過高通量測序分析了其體內(nèi)共生菌種類組成及相對(duì)豐度的變化。結(jié)果表明，氯蟲苯甲酰胺暴露對(duì)寄生蜂當(dāng)代及后代的存活時(shí)間均表現(xiàn)為負(fù)影響，同時(shí)接觸氯蟲苯甲酰胺3d后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)微生物物種多樣性發(fā)生明顯變化。

無論是高效低毒還是高毒殺蟲劑使用后都會(huì)在田間殘留，對(duì)非靶標(biāo)昆蟲生長發(fā)育以及繁殖產(chǎn)生不同程度的影響。有研究報(bào)告了氯蟲苯甲酰胺對(duì)非靶標(biāo)昆蟲的亞致死或致死效應(yīng)。氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量抑制非靶標(biāo)昆蟲褐飛虱種群增長，抑制梨小食心蟲的種群繁殖，對(duì)二化螟取食消化等方面營養(yǎng)指標(biāo)有負(fù)面影響。有研究表明，氯蟲苯甲酰胺亞致死劑量對(duì)褐飛虱表現(xiàn)出顯著影響，但田間推薦劑量對(duì)其沒有顯著影響。氯蟲苯甲酰胺低致死劑量干擾溝金針蟲幼蟲對(duì)食物的消耗與利用能力，具有較高的殺蟲活性。沈櫟陽等認(rèn)為在稻田施用氯蟲苯甲酰胺不會(huì)對(duì)寄生類天敵種群產(chǎn)生不利影響。而陳吉祥等認(rèn)為氯蟲苯甲酰胺對(duì)環(huán)境生物存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。本研究中廣雙瘤蚜繭蜂接觸到田間推薦劑量的氯蟲苯甲酰胺后F0和F1代的存活時(shí)間顯著縮短，而其親代存活率略有增加可能是藥劑暴露后，昆蟲機(jī)體為了應(yīng)對(duì)藥劑壓力而進(jìn)行的生理調(diào)整。值得一提的是，雖然氯蟲苯甲酰胺暴露處理組和對(duì)照組廣雙瘤蚜繭蜂的存活率沒有顯著差異，但與親代存活率相比F1代的存活率呈現(xiàn)下降趨勢，表明在田間按推薦劑量施用氯蟲苯甲酰胺對(duì)天敵昆蟲的后代存在一定的威脅。

結(jié)合16S rDNA分析結(jié)果，氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量暴露th后寄生蜂體內(nèi)微生物群落豐富度低于未接觸藥劑處理；隨著接觸暴露時(shí)間的延長，CAP暴露3d后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)微生物群落豐富度高于未接觸CAP處理。在門水平上，廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)微生物以變形菌門為共有優(yōu)勢菌門。研究表明變形菌門是維持昆蟲生長發(fā)育的關(guān)鍵，在昆蟲體內(nèi)作為優(yōu)勢菌門具有高度一致性，中華蜜蜂A-pis cerana cerana Fabricius的優(yōu)勢菌門也為變形菌門，廣雙瘤蚜繭蜂的優(yōu)勢菌門為變形菌門．與之前的研究報(bào)告一致。

基于屬水平分析，氯蟲苯甲酰胺田間推薦劑量處理th的寄生蜂共生菌優(yōu)勢菌屬為沙雷氏菌屬，菌屬的相對(duì)豐度無明顯變化；隨著寄生蜂齡期的改變和暴露時(shí)間的延長，CAP暴露延長至3d時(shí)，和對(duì)照相比沙雷氏菌屬的相對(duì)豐度增加，但紅球菌屬的相對(duì)豐度顯著降低。沙雷氏菌屬于變形菌門腸桿菌科，研究表明其能夠殺死發(fā)育著的阿爾蚜繭蜂幼蟲，從而提高宿主對(duì)寄生蜂的抵御能力。沙雷氏菌屬普遍具有溶血活性，且沙雷氏菌分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物通過改變脂酶、蛋白酶等生物化學(xué)物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)抗細(xì)菌、真菌和瘧原蟲等。研究表明紅球菌屬廣泛存在于昆蟲體內(nèi)，和昆蟲的生長發(fā)育、消化和免疫息息相關(guān)。在本試驗(yàn)中CAP暴露后廣雙瘤蚜繭蜂體內(nèi)關(guān)鍵菌屬相對(duì)豐度的變化，可能是引起其存活率和存活時(shí)間改變的原因。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，當(dāng)廣雙瘤蚜繭蜂接觸氯蟲苯甲酰胺田推薦劑量（66.7mg/L）暴露后，廣雙瘤蚜繭蜂的親代和子代的生存能力均受到了潛在的負(fù)面影響。通過16SrDNA分析結(jié)果表明，氯蟲苯甲酰胺對(duì)微生物群落的影響具有時(shí)間依賴性，短期暴露可能導(dǎo)致菌屬的相對(duì)豐度普遍下降，而長期暴露則可能導(dǎo)致特定菌屬的耐受性增加和敏感菌屬的減少。延長接觸時(shí)間會(huì)改變寄生蜂體內(nèi)微生物的組成，同時(shí)可能會(huì)通過改變微生物的組成結(jié)構(gòu)而直接或間接影響廣雙瘤蚜繭蜂的存活率和存活時(shí)間。這是首次報(bào)道氯蟲苯甲酰胺能夠跨代影響非靶標(biāo)天敵昆蟲的安全性，表明氯蟲苯甲酰胺暴露可能對(duì)寄生性天敵產(chǎn)生意外的風(fēng)險(xiǎn)。因此，我們建議加強(qiáng)對(duì)氯蟲苯甲酰胺施用管理，以避免其可能引發(fā)的環(huán)境毒性問題以及對(duì)有益天敵的威脅。