關鍵詞短頸劍線蟲；寄主；無花果；形態(tài)特征；系統(tǒng)發(fā)育分析；鑒定

短頸劍線蟲是一種寄生于植物根部的線蟲，寄主廣泛、適應力強，可危害羅漢松、雞蛋花、秋楓、大葉相思、羊蹄甲、冬青、棕櫚、咖啡、番茄、櫻桃、草莓、懸鉤子、柑橘、龍眼、蘋果、梨、腰果、石榴等。該線蟲為外寄生線蟲，通過直接取食為害植物根系，造成植物根部組織變黑、皮層增厚、側(cè)根增生，影響根系長勢，甚至造成根部腫大或壞死，同時它能傳播檢疫性病毒——番茄環(huán)斑病毒（tomato ringspot virus，ToRSV）。短頸劍線蟲不僅可以寄生植物，有記載表明該線蟲還可以在人體寄生并造成嚴重的腹痛、腹瀉。短頸劍線蟲主要分布于歐洲、美洲、亞洲部分國家和地區(qū)，通過帶根苗木、土壤及栽培介質(zhì)傳播擴散，為我國重要的檢疫性線蟲。目前尚無公開文獻報道無花果為該線蟲自然寄主。

1961年，Lordello等在巴西咖啡樹根際首次發(fā)現(xiàn)短頸劍線蟲，并對其形態(tài)進行了較為簡單的描述；隨著劍線蟲屬內(nèi)有效種數(shù)量逐漸增多，該線蟲原始種群的形態(tài)學描述已不足以對其進行有效區(qū)分；Lamberti等于1991年對短頸劍線蟲巴西咖啡種群進行了更為詳細的描述。2011年，Sakai等首次在日本千葉縣冬青上發(fā)現(xiàn)短頸劍線蟲，2012年趙立榮等在日本進境羅漢松中檢出短頸劍線蟲。2023年5月，青島海關從日本進境無花果苗中分離獲得一種劍線蟲，通過形態(tài)特征觀察和測計，并對18S rDNA、ITSI、28S-D2D3、線粒體coxI基因進行擴增、測序及系統(tǒng)進化分析，鑒定為短頸劍線蟲?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1材料與方法

1.1樣品的采集和線蟲的分離

采集無花果苗根部及根際附著土壤，用改進的貝爾曼漏斗法分離線蟲。

1.2線蟲形態(tài)鑒定

分離獲得的線蟲經(jīng)60～62℃水浴處理2～3min殺死后，用FG固定液固定。采用甘油一乙醇快速脫水法對線蟲脫水，將脫水線蟲挑人甘油滴中，用石蠟封片，做成永久玻片。在光學顯微鏡（Zeiss Imager M2）下進行形態(tài)觀察、拍照（Zeiss AxioCam 506 color CCDcamera）及測量（Zeiss ZEN 2.3 blue edition）。采用De Man公式進行形態(tài)特征測計。

1.3分子生物學鑒定

1.3.1線蟲DNA提取

單條線蟲DNA提取參照王江嶺等的方法并有所改進。挑取單條線蟲用適量無菌水清洗后，放入預先滴加了的PCR管中，加入4PCR緩沖液（Mg2+ free）后用滅菌的移液槍槍頭將蟲體壓成段，于-70℃下冷凍30min以上，85℃加熱2min后加入2uL的蛋白酶K，混勻后置于PCR儀中56℃孵育2h，95℃ 10min，即獲得線蟲DNA粗提液，可直接用于PCR擴增，或保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2靶標片段擴增和測序

使用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳分離，在120V的恒壓條件下電泳約30min，電泳結(jié)果在紫外凝膠成像儀下觀察并照相。將片段割膠純化、回收，連接到pESI-T載體后轉(zhuǎn)人大腸桿菌（DH5a）中培養(yǎng)，篩選陽性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.3系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用Chromas軟件對測序結(jié)果的峰圖質(zhì)量進行檢查，確保該序列可用于后續(xù)分析。下載Gen-Bank中相關線蟲屬種的28S-D2/D3、ITSI、18S rD-NA以及coxI序列信息，用MAFFT v7. 505軟件進行多序列聯(lián)配比對，去除前后端多余的引物序列后，即可得到用于后續(xù)系統(tǒng)進化分析的序列比對文件。使用jModeITest V.2.1.7軟件中的Akaike information criterion（AIC）程序計算獲得序列比對文件的最佳核苷酸替換模型、各種核苷酸頻率、不變位點比例以及伽馬分布的形態(tài)參數(shù)等。使用MrBayes 3.2.7軟件，在貝葉斯框架下通過馬爾科夫鏈蒙特卡洛方法（MCMC）構(gòu)建最佳核苷酸替換模型下的50%多數(shù)原則一致性系統(tǒng)進化樹，用于后續(xù)的物種系統(tǒng)發(fā)育分析。在系統(tǒng)進化樹中顯示后驗概率大于50%的進化分支，本研究所獲得的新序列在進化樹中均用粗體表示。

2結(jié)果與分析

2.1短頸劍線蟲的形態(tài)鑒定

本研究在分離到的劍線蟲中選取發(fā)育成熟、特征清晰的10條線蟲進行形態(tài)特征描述和測計。

雌蟲形態(tài)特征：熱殺死后蟲體向腹面彎曲呈開螺旋“C”形，兩端漸細（圖1A）。唇區(qū)圓，縊縮明顯（圖1C），側(cè)器囊漏斗狀（圖1D）。齒尖針細長、針狀、高度硬化，齒尖針基部呈叉狀，齒托基部呈顯著的凸緣狀；齒針導環(huán)為雙環(huán)，后環(huán)高度骨化，導環(huán)位于齒尖針后部靠近齒尖針與齒托相連接處（圖1B、1E）。生殖管對生，均發(fā)育完全，生殖管較短，卵巢先端回折（圖1F）。陰門位于蟲體中部，橫裂，占陰門處體寬的1/3左右，子宮內(nèi)無特殊分化（圖1G）。尾短圓錐形，背面彎曲，腹面直，尾長等于或略長于肛門處體寬（圖1H）。

雄蟲：未見。

短頸劍線蟲形態(tài)測計值見表2。根據(jù)Lamberti等的多歧檢索表，短頸劍線蟲主要鑒定特征為：唇區(qū)與體壁是否縊縮（代碼A）、體長（代碼B）、齒尖針長度（代碼C）、c'值（代碼D）、V值（代碼E）、a值（代碼F）、c值（代碼G）、體前端至基部導環(huán)距離（代碼H）、尾長（代碼I）、尾末端形狀（代碼J），巴西咖啡種群的鑒定代碼依次為A2-B3/2-C3/2-DI-E2/3/1-F1-G2-H3-12/1-J2，日本冬青種群的鑒定代碼依次為A2-B2/3-C2-D1-E1/2-F1-G2-H2/3-I2/3-J2，截獲的日本無花果種群代碼依次為A2-B2-C2-D1/2-E1/2-F1-G2-H2/3-I1/2-J2。對比鑒定代碼發(fā)現(xiàn)，本研究種群的鑒定代碼與巴西咖啡種群、日本冬青種群基本一致。對比巴西咖啡種群，本研究種群在體長、齒尖針長度、V值、體前端至基部導環(huán)距離略小，但總體在覆蓋范圍內(nèi)，這可能是由于不同地區(qū)分布的種群間存在差異所致；對比日本冬青種群，除了齒尖針長度略短之外，其他鑒定特征描述和測計值更為接近，初步判斷該日本無花果種群為短頸劍線蟲。

2.2分子生物學特征

從短頸劍線蟲的18S rDNA擴增出1750 bp的片段（GenBank登錄號：OR267443、OR277456、OR277459）。在NCBI上進行BLAST比對，本研究獲得的序列與短頸劍線蟲日本冬青種群（登錄號為AB604340）、巴西種群（登錄號為MH248799）、捷克種群（登錄號為HM163212）序列相似性為100%，與短頸劍線蟲巴西種群（登錄號為AY297822）、（登錄號為AF036610）、（登錄號分別為AY297832、AM086674）、（登錄號為AY297835）序列相似性為99.54%～99.94%。序列相似性分析結(jié)果表明：本研究無花果種群與短頸劍線蟲親緣關系相對較近，但與上述非短頸劍線蟲種群差異并不明顯。從基于18SrDNA序列構(gòu)建的短頸劍線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）中可以看出：本研究無花果種群與短頸劍線蟲2個巴西種群、捷克種群、日本種群聚類在1個單獨分支，后驗概率值為95。

COXI區(qū)擴增出441 bp的片段（GenBank登錄號：OR144368、OR742039、OR742053）。本研究獲得的序列與5個日本種群（登錄號分別為AB675672、AB675673、AB675669、AB604337、AB675670）序列相似性為91.60%～93. 64%，與彌散劍線蟲澳大利亞種群（登錄號為AM086700）序列相似性為92.27%。序列相似性分析結(jié)果表示：本研究無花果種群與短頸劍線蟲、彌散劍線蟲親緣關系較近。從基于COXI序列構(gòu)建的短頸劍線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）中可以看出：本研究無花果種群與短頸劍線蟲（5個日本種群）、彌散劍線蟲（澳大利亞種群）聚類在1個單獨分支，后驗概率值為100。

綜合形態(tài)學鑒定和分子特征分析結(jié)果，本研究中日本無花果線蟲種群鑒定為短頸劍線蟲。

3結(jié)論與討論

我國《進境植物檢疫性有害生物名錄》規(guī)定劍線蟲屬（傳毒種類）為檢疫性線蟲，其中包含短頸劍線蟲等11種可傳播植物病毒的線蟲。本研究采用形態(tài)學鑒定和18SrDNA、ITSI、28S-D2/D3、線粒體COXI基因擴增、測序及系統(tǒng)進化分析，在一定水平上展示了美洲劍線蟲組內(nèi)各種群間的親緣關系。形態(tài)學測計結(jié)果表明，本研究種群與日本冬青種群更為接近，但二者在體長、齒尖針長度、V值、體前端至基部導環(huán)距離均略小于模式種群，這可能是由于地理分布差異造成的，其他形態(tài)特征均與模式種群的描述基本相符。綜合形態(tài)特征與系統(tǒng)進化分析結(jié)果，本研究中在無花果苗根際分離到的線蟲為短頸劍線蟲，并首次確認了無花果為短頸劍線蟲自然寄主。因此在進境無花果苗檢疫時，應重點關注此類線蟲的傳人風險。

劍線蟲屬有效種數(shù)量多，種內(nèi)差異較小，鑒定特征有限且部分種形態(tài)測計值重疊，口岸檢疫鑒定難度較大，需要綜合形態(tài)學和分子生物學方法進行鑒定。Lazarova等認為劍線蟲屬內(nèi)18S rDNA和28S-D2/D3序列差異太小，難以區(qū)分短頸劍線蟲及近似種，本研究序列相似性比對結(jié)果也印證了這一觀點，即18S rDNA和28S-D2/D3序列無法有效區(qū)分短頸劍線蟲及其近似種。線粒體cox工序列分析可以較為準確區(qū)分劍線蟲屬內(nèi)各種，但該基因序列不夠豐富，需進一步累積和完善。在口岸檢疫工作中，使用多種引物對線蟲進行物種鑒定的方法相對繁瑣和費時，為提高檢疫時效性，針對劍線蟲屬線蟲的鑒定需要更加高效、靈敏、準確的分子生物學檢測方法，這也是口岸檢疫鑒定中迫切需要解決的技術(shù)難題。