曾思雨,杜 磊,邢怡橋

自噬維持細胞內(nèi)成分降解和再循環(huán)的穩(wěn)態(tài),是一種關(guān)鍵的細胞質(zhì)量控制機制。在應(yīng)激反應(yīng)中,自噬促進細胞成分的降解,以提供細胞代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)和能量。視網(wǎng)膜是眼睛中轉(zhuǎn)導(dǎo)和處理視覺信息的光敏組織,對物質(zhì)和能量需求極高,基礎(chǔ)水平的自噬對維持視網(wǎng)膜細胞的穩(wěn)態(tài)和視覺系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要。本文總結(jié)了自噬途徑參與青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良和視網(wǎng)膜脫離等眼科疾病的最新研究,為未來通過調(diào)控自噬治療眼部疾病提供理論依據(jù)。

?KEYWORDS：autophagy; retina; retinal ganglion cells; photoreceptor

0 引言

自噬是一種介導(dǎo)細胞內(nèi)成分降解和再循環(huán)的分解代謝途徑,將受損和衰老的細胞器和病原體等有害成分運送到溶酶體中清除[1]。根據(jù)待降解物質(zhì)轉(zhuǎn)運到溶酶體的方式,自噬分為3種類型:(1)巨自噬:雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)包裹蛋白質(zhì)和細胞器形成自噬體,自噬體隨后與溶酶體融合,在溶酶體水解酶的作用下進行消化和降解;(2)分子伴侶介導(dǎo)的自噬:一種僅存在于哺乳動物細胞中的選擇性降解物質(zhì)途徑,通過Hsc70伴侶蛋白識別特異性表達KFERQ氨基酸序列的靶蛋白;(3)微自噬:待降解物質(zhì)通過溶酶體或內(nèi)體膜內(nèi)陷進入溶酶體[2-4]。

自噬發(fā)生在所有類型的細胞和組織中,正常生理狀態(tài)下處于低水平狀態(tài),有利于物質(zhì)循環(huán)、能量交換和信息傳遞,對維持生物體的穩(wěn)態(tài)起核心作用[5]。然而,自噬也可以被饑餓、缺氧和感染等應(yīng)激原誘導(dǎo),在這種情況下,自噬介導(dǎo)細胞成分的降解,以產(chǎn)生維持細胞代謝所需的能量和營養(yǎng)物質(zhì)[6]。此外,自噬是細胞內(nèi)主要的質(zhì)量控制途徑之一,主要降解錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)和受損細胞器[7]。因此,自噬的缺陷和失調(diào)會破壞機體的平衡狀態(tài),導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生,例如癌癥、免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病等[8-9]。

1 自噬過程的調(diào)控

目前研究最多的巨自噬是一個受到嚴密調(diào)控的多步驟過程,上游調(diào)節(jié)因子雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)以相反的方式調(diào)控自噬整個過程[6]。自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes, ATGs)家族成員參與調(diào)節(jié)自噬的各個階段,轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB, TFEB)是ATGs的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[10-11]。在靜息狀態(tài)下,磷酸化TFEB定位于細胞質(zhì),而當饑餓、感染等應(yīng)激發(fā)生時,TFEB去磷酸化并轉(zhuǎn)位到細胞核中,可直接與啟動子序列結(jié)合,增強ATGs和溶酶體相關(guān)基因的表達[12]。此外,叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box O, FOXO)也是重要的自噬調(diào)節(jié)因子,在應(yīng)激的誘導(dǎo)下FOXO與啟動子區(qū)結(jié)合,激活自噬基因的表達[8]。而He等[13]的研究表明FOXO的功能可能獨立于轉(zhuǎn)錄調(diào)控,通過與細胞質(zhì)中的ATGs直接相互作用來調(diào)節(jié)自噬。最近一項研究表明,FOXO可以與TFEB形成復(fù)合物,作為組合轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)節(jié)靶基因的表達[14]。

自噬過程包括誘導(dǎo)、起始、自噬前體形成、自噬體形成、與溶酶體融合和降解。(1)Unc51樣激酶(unc51-like kinase, ULK)復(fù)合體在自噬的啟動中起核心控制作用,由ULK1、ATG13、ATG101和200kD的FLK家族相互作用蛋白(FLK family interacting protein of 200kD, FIP200)組成[15]。自噬啟動激酶ULK1在應(yīng)激誘導(dǎo)下磷酸化激活,特異性地積累到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,與液泡分選蛋白15(vacuolar protein sorting, VPS15)、ATG14L和Beclin-1相互作用,增強VPS34復(fù)合物的募集[16]。隨后,活性的VPS34復(fù)合物作為Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)產(chǎn)生磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate, PI3P),促進ATGs的募集,從而啟動自噬前體形成[11]。(2)自噬體膜延伸是自噬體形成的關(guān)鍵步驟,涉及兩種由ATG7催化的泛素化反應(yīng),一種是形成自噬延伸復(fù)合物ATG5-12/16L1,另一種是微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅰ(microtubule-associated protein light chain3-Ⅰ, LC3-Ⅰ)與磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)偶聯(lián)形成自噬標志物LC3-Ⅱ,允許自噬體膜延伸閉合至成熟。(3)自噬體最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體,自噬溶酶體中的貨物被溶酶體酶降解得以循環(huán)利用[17-18]。最新研究表明,自噬實際上是一個具有高度選擇性的過程,自噬體靶向降解特定的細胞器和細胞質(zhì)成分[19]。在選擇性自噬中,自噬受體的典型特征是含有LC3結(jié)合區(qū)域(LC3-interacting regions, LIRs),LIRs通過與LC3相互作用將泛素化的貨物連接到自噬體膜,進行溶酶體降解[19]。

2 視網(wǎng)膜自噬

視網(wǎng)膜具有非常高的物質(zhì)和能量需求,用于維持神經(jīng)傳遞、光傳導(dǎo)和正常細胞功能所需的神經(jīng)元興奮性,高水平的基礎(chǔ)自噬對于視覺系統(tǒng)至關(guān)重要,自噬水平的降低會影響細胞代謝產(chǎn)物合成,減弱視網(wǎng)膜細胞對應(yīng)激的調(diào)節(jié)能力[20-22]。自噬缺陷動物模型的建立有助于深入探索自噬在各種組織中的作用,研究發(fā)現(xiàn)ATG4B缺陷的小鼠視網(wǎng)膜顯示LC3脂化水平降低和p62表達增多,證實視網(wǎng)膜基礎(chǔ)自噬水平降低[23-24]。此外,缺乏ATG5的視網(wǎng)膜在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells, RGCs)分化減少和軸突發(fā)育缺陷[25]。然而,最新研究發(fā)現(xiàn),在病理情況下,過度激活的自噬可能會對神經(jīng)元細胞產(chǎn)生毒性作用,誘導(dǎo)細胞凋亡,同時由于RGCs軸突部位線粒體降解增加,最終導(dǎo)致神經(jīng)變性[26-27]。這些結(jié)果表明視網(wǎng)膜依賴基礎(chǔ)自噬維持正常的結(jié)構(gòu)和生理功能,任何自噬缺陷或失調(diào)都會破壞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),參與各種視網(wǎng)膜和眼部疾病的發(fā)生[28]。

3 自噬與眼部疾病

3.1青光眼青光眼是一種以RGCs不可逆丟失為特征的神經(jīng)退行性疾病,目前已成為世界上第二大致盲因素[29]。RGCs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中將視網(wǎng)膜視覺信息傳遞到大腦的神經(jīng)元,由于RGCs的不可替代性,通過有效的手段來逆轉(zhuǎn)RGCs損傷和視神經(jīng)萎縮至關(guān)重要[30-31]。利用小鼠視神經(jīng)橫斷模型,首次在體內(nèi)證實自噬對RGCs的保護作用,Rodríguez-Muela等[24]發(fā)現(xiàn)雷帕霉素誘導(dǎo)自噬使RGCs數(shù)量增加了40%,而特異性敲除小鼠ATG5基因后,RGCs存活率下降33%。最近一項研究發(fā)現(xiàn),在自噬缺陷的情況下,Ambra1+/gt小鼠RGCs對視神經(jīng)鉗夾損傷的易感性隨著年齡的增長而增加,表明自噬激活具有神經(jīng)保護作用[32]。

眼壓是青光眼發(fā)展的重要危險因素,由房水循環(huán)系統(tǒng)調(diào)節(jié),而小梁網(wǎng)作為房水的主要流出途徑,負責維持正常的眼壓水平,既往研究證實青光眼中存在小梁網(wǎng)的自噬失調(diào)[33-34]。Nettesheim等[35]的研究發(fā)現(xiàn),沉默ATG5和ATG7促進了轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)誘導(dǎo)的小梁網(wǎng)纖維化,導(dǎo)致房水外流減少,眼壓升高。而Zhu等[36]證明雷帕霉素可通過激活自噬減輕糖皮質(zhì)激素引起的眼壓升高、小梁網(wǎng)細胞超微結(jié)構(gòu)改變和RGCs損傷。此外,在激光光凝誘導(dǎo)鞏膜外流道損傷模型中,Ⅲ型PI3K抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)使自噬流受阻,加重了高眼壓引起的軸突變性,相反,雷帕霉素表現(xiàn)出明顯的視神經(jīng)軸突保護作用[37]。因此,自噬調(diào)節(jié)可能成為改善青光眼RGCs變性的新治療靶點。

目前已經(jīng)在多種不同的青光眼模型中證實氧化應(yīng)激水平的增加,線粒體是細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要來源,高眼壓誘導(dǎo)線粒體裂變以及視網(wǎng)膜缺血均會刺激ROS的產(chǎn)生,過量的ROS對DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成損傷,而RGCs由于耗氧量大對氧化損傷尤其敏感[21,38]。研究發(fā)現(xiàn),自噬缺陷動物的細胞ROS水平升高,可能是由于自噬受損導(dǎo)致氧化細胞產(chǎn)物的清除障礙,通過誘導(dǎo)自噬減少氧化應(yīng)激損傷可能是青光眼治療的理想選擇[39]。

3.2年齡相關(guān)性黃斑變性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)是一種累及黃斑的神經(jīng)退行性視網(wǎng)膜病變,視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigmented epithelium, RPE)變性是ARMD的早期病理標志[40]。RPE細胞負責吞噬、降解和回收在視覺循環(huán)中脫落的光感受器外節(jié)(photoreceptor outer segments, POSs),維持光感受器的穩(wěn)態(tài),而既往研究證實RPE細胞中ATG5的缺陷會損害RPE細胞降解POSs的能力[5,41]。隨著時間的推移,未完全消化的POSs成分在RPE細胞溶酶體中逐漸積累,稱為脂褐素[42]。脂褐素是一種衰老的生物標志物,主要成分是N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺(N-retinyl-N-retinylidene ethanolamine, A2E),抑制溶酶體水解酶活性的同時阻止其降解,對溶酶體功能造成障礙,所有ARMD相關(guān)事件中都可以觀察到自噬流和POSs降解的阻斷[20,43]。此外,研究發(fā)現(xiàn)衰老與自噬活性的下調(diào)密切相關(guān),證實自噬受損參與ARMD的病程進展,自噬流障礙引起的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡是神經(jīng)退行性變的發(fā)病機制之一,提示刺激自噬可作為ARMD潛在的治療手段[16]。

目前,ARMD的大多數(shù)研究使用的是ARPE-19細胞系,ARPE-19細胞表達特征性的RPE標記物[44-46]。最近,Fernandez-Godino等[47]通過基因編輯使ARPE-19細胞突變產(chǎn)生異常的細胞外基質(zhì),激活RPE細胞補體系統(tǒng),形成基底沉積物。研究發(fā)現(xiàn),使用A2E培養(yǎng)RPE細胞在早期誘導(dǎo)自噬,雷帕霉素通過mTOR通路增強自噬,改善A2E引起的細胞死亡,減少炎性因子和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)生成,發(fā)揮保護作用[48]。另外,Sun等[49]的實驗結(jié)果表明,谷胱甘肽耗竭誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激升高RPE細胞自噬流水平,并引起衰老相關(guān)基因的表達增加,而雷帕霉素通過刺激自噬顯著改善細胞早衰,抑制自噬則產(chǎn)生相反的結(jié)果。Chan等[50]也報道了使用3-MA抑制自噬后,碘酸鈉誘導(dǎo)的RPE細胞死亡和視網(wǎng)膜變性加重,表明自噬在ARMD早期階段保護RPE細胞抵抗氧化應(yīng)激損傷,并為ARMD的靶向治療提供了新的思路。

3.3糖尿病視網(wǎng)膜病變糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常見的眼部微血管并發(fā)癥,長期的高血糖誘發(fā)視網(wǎng)膜早期炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙和氧化損傷,周細胞丟失是DR早期標志之一[51-53]。自噬在DR中的作用具有雙重性,早期DR中的自噬反應(yīng)一般由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo),促進周細胞存活和受損蛋白的降解,然而當處于長時間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時,自噬加重周細胞死亡[54]。此外,血管外氧化和糖基化修飾的脂蛋白進入視網(wǎng)膜后表現(xiàn)出顯著的細胞毒性,抑制細胞活性,加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的RPE損傷[55]。最近一項實驗發(fā)現(xiàn)暴露于高糖條件下的ARPE-19細胞自噬激活,使用3-MA抑制自噬后,細胞活性顯著下降,促進ROS積累和炎癥因子白細胞介素-1β(interleukin 1β, IL-1β)的分泌,并激活NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體,提示自噬在DR中的細胞保護作用,可能成為預(yù)防DR發(fā)展和進展的治療靶點[56]。

目前,越來越多的報道強調(diào)了視神經(jīng)變性在DR早期階段的重要性[20,52]。Amato等[57]發(fā)現(xiàn)用高糖處理的小鼠視網(wǎng)膜外植體中,神經(jīng)元細胞凋亡顯著增加,同時自噬通量顯著降低,奧曲肽通過抑制mTOR通路激活自噬,改善細胞凋亡,而用氯喹阻斷自噬后則消除了奧曲肽的抗凋亡作用,表明自噬和細胞凋亡之間的平衡對神經(jīng)元存活十分重要。Park等[58]也報道在DR中AMPK通路上調(diào)誘導(dǎo)的自噬促進RGCs的存活,而抑制自噬RGCs凋亡顯著增加。上述研究證實激活A(yù)MPK和抑制mTOR誘導(dǎo)自噬通量可以顯著改善視網(wǎng)膜變性,在DR中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

3.4視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良是一組遺傳異質(zhì)性視網(wǎng)膜疾病,主要由于光感受器功能障礙和死亡而導(dǎo)致不可逆的視力喪失[59]。視網(wǎng)膜色素變性是最常見的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良,其特征是早期階段視桿細胞的進行性變性。導(dǎo)致各種炎癥因子以及ROS的釋放,改變光感受器穩(wěn)態(tài),進而影響視錐細胞的存活[60]。

既往研究證實,適當?shù)淖允墒蔷S持光感受器穩(wěn)態(tài)所必需的,自噬缺陷引起視紫紅質(zhì)和轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在細胞內(nèi)的異常積累,導(dǎo)致光感受器死亡[61-62]。rd10小鼠是一種廣泛使用的視網(wǎng)膜色素變性模型,由于磷酸二酯酶β亞基突變導(dǎo)致酶功能異常,環(huán)鳥甘酸水平升高,引發(fā)視桿細胞變性和繼發(fā)性視錐細胞死亡[63]。Yang等[64]發(fā)現(xiàn)敲除Sigma-1受體的rd10小鼠早期激活視網(wǎng)膜自噬,保護視桿細胞免受損傷,隨著視桿細胞死亡加劇,細胞內(nèi)Ca2+大量積累誘導(dǎo)細胞凋亡,自噬流減少,引起壞死性凋亡和視錐細胞死亡。然而,過度激活的自噬在某些情況下可能會加劇光感受器變性,相反,適當阻斷自噬促進蛋白酶體的激活,加速錯誤折疊的視紫紅質(zhì)降解,促進光感受器存活[65]。上述研究表明自噬對于視桿細胞和視錐細胞的存活十分重要,未來可能成為光感受器退行性病變的治療靶點。

3.5視網(wǎng)膜脫離視網(wǎng)膜脫離是指神經(jīng)上皮層與RPE的分離,由于光感受器失去RPE的營養(yǎng)供給和代謝支持,引起光感受器缺氧、營養(yǎng)剝奪和細胞死亡[66]。視網(wǎng)膜脫離早期誘導(dǎo)光感受器細胞自噬的激活,阻斷自噬后光感受器細胞凋亡增加,隨著脫離的時間延長,自噬通量降低,光感受器細胞由存活轉(zhuǎn)變?yōu)樗劳鯷67]。Xiao等[68]也發(fā)現(xiàn)ATG5基因敲除小鼠視網(wǎng)膜脫離后視桿細胞凋亡和程序性壞死增加,自噬促進光感受器內(nèi)蛋白質(zhì)的降解,抵抗其細胞毒性作用。此外,Ding等[69]的實驗證實雷帕霉素自噬在視網(wǎng)膜脫離過程對光感受器細胞具有明顯的保護作用,自噬的激活抑制ROS生成和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放,減少光感受器細胞發(fā)生壞死性凋亡。因此,誘導(dǎo)自噬延長光感受器的存活時間是視網(wǎng)膜脫離的關(guān)鍵治療策略。

4 小結(jié)

本文總結(jié)了自噬在視網(wǎng)膜和眼部疾病中的重要作用,視網(wǎng)膜依賴基礎(chǔ)自噬維持正常的結(jié)構(gòu)和生理功能,任何自噬缺陷或失調(diào)都會破壞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),因此,自噬-溶酶體途徑的改變與許多常見的眼部疾病高度相關(guān),自噬在病理情況下主要用于維持RGCs和軸突的穩(wěn)態(tài),并促進POSs降解和視覺循環(huán)以保護光感受器和視網(wǎng)膜功能,然而,過度激活的自噬也可能會產(chǎn)生有害作用。促進自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和增強溶酶體活性有望用于治療眼部疾病和其他神經(jīng)退行性疾病,在特定條件下,一些自噬誘導(dǎo)劑已被證實可以顯著抑制眼部疾病的進展,減輕視力喪失。然而,由于自噬在不同疾病類型和階段的作用機制可能不同,未來需要更多的研究了解自噬是如何特異性調(diào)節(jié)各種視網(wǎng)膜細胞。綜上所述,通過調(diào)控自噬治療眼部疾病已成為一種可行的思路,進一步的研究有助于我們了解以自噬和溶酶體途徑為靶點的治療策略在臨床應(yīng)用中的潛力。