★ 余良昆 李勇 鐘發(fā)明 龍世杰 熊朋朋 劉欣 徐王兵（.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱一科 南昌 330006）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是由多種因素引起的慢性疾病，其特征是骨量下降和骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加［1-2］。隨著人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率也在逐年上升［3］。在世界范圍內(nèi)，每3 s 就會(huì)發(fā)生一起骨質(zhì)疏松性骨折，這不僅給病人帶來(lái)痛苦，也給社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［4］。

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素［5-6］。雌激素缺乏和衰老都可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，過(guò)量的ROS 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 損害，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7-8］。此外，ROS 會(huì)減少成骨細(xì)胞形成，提高破骨細(xì)胞骨吸收水平［9］。臨床上，一些抗氧化劑如維生素E、維生素C 和乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）已被用作骨質(zhì)疏松癥的替代治療劑，并取得了可觀的治療效果［10-11］。

槲皮素在植物界分布廣泛，是具有多種生物活性的黃酮醇類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗凋亡和抗骨質(zhì)疏松的作用［12-13］。槲皮素能夠直接清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。有研究表明，槲皮素能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，抑制破骨細(xì)胞的形成［14］。這些證據(jù)表明，槲皮素對(duì)維持骨穩(wěn)態(tài)具有積極作用，然而槲皮素對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的MC3T3-E1 細(xì)胞的保護(hù)作用及分子機(jī)制尚未明確。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型，探討槲皮素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的保護(hù)作用及潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

槲皮素（純度＞98%，CAS：117-39-5），購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；3%過(guò)氧化氫溶液（hydrogen peroxide，H2O2）、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松購(gòu)自德國(guó)默克公司；胎牛血清、MEMα培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛生物公司；青霉素、鏈霉素購(gòu)自?？寺∩锕?；CCK-8 試劑盒、總SOD 活性檢測(cè)試劑盒、MDA 檢測(cè)試劑盒、堿性磷酸酶染色試劑盒、堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物公司；茜素紅S 染色溶液購(gòu)自賽業(yè)生物公司；引物合成由北京擎科生物公司完成；一抗Runx2、Osterix、Nrf2、HO-1、β-actin 購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；Bax、Bcl-2、Caspase3 購(gòu)自Affintiy 公司；二抗購(gòu)自Affintiy 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠胚胎成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%抗生素的MEMα 培養(yǎng)基中，細(xì)胞每2 d 更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。P3-P6 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MC3T3-E1 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的構(gòu)建及藥物干預(yù)

本研究使用200 μmol/L H2O2干預(yù)細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型［15］，細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組（200 μmol/L H2O2）、低濃度組（200 μmol/L H2O2+2.5 μmol/L 槲皮素）、高濃度組（200 μmol/L H2O2+5 μmol/L 槲皮素）。

1.4 MC3T3-E1 細(xì)胞增殖檢測(cè)

將細(xì)胞接種到96 孔板（每孔3×103個(gè)細(xì)胞）中，細(xì)胞貼壁后，在含或不含H2O2的培養(yǎng)基中加入不同濃度的槲皮素（0，1，2.5，5，10，20，40 μmol/L）干預(yù)24 h，干預(yù)結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光值。

1.5 MC3T3-E1 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)及ALP、ARS 染色

將細(xì)胞接種到12 孔板（每孔1×105個(gè)細(xì)胞）中，細(xì)胞貼壁后分組干預(yù)并使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（地塞米松：10 nmol/L，維生素C：50 μg /mL，β-甘油磷酸鈉：10 mmol/L）進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。細(xì)胞分為單純成骨誘導(dǎo)組（對(duì)照組）、成骨誘導(dǎo)+200 μmol/L H2O2組（模型組）、低濃度組（成骨誘導(dǎo)+200 μmol/L H2O2+2.5 μmol/L 槲皮素）、高濃度組（成骨誘導(dǎo)+200 μmol/L H2O2+5 μmol/L 槲皮素），細(xì)胞每3 d更換一次培養(yǎng)基。成骨誘導(dǎo)7 d 后進(jìn)行ALP 染色，使用PBS 清洗細(xì)胞3 遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 遍后進(jìn)行ALP 染色。成骨誘導(dǎo)14 d 后進(jìn)行ARS 染色，使用PBS 清洗細(xì)胞3 遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 遍后進(jìn)行ARS 染色。

1.6 細(xì)胞內(nèi)總SOD 含量檢測(cè)

將細(xì)胞接種到 6 孔板（每孔3×105個(gè)細(xì)胞）中，細(xì)胞貼壁后按上述分組干預(yù)細(xì)胞24 h。干預(yù)結(jié)束后收集各組細(xì)胞樣品，按照SOD 活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置工作液，37 ℃孵育30 min 后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞樣品的SOD 活性。

1.7 細(xì)胞內(nèi)總MDA 含量檢測(cè)

細(xì)胞干預(yù)如前所述，干預(yù)結(jié)束后收集各組細(xì)胞樣品，按照MDA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置工作液，與樣品混勻后100 ℃加熱15 min，水浴冷卻至室溫，1 000 g 室溫離心10 min。取200 μL 上清液加入到96 孔板中，隨后用酶標(biāo)儀在532 nm 處測(cè)定吸光度。根基標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞樣品中的MDA含量。

1.8 qRT-PCR

將細(xì)胞以每孔3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔板，干預(yù)方式如前所述，干預(yù)結(jié)束后收集各組細(xì)胞，使用RNA 提取試劑盒提取總RNA，測(cè)量濃度后使用PrimeScript RT reagent 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green 染色法，以各組cDNA 為模板，加入緩沖液、引物后參考說(shuō)明書(shū)采用以下參數(shù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 40 s，共40 個(gè)循環(huán)。以18 s 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)mRNA 表達(dá)量。所有引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.9 Western blot

細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后使用Ripa 裂解液提取總蛋白。使用SDS-PAGE 膠電泳分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜，用5%脫脂牛奶于室溫下封閉 2 h，加入一抗Runx2、Osterix、Nrf2、HO-1、β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase3 在4 ℃孵育12 h，孵育結(jié)束后使用 TBST 清洗3 遍，二抗孵育1.5 h，TBST 清洗3 次后使用凝膠成像儀進(jìn)行顯影。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞活力和增殖的影響

CCK-8 結(jié)果顯示10 μmol/L 以下濃度的槲皮素對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，當(dāng)槲皮素濃度大于20 μmol/L 時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用（P＜0.05），見(jiàn)表2。此外，200 μmol/L H2O2明顯抑制MC3T3-E1 細(xì)胞增殖（P＜0.05），槲皮素（1，2.5，5，10，20 μmol/L）能夠減輕H2O2對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖抑制（P＜0.05），見(jiàn)表3。這說(shuō)明槲皮素對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的MC3T3-E1 細(xì)胞具有保護(hù)作用。結(jié)果可知2.5，5 μmol/L 濃度的槲皮素對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，因此選擇2.5，5 μmol/L 濃度的槲皮素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 槲皮素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響

表3 槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響

2.2 槲皮素對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化功能的影響

通過(guò)比較各組ALP、ARS 染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)200 μmol/L H2O2明顯降低了MC3T3-E1 細(xì)胞的成骨分化能力。見(jiàn)圖1。相比于對(duì)照組，模型組細(xì)胞的ALP 染色顏色更淺；此外，ARS 染色顏色較淺，觀察到的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量也較少。然而，槲皮素組的ALP、ARS 染色顏色較模型組深，ARS 染色觀察到更多的礦化結(jié)節(jié)，表明槲皮素能夠減輕H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化功能障礙。

圖1 ALP、ARS染色評(píng)估槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化功能的影響

2.3 槲皮素對(duì)氧化應(yīng)激的影響

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是一種重要的氧化應(yīng)激物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和H2O2，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA 含量，發(fā)現(xiàn)H2O2干預(yù)后明顯增加了細(xì)胞內(nèi)MDA 含量（P＜0.05），而槲皮素以濃度依賴的方式降低了細(xì)胞內(nèi)MDA 含量。此外，發(fā)現(xiàn)H2O2明顯降低了細(xì)胞內(nèi)SOD 活性，槲皮素干預(yù)后增加了細(xì)胞內(nèi)SOD 活性（P＜0.05），表明槲皮素具有很好的抗氧化作用。見(jiàn)表4。

表4 槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞中MDA、SOD水平的影響

2.4 槲皮素對(duì)成骨分化和凋亡的影響

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，H2O2干預(yù)明顯降低了細(xì)胞中Runx2 和Osterix 的表達(dá)，槲皮素干預(yù)后以劑量依賴方式增加了它們的表達(dá)。此外，H2O2干預(yù)明顯增加了細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase3 的表達(dá)，降低了Bcl-2 的表達(dá)。然而，槲皮素干預(yù)后降低了Bax、Caspase3 的表達(dá)，增加了Bcl-2 的表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)表5。Western blot 得到了類(lèi)似的結(jié)果，相較于模型組，槲皮素干預(yù)后增加了Runx2、Osterix 和Bcl-2 的蛋白表達(dá)，降低了Bax、Caspase3 的蛋白表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)表6、圖2。這些結(jié)果表明，槲皮素能夠減輕H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)MC3T3-E1 細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下的成骨分化功能。

圖2 Western blot檢測(cè)Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2和Caspase3的代表性條帶

表5 槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞中Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2和Caspase3基因表達(dá)的影響

表6 槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞中Runx2、Osterix、Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白表達(dá)的影響

2.5 槲皮素對(duì)Nrf2/HO-1 信號(hào)通路的影響

為進(jìn)一步研究槲皮素在MC3T3-E1 細(xì)胞中的抗氧化機(jī)制，Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2O2干預(yù)后部分增加了Nrf2、HO-1 的蛋白表達(dá)，相較于對(duì)照組和模型組，槲皮素干預(yù)后明顯增加了Nrf2、HO-1 的蛋白表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表7。這些結(jié)果表明，槲皮素可能是通過(guò)激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路減輕MC3T3-E1 細(xì)胞中H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。

圖3 Western blot檢測(cè)Nrf2和HO-1的代表性條帶

表7 槲皮素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

研究表明過(guò)量的ROS 會(huì)抑制成骨細(xì)胞骨形成，增加破骨細(xì)胞骨吸收，導(dǎo)致骨丟失和骨質(zhì)疏松［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女的BMD 下降與血漿脂質(zhì)的高氧化性和SOD、H2O2酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的功效降低有關(guān)［17-19］。因此，尋找新的抗氧化劑來(lái)抑制氧化損傷已經(jīng)成為預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的策略。H2O2是一種活性氧，它可以穿過(guò)生物膜并產(chǎn)生廣泛損傷，據(jù)報(bào)道，H2O2能夠誘導(dǎo)各種類(lèi)型細(xì)胞的凋亡或壞死［20-21］。Sun等［22］研究表明，200 μmol/L H2O2處理24 h 顯著減低MC3T3-E1 細(xì)胞的生存率，200 μmol/L H2O2適合于誘導(dǎo)體外氧化應(yīng)激模型。因此，在本研究中使用200 μmol/L H2O2構(gòu)建氧化損傷模型。數(shù)據(jù)顯示，H2O2處理后明顯增加了細(xì)胞內(nèi)MDA 含量，而槲皮素以濃度依賴的方式降低了細(xì)胞內(nèi)MDA含量。此外，我們發(fā)現(xiàn)槲皮素干預(yù)后增加了細(xì)胞內(nèi)SOD活性，這表明槲皮素處理后在一定程度上減輕了H2O2的毒性。

據(jù)報(bào)道，H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷會(huì)降低成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞分化［23-24］。我們的研究表明，H2O2干預(yù)與細(xì)胞堿性磷酸酶活性降低、鈣礦化減少、成骨基因Runx2 和Osterix 表達(dá)降低有關(guān)。此外，數(shù)據(jù)顯示，槲皮素可以逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的成骨分化抑制。因此，我們推測(cè)槲皮素的抗氧化特性提高了MC3T3-E1 細(xì)胞的存活率，降低了氧化應(yīng)激損傷和成骨分化抑制。

細(xì)胞凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡，受到多種因素的嚴(yán)格調(diào)控［25］。有研究表明，H2O2可誘發(fā)成骨細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致骨微結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥［26］。細(xì)胞凋亡受到多個(gè)基因的嚴(yán)格控制，包括Bcl-2 家族和Caspase 家族。Bcl-2 通過(guò)調(diào)節(jié)促凋亡和抗凋亡之間的平衡來(lái)維持線粒體的完整性，而B(niǎo)ax 通過(guò)增強(qiáng)線粒體膜通透性和改變跨膜電位來(lái)促進(jìn)細(xì)胞色素C 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引起半胱氨酸天冬氨酸裂解酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致Caspase3 的激活并引發(fā)細(xì)胞凋亡［27-28］。在本研究中，Western blot 結(jié)果顯示，H2O2處理明顯增加了MC3T3-E1 細(xì)胞中Bax 和Caspase3 的蛋白表達(dá)，并下調(diào)了Bcl-2 的表達(dá)。然而，槲皮素干預(yù)后降低了Bax 和Caspase3 的表達(dá)，增加了Bcl-2的表達(dá)。這些結(jié)果表明，槲皮素可以減輕氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。

Nrf2 是一個(gè)眾所周知的轉(zhuǎn)錄因子，在抗氧化中起著關(guān)鍵作用。最近，Nrf2/HO-1 信號(hào)通路被證明可作為一種內(nèi)源性抗氧化劑，拮抗多個(gè)器官中的氧化應(yīng)激損傷［29］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路能夠增強(qiáng)多種抗氧化劑的表達(dá)，保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷［30］。

此外，多項(xiàng)研究表明，Nrf2/HO-1 信號(hào)通路在骨質(zhì)疏松癥起重要作用［31］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)槲皮素明顯增加了Nrf2、HO-1 的蛋白表達(dá)，這說(shuō)明槲皮素能夠激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路，減輕MC3T3-E1 細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷、凋亡和成骨分化功能障礙。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建體外氧化應(yīng)激模型研究槲皮素對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和成骨分化功能障礙，這可能是通過(guò)Nrf2/HO-1 信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。