邱振興， 賴芃宇， 朱志強(qiáng)， 譚 震， 邱君志， 陳宇熹?

(1.福州工商學(xué)院， 福建 福州 350715； 2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350002)

莫勒菌(Moelleriella)是蟲(chóng)生真菌的重要成員之一，該菌隸屬于子囊菌門(mén)(Ascomycota)糞殼菌綱(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)麥角菌科(Clavicipitaceae)(Chaverriet al，2008)。 莫勒菌有易生產(chǎn)、高產(chǎn)孢量和高毒力等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是一種重要的生防制劑。1921 年，Berger 使用M.libera(無(wú)性型Aschersonia aleyrodis)防治佛羅里達(dá)柑橘粉虱，這是美國(guó)首次成功使用其進(jìn)行害蟲(chóng)生物防治(Qiuet al，2013)。 其后，許多研究相繼表明，莫勒菌物種可以防治粉虱和介殼蟲(chóng)(Meekeset al，2002；Sengoncaet al，2006)。

在地球生物圈中，微生物扮演著極為重要的角色，與人類(lèi)的日常生活存在緊密聯(lián)系。 蟲(chóng)生真菌因其獨(dú)特的生活方式和生存環(huán)境，形成了與眾不同的適應(yīng)寄主的特性及代謝通路。 近年來(lái)，已從蟲(chóng)生真菌中分離出多種代謝物(Molnaret al，2010)，次生代謝產(chǎn)物被認(rèn)為是在真菌感染期間起著至關(guān)重要作用的毒力因素(Sbarainiet al，2016)，這些代謝產(chǎn)物會(huì)引起昆蟲(chóng)正常功能破壞、疾病甚至死亡(Aleksandraet al，2018)。

莫勒菌廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，該類(lèi)群因棲息環(huán)境和生態(tài)適應(yīng)的多樣性使其次生代謝產(chǎn)物彰顯出多樣性特點(diǎn)。 有研究表明，從莫勒菌(M.tubulata)中分離得到了多種化合物，其中杜斯塔寧和3β-乙?；?15α，22-二羥何帕烷酮能顯著抑制結(jié)核桿菌(Boonphonget al，2001)。 另有學(xué)者從莫勒菌代謝物中分離得到了1 種三萜類(lèi)物質(zhì)——澤渥萜(Beemelmannset al，2016)。 此外，Wattset al(2003)從莫勒菌的菌株中獲得了對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9 顯示出很強(qiáng)的抑制作用的細(xì)皺青霉素和醌茜素，其半數(shù)抑制量(ID50)分別為1.2 和9.6 μg?mL－1。 Isakaet al(2005)從1 株莫勒菌(無(wú)性型Aschersoniasp. BCC8401)中分離到氧雜蒽酮二聚體Ascherxanthone A，此物質(zhì)對(duì)瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，其半抑制濃度(IC50)為0.2 μg?mL－1。 Isakaet al(2010)分離到多種莫勒菌(無(wú)性型A.paraphysataBCC11964)的次生代謝產(chǎn)物，其中化合物Aschernaphthopyrones A 和17(21)-藿烯-6，12β-二醇對(duì)腫瘤細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肺癌細(xì)胞NCI-H187、口腔表皮樣癌細(xì)胞KB)和瘧原蟲(chóng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，IC50分別為7.3 和15 μmol?L－1。 潘潔茹等(2007)發(fā)現(xiàn)1 株莫勒菌(無(wú)性型座殼孢)的代謝產(chǎn)物具有廣譜抗細(xì)菌的活性，馬慧斐等(2007)報(bào)道1 株莫勒菌(無(wú)性型座殼孢)對(duì)Raji 淋巴瘤細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，Liuet al(2015)發(fā)現(xiàn)了莫勒菌產(chǎn)生的7 個(gè)新羊毛甾烷型三萜，并測(cè)試其活性，其中1-hydroxy-2-hydroxymethyl anthraquinone具有較好的抗瘧效果，付德來(lái)等(2018)報(bào)道了莫勒菌含有萜類(lèi)、醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、甾醇和環(huán)肽等化合物并具有抗菌、抗腫瘤及殺蟲(chóng)等活性。 由此可見(jiàn)，莫勒菌及其無(wú)性型天然產(chǎn)物有較好的抗菌、殺蟲(chóng)、抗瘧、抗腫瘤細(xì)胞活性，該菌在生物農(nóng)藥或醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域存在巨大潛力。 Wattset al(2003)就11 個(gè)座殼孢菌和7 個(gè)莫勒菌代謝產(chǎn)物對(duì)昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性的安全性進(jìn)行評(píng)測(cè)，結(jié)果表明，代謝物對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞顯示出較強(qiáng)的毒性，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞幾乎無(wú)影響。 這表明，莫勒菌的代謝物相對(duì)安全，具有開(kāi)發(fā)潛力。

本研究針對(duì)前期試驗(yàn)獲得的莫勒菌純化合物進(jìn)行抗菌、抗氧化活性評(píng)價(jià)，以期發(fā)現(xiàn)該菌次生代謝化合物的應(yīng)用價(jià)值，為其開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

鏈霉素和2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)購(gòu)于上海麥克林生化材料有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑、超氧陰離子自由基(?)測(cè)定試劑盒、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力試劑盒和2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)菌株和化合物

試驗(yàn)菌株為中國(guó)莫勒菌(Moelleriella sinensisWYQL2017-03)，由本課題組自主分離純化和鑒定。

用于抑菌活性評(píng)價(jià)的細(xì)菌和真菌共有12 種，均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株，大腸桿菌(Escherichia coli)、青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、尖孢鐮刀菌西瓜專(zhuān)化型(Fusarium oxysporumf. sp.niveum)、鏈格孢屬(橄欖) (Alternania)、鏈格孢屬(花生) (Alternania)、炭疽屬(橄欖)(Colletrotrichum)、間座殼屬(多花黃精)(Diaporthe)、擬盤(pán)多毛孢屬(花生)(Pestalotiopsis)、擬盤(pán)多毛孢屬(蓮霧)(Pestalotiopsis)、擬盤(pán)多毛孢屬(橄欖)(Pestalotiopsis)。

從中國(guó)莫勒菌的乙酸乙酯萃取物中得到的20 個(gè)純化合物如表1 所示。

1.3 體外抗菌活性評(píng)價(jià)

在超凈工作臺(tái)內(nèi)將供試菌株接種于150 mL 裝有滅過(guò)菌的液體培養(yǎng)基的錐形瓶中并密封，利用恒溫?fù)u床在培養(yǎng)基中活化(細(xì)菌為L(zhǎng)B 培養(yǎng)基，真菌為PDB 培養(yǎng)基)，供試細(xì)菌于恒溫培養(yǎng)箱(28 ℃)中培養(yǎng)24 h 至對(duì)數(shù)期，用酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm 下的吸光度(OD 值)，換算得到相應(yīng)的濃度，最終將濃度稀釋至試驗(yàn)所需濃度1×106CFU?mL－1。 供試真菌需利用恒溫培養(yǎng)箱(28 ℃)培養(yǎng)5～7 d 后，取培養(yǎng)好的真菌平板，用移液槍加入3 mL 無(wú)菌水，將菌絲輕輕刮取下來(lái)，使得真菌孢子懸浮于無(wú)菌水中，吸取孢子懸浮液于無(wú)菌EP 管中沉淀細(xì)小菌絲。 采用血球計(jì)數(shù)板測(cè)算孢子懸浮液的濃度，稀釋至1×105個(gè)?mL－1備用。

將準(zhǔn)備好的供試菌液用移液槍吸取196 μL 加入96 孔板的第1 孔中，第2～8 孔每孔加入菌液100 μL。 第1 孔再加入配制好的待測(cè)液體(1 mg?mL－1)4 μL，用移液槍吹打混勻，每組試驗(yàn)均設(shè)3 組重復(fù)，陽(yáng)性對(duì)照為鏈霉素和環(huán)丙沙星，陰性對(duì)照為二甲基亞砜(DMSO)。

采用二倍稀釋法，用移液槍吸取100 μL 第1 孔中混勻的菌液與化合物液體注入第2 孔，混勻后吸取100 μL 第2 孔液體加入第3 孔，以此類(lèi)推至第8 孔，第8 孔內(nèi)液體混勻后吸取100 μL，棄之。 最后在1～8 各孔中加入菌液100 μL，使每孔的總體積200 μL，對(duì)96 孔板密封處理后放置恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)24 h，真菌培養(yǎng)5～7 d，用酶標(biāo)儀于600 nm 下測(cè)OD 值，與空白對(duì)照組作比較，吸光度下降50%時(shí)的樣品濃度確定為最小抑菌濃度(MIC)。

1.4 抗氧化活性測(cè)定

1.4.1 總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定 根據(jù)總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)配制不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稱(chēng)取27.8 mg FeSO4?7H2O，用1 mL 蒸餾水溶解，即濃度為100 mmol?L－1，將液體依次稀釋至0.15、0.30、0.60、0.90、1.20 和1.50 mmol?L－1。 充分混勻后，37 ℃避光靜置5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定605 nm 處的吸光度。 各孔減去空白孔OD 值后，以標(biāo)準(zhǔn)品OD 值為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為各OD 值對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度，得線性回歸方程y＝3.7855x－0.0627(R2＝0.9985)。 把樣品測(cè)定管測(cè)得的OD 值減去空白孔OD 值后，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式，求得總抗氧化能力。

1.4.2 超氧陰離子清除活性測(cè)定 根據(jù)抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)配制樣品溶液和對(duì)照溶液，將待測(cè)溶液用漩渦混勻器充分混勻，置37 ℃恒溫水浴40 min，室溫靜置10 min，雙蒸水調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm 處的吸光度(A)。 計(jì)算待測(cè)樣品對(duì)超氧陰離子的抑制率。

1.4.3 DPPH 自由基清除活性測(cè)定 根據(jù)DPPH 自由基清除能力試劑盒配制樣品溶液和對(duì)照溶液，將待測(cè)溶液充分混勻，室溫25 ℃避光靜置30 min，4000 r?min－1離心5 min 后吸取上清液，用酶標(biāo)儀測(cè)定517 nm 處的吸光度(A)。 計(jì)算待測(cè)樣品對(duì)DPPH 自由基清除率。

1.4.4 ABTS 自由基清除能力測(cè)定 根據(jù)ABTS 自由基清除能力檢測(cè)試劑盒配制樣品溶液和對(duì)照溶液，將待測(cè)溶液充分混勻，室溫25 ℃避光靜置6 min。 用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm 處的吸光度(A)。 計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照的自由基清除率(DVC)和樣品的自由基清除率(D)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性評(píng)價(jià)結(jié)果

20 個(gè)化合物中僅7 個(gè)化合物(4、5、7、8、11、12、14)表現(xiàn)出不同程度的抗菌活性。 20 個(gè)化合物對(duì)7 株植物病原真菌均未表現(xiàn)出抑制活性，對(duì)4 株細(xì)菌和1 株真菌的抑制活性如表2 所示。 化合物14 對(duì)大腸桿菌和青枯勞爾氏菌的MIC 分別為1.30 和6.25 μg?mL－1，抑菌活性超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照鏈霉素；化合物5 對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的MIC 值均為10.00 μg?mL－1；化合物11 對(duì)5 株菌株均展示出不同程度的抑制活性，MIC 為6.25～25.00 μg?mL－1。

表2 中國(guó)莫勒菌代謝物的抗菌活性Table 2 Antibacterial activities of compounds from M. sinensis

2.2 抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果

采用4 種方法(超氧陰離子清除能力、DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、T-AOC總抗氧化能力)對(duì)純化合物進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)，20 個(gè)化合物中僅化合物3、8、11、19 表現(xiàn)出抗氧化活性(圖1－圖4)。 清除自由基的能力因化合物而異，由于取代基的不同，活性也會(huì)變化。 化合物19 對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力最高(50 μg?mL－1時(shí)抑制率為7.15%)，化合物3對(duì)DPPH、ABTS 自由基的清除能力最高(50 μg?mL－1時(shí)清除率分別為66.02%、30.75%)，化合物19 的總抗氧化能力最強(qiáng)(50 μg?mL－1濃度相當(dāng)于0.63 mmol?L－1FeSO4的抗氧化能力)。

圖1 部分中國(guó)莫勒菌代謝物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Figure 1 Superoxide radical scavenging effects of some compounds from M. sinensis

圖2 部分中國(guó)莫勒菌代謝物對(duì)DPPH自由基的清除作用Figure 2 DPPH radical scavenging effects of some compounds from M. sinensis

圖3 部分中國(guó)莫勒菌代謝物對(duì)ABTS自由基的清除作用Figure 3 ABTS radical scavenging effects of some compounds from M. sinensis

圖4 部分中國(guó)莫勒菌代謝物的總抗氧化能力(T-AOC)Figure 4 Total antioxidant capacity of some compounds from M. sinensis

3 討論

在抗菌活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，化合物5、11 和14 抗菌活性較為突出，化合物14 對(duì)大腸桿菌和青枯勞爾氏菌的MIC 值超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照鏈霉素。 化合物11 對(duì)5 株不同細(xì)菌和真菌表現(xiàn)出不同程度的抑制活性，具有相對(duì)廣泛的抗菌活性。 對(duì)分離得到的抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，萜類(lèi)化合物12、14 對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、青枯勞爾氏菌)的抑制活性明顯優(yōu)于革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)。 由此可見(jiàn)，這些化合物具有較好的應(yīng)用潛力。 化合物種類(lèi)不同，與細(xì)菌的相互作用機(jī)制也不同。 有研究者對(duì)化合物5 進(jìn)行過(guò)初步構(gòu)效關(guān)系分析，認(rèn)為苯環(huán)上的羥基可能是其對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌活性以及甲基化的關(guān)鍵，羥基可能會(huì)降低抗菌活性(Huanget al，2018)。 有研究表明，某些萜類(lèi)化合物可以通過(guò)破壞細(xì)菌胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞膜通透性，從而達(dá)到抑菌效果，這種活性作用的強(qiáng)度大多受雙環(huán)母核上取代基位置影響(Lyuet al，2023)；還有研究發(fā)現(xiàn)，酮類(lèi)化合物可逆性地結(jié)合細(xì)菌的50S蛋白質(zhì)亞單位，導(dǎo)致細(xì)菌蛋白質(zhì)合成受阻。 研究表明，天然產(chǎn)物之所以具有抑菌活性，可能是因?yàn)槎辔镔|(zhì)之間通過(guò)配伍作用發(fā)揮效果，例如頭孢他啶耐藥性陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)可被芹菜素(黃酮)與頭孢他啶協(xié)同抑制(司旭等，2015)，這可以作為后續(xù)深入研究的方向。 從該菌次生代謝產(chǎn)物分離得到的酚酸類(lèi)、三萜類(lèi)、內(nèi)脂類(lèi)衍生物都有不同程度的抗細(xì)菌活性，為生物抗菌藥劑的研發(fā)提供了新穎思路和科學(xué)依據(jù)。

在抗氧化能力評(píng)價(jià)中，表現(xiàn)出明顯抗氧化活性的4 個(gè)化合物中，有3 個(gè)為萜類(lèi)化合物，其中萜類(lèi)化合物3(三萜)、19(二萜)抗氧化活性更為突出。 同種化合物在不同抗氧化能力評(píng)價(jià)試驗(yàn)中存在差異，可能是不同反應(yīng)機(jī)制造成的。 超氧陰離子法、DPPH 法以及ABTS 法都是通過(guò)檢測(cè)特征自由基的形成或衰減的速度或程度來(lái)評(píng)價(jià)樣本活性。 以ABTS 法為例，有些化合物清除ABTS 自由基后的產(chǎn)物也能與ABTS 自由基反應(yīng)，若如此，則測(cè)得的結(jié)果為被測(cè)化合物和反應(yīng)產(chǎn)物與ABTS 自由基反應(yīng)的總和。 而鐵離子還原抗氧化劑能力(FRAP)法真正評(píng)測(cè)的是被測(cè)物將Fe3＋還原成Fe2＋的能力，還原Fe3＋的能力可以反映化合物的抗氧化能力，但是能還原Fe3＋的并不一定都是抗氧化劑，抗氧化劑不一定能有效地還原Fe3＋(王會(huì)等，2006)。 總的來(lái)說(shuō)，各種測(cè)定方法都存在片面性，需要通過(guò)歸納各個(gè)結(jié)果的共性才能得到合理化評(píng)價(jià)。