寧亞維，孫 穎，張東春，張雅娟，司海山，康亞朋，王志新，王世杰

（河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018）

白假絲酵母菌是一種條件致病菌，通常存在于正常人口腔黏膜、上呼吸道、腸道及陰道，當(dāng)機(jī)體免疫功能下降或菌群失調(diào)時(shí)則大量繁殖侵入細(xì)胞引起疾病。在口腔中白假絲酵母菌感染可引起鵝口瘡[1]，還會(huì)感染口腔黏膜炎病變，導(dǎo)致口咽黏膜炎癥[2]，并且與齲齒、牙周炎等口腔疾病也密切相關(guān)[3]。白假絲酵母菌生物膜的形成是導(dǎo)致和加深口腔疾病的重要原因，因?yàn)榕c浮游細(xì)胞相比生物被膜細(xì)胞具有更大的耐藥性，并且能更加持久的黏附在牙齒或口腔黏膜表面。在口腔中白假絲酵母菌可以與口腔致病菌形成混合生物膜并互相利用，例如與致齲菌變異鏈球菌的相互作用可以增強(qiáng)細(xì)菌-真菌的結(jié)合，使得形成的雙物種生物膜具有更大的三維復(fù)雜性，增加抵抗應(yīng)激條件的能力，同時(shí)增強(qiáng)變異鏈球菌生物膜的致齲性[4-5]；白假絲酵母菌與牙菌斑形成相關(guān)的口腔鏈球菌協(xié)同可以增加彼此的數(shù)量，口腔鏈球菌還能促進(jìn)白假絲酵母菌菌絲的形成；白假絲酵母菌與牙周炎致病菌伴放線放線桿菌聚集桿菌也具有協(xié)同的作用，可明顯增強(qiáng)毒力從而破壞牙周組織[6]。

目前對(duì)口腔念珠病感染的治療方法包括使用抗真菌藥物、天然植物衍生物、光動(dòng)力療法等，其中對(duì)于治療白假絲酵母菌常用的抗生素類藥物包括氟康唑、兩性霉素B等。近年來抗真菌藥物的大量使用使越來越多的耐藥菌株出現(xiàn)并傳播[7]。為了應(yīng)對(duì)白假絲酵母對(duì)抗生素的耐藥性，目前運(yùn)用植物中提取的化合物替代傳統(tǒng)藥物得到廣泛研究。研究較多的植物衍生物包括提取物、精油、萜烯、生物堿、黃酮類化合物、多酚、凝集素等[8]。光動(dòng)力療法主要是利用光敏劑被光源激活并與氧氣反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，對(duì)耐藥性白假絲酵母也具有效果，但這種療法更適用于深度感染且有術(shù)后不良反應(yīng)[9-10]。

白假絲酵母菌數(shù)量的增加會(huì)引起多種口腔疾病，造成口腔菌群失衡，細(xì)菌與白假絲酵母的特定相互作用可以促進(jìn)其向致病菌的轉(zhuǎn)變。因此對(duì)于口腔疾病，調(diào)節(jié)菌群失衡的防治手段對(duì)維護(hù)口腔環(huán)境健康十分重要。近幾年益生菌在口腔中的使用和研究越來越受到關(guān)注，在各項(xiàng)研究中均表明常見的幾種乳酸菌如鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌等對(duì)白假絲酵母菌在口腔中的發(fā)展均有抑制作用[11-12]。而益生菌的作用機(jī)制也多種多樣，其中包括通過黏附競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素、生物表面活性劑等抑制病原體[13-14]。因此選取實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的對(duì)口腔致病菌具有較好抑制作用的植物乳桿菌HB13-2，研究其對(duì)白假絲酵母菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、跨膜電勢(shì)、微觀結(jié)構(gòu)、活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累以及線粒體膜電位方面影響，分析植物乳桿菌HB13-2上清液對(duì)菌體的抑菌作用機(jī)制，旨在為植物乳桿菌HB13-2作為口腔益生菌開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌HB13-2分離自農(nóng)家自制酸菜，白假絲酵母菌ATCC10231由河北科技大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實(shí)驗(yàn)室保藏。

無水乙醇、戊二醛、乙酸異戊酯、異丙醇 天津永大化學(xué)試劑公司；Hepes 北京科博生物技術(shù)有限公司；Nigericin、Valinomycin、DiSC3(5)、羅丹明-123、2,′7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodihydrofluo rescein diacetate，DCFH-DA）、熒光增白劑（calcofluor white，CFW）熒光染料 美國(guó)Sigma公司；碘化丙啶（propidium iodine，PI）、SYTO-9 美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-5S立式蒸汽滅菌鍋 上海博訊有限公司；3-18K高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；ZSD-A1160恒溫培養(yǎng)箱 上海智誠(chéng)分析儀器制造公司；BX53熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會(huì)社；F-7000-FL 220熒光分光光度計(jì)、S-4800-1掃描電鏡 日本日立公司；AccuriC6 Plus流式細(xì)胞儀 美國(guó)Becton Dickinson公司；Alpha 2-4 L Dplus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌HB13-2上清液的制備

將植物乳桿菌HB13-2接種于MRS肉湯中于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。然后，將菌懸液8 000 r/min離心15 min，以使植物乳桿菌與上清液分離。取出上清液后在-40 ℃預(yù)凍12 h后置于冷凍干燥機(jī)30 h，將凍干后的上清液貯存在-40 ℃，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前按照不同質(zhì)量濃度制備上清液并經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾處理。

1.3.2 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定

采用二倍稀釋法測(cè)定植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌的MIC。將植物乳桿菌HB13-2上清液凍干配制成質(zhì)量濃度為640 mg/mL的上清液，白假絲酵母菌用YPD調(diào)節(jié)濃度為106CFU/mL。在96 孔板中先加入100 μL YPD，再將質(zhì)量濃度為400 mg/mL植物乳桿菌HB13-2上清液加入第1個(gè)孔中，吸打混勻后取100 μL加入第2個(gè)孔，依次重復(fù)，最終實(shí)驗(yàn)組終質(zhì)量濃度100～5 mg/mL。以200 μL YPD作為陰性對(duì)照組，以白假絲酵母菌液與YPD各100 μL作為空白對(duì)照組。放入37 ℃培養(yǎng)箱24 h用光密度法觀察，以被抑制的最低抑菌劑濃度作為MIC。

1.3.3 時(shí)間-抑菌曲線的測(cè)定

將白假絲酵母菌活化后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)節(jié)菌濃度為106CFU/mL，配制不同質(zhì)量濃度的植物乳桿菌上清液與菌懸液等體積混合，使終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC以及2 MIC，以不加入上清液作為空白對(duì)照。分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌數(shù)計(jì)數(shù)，并繪制時(shí)間-抑菌曲線。

1.3.4 細(xì)胞壁完整性的測(cè)定

用KOH 和CFW 染色檢測(cè)上清液對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞壁的影響[15]。白假絲酵母菌懸液調(diào)整濃度為106CFU/mL，并在37 ℃與終質(zhì)量濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC的植物乳桿菌上清液孵育6 h。8 000 r/min離心10 min后棄上清液，用0.85%生理鹽水清洗菌體3 次后，將菌體取1 環(huán)放置在載玻片上，用10% KOH和0.1% CFW溶液染色，并用熒光顯微鏡觀察，在每個(gè)質(zhì)量濃度的處理組中至少選擇3 個(gè)隨機(jī)視野觀察。

1.3.5 細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

采用PI和SYTO-9染色法分析白假絲酵母菌細(xì)胞膜完整性[16]。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白假絲酵母菌用0.85%生理鹽水重復(fù)清洗3 次，重懸為濃度106CFU/mL的菌懸液，將用生理鹽水配制的不同質(zhì)量濃度植物乳桿菌上清液與菌懸液等體積混合，使上清液終質(zhì)量濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC，未經(jīng)過上清液處理的菌體作陰性對(duì)照，用70%異丙醇溶液處理的樣品用作陽(yáng)性對(duì)照，并在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育6 h。離心后收集細(xì)胞，清洗3 次以去除上清液，重懸在生理鹽水中，在黑暗條件下用2 μmol/L SYTO-9和12 μmol/L PI染色15 min。再次清洗3 次探針，重懸后用熒光顯微鏡觀察，并用流式細(xì)胞儀分析。

1.3.6 細(xì)胞膜跨膜電勢(shì)的測(cè)定

采用DiSC3(5)考察菌體細(xì)胞膜跨膜電勢(shì)變化[17]。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白假絲酵母菌用含有10 mmol/L葡萄糖的Hepes緩沖液（5 mmol/L）重復(fù)清洗3 次，重懸為濃度106CFU/mL的菌懸液，向菌液中加入DiSC3(5)使其終濃度為1 μmol/L，37 ℃避光孵育30 min，加入終濃度100 mmol/L KCl溶液。在比色皿中加入等體積菌懸液和不同質(zhì)量濃度抑菌劑，使抑菌劑終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC，以0.85%生理鹽水作空白對(duì)照。以Valinomycin作為陰性對(duì)照，以Nigericin作為陽(yáng)性對(duì)照（終濃度5 mmol/L），以Hepes緩沖液為空白對(duì)照組，用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描，測(cè)定熒光強(qiáng)度變化（激發(fā)波長(zhǎng)650 nm，發(fā)射波長(zhǎng)672 nm）。

1.3.7 掃描電鏡分析

收集對(duì)數(shù)期的白假絲酵母菌，清洗、重懸，調(diào)整菌濃度為106CFU/mL，將等體積菌懸液與不同質(zhì)量濃度植物乳桿菌上清液混合作用6 h。離心，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗菌體后，在4 ℃下用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定過夜。之后，樣品經(jīng)0.1 mol/L PBS清洗除去戊二醛，然后用乙醇（30%、50%、70%、85%、90%、100%）進(jìn)行逐級(jí)梯度脫水，每次15 min，無水乙醇脫水2 次。最后用乙酸異戊酯將乙醇置換2 次，每次20 min，干燥后通過掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)ROS的測(cè)定

DCFH-DA用于測(cè)定白假絲酵母菌中細(xì)胞內(nèi)ROS水平[18]。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的白假絲酵母菌用0.1 mol/L PBS清洗3 次，重懸在PBS中并將菌懸液濃度調(diào)節(jié)為106CFU/mL，將植物乳桿菌上清液與菌懸液等體積混合，使終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC、2 MIC以及4 MIC，以不加上清液組為對(duì)照組，于37 ℃孵育6 h。然后，用PBS清洗細(xì)胞3 次以除去上清液，再重懸在1 mL的PBS中，加入DCFH-DA使其終濃度為10 μmol/L，避光孵育30 min。再次用PBS清洗探針3 次，以PBS為空白對(duì)照組并通過熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm）。

1.3.9 線粒體膜電位

采用羅丹明-123考察菌體線粒體膜電位的變化[19]。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的白假絲酵母菌用0.1 mol/L PBS清洗3 次，重懸在PBS中并將菌懸液濃度調(diào)節(jié)為106CFU/mL，用PBS配制植物乳桿菌上清液與菌懸液等體積混合，使終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC、2 MIC以及4 MIC，以不加上清液組為對(duì)照組，于37 ℃孵育6 h。用PBS清洗菌體以除去上清液，加入羅丹明-123，于37 ℃避光染色30 min。再次清洗探針3 次，以PBS為空白對(duì)照組，通過熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)486 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次取其平均值。采用Origin 9.0軟件通過單因素方差分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌的抑菌活性

MIC可以反映植物乳桿菌HB13-2上清液對(duì)浮游白假絲酵母菌的抑制活性，測(cè)定得到其MIC值為50 mg/mL。進(jìn)一步進(jìn)行時(shí)間-抑菌曲線的測(cè)定，以考察植物乳桿菌HB13-2上清液對(duì)白假絲酵母菌生長(zhǎng)和繁殖的抑制情況。如圖1所示，與沒有加入植物乳桿菌上清液的細(xì)胞相比，1/2 MIC、MIC、2 MIC處理對(duì)白假絲酵母菌均有抑制作用，且呈質(zhì)量濃度依賴性。在1/2 MIC處理組中植物乳桿菌HB13-2上清液延緩了白假絲酵母菌的生長(zhǎng)速度，MIC處理組完全抑制了白假絲酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，在作用24 h后白假絲酵母菌處于生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，數(shù)量與0 h相比基本保持不變，2 MIC處理組則在作用2 h后無活菌檢出，表明在此質(zhì)量濃度下植物乳桿菌HB13-2上清液對(duì)白假絲酵母菌顯示出致死作用。

圖1 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌的抑菌曲線Fig.1 Inhibitory curves of L.plantarum HB13-2 against C.albicans

2.2 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞壁完整性的影響

白假絲酵母菌的細(xì)胞壁起到滲透屏障、維持細(xì)胞完整性并賦予結(jié)構(gòu)剛性的作用，主要是由幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖組成[20]。熒光染料CFW與組成細(xì)胞壁的成分幾丁質(zhì)具有親和力，兩者結(jié)合可發(fā)出藍(lán)光，藍(lán)光強(qiáng)度越強(qiáng)則證明幾丁質(zhì)越密集，結(jié)合的越緊密，因此采用熒光染料CFW對(duì)白假絲酵母進(jìn)行染色，考察了植物乳桿菌上清液對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞壁的作用[21]。圖2熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，未經(jīng)上清液處理過的細(xì)胞與經(jīng)上清液處理后的細(xì)胞均呈藍(lán)色熒光，但未經(jīng)上清液處理過的細(xì)胞熒光強(qiáng)度較弱，1/2 MIC與MIC處理組僅觀察到熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)，而2 MIC處理組可以觀察到部分菌體的端部出現(xiàn)亮熒光，這種現(xiàn)象在4 MIC處理組中明顯增多，大部分菌體都帶有明顯的亮點(diǎn)。Rueda等[22]研究證明，利用能有效殺滅念珠菌的藥物——卡泊芬凈處理白假絲酵母后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)積累，并使其他細(xì)胞壁成分重排，這可能是藥物引起細(xì)胞壁修復(fù)機(jī)制的信號(hào)通路的激活，但并不足以使細(xì)胞免受藥物的攻擊。Da Silva等[21]發(fā)現(xiàn)，從石榴果皮中提取的凝集素PgTeL經(jīng)熒光染料CFW染色后酵母壁中CFW熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，并且出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中擴(kuò)散的現(xiàn)象，表明細(xì)胞壁完整性喪失。因此，在本研究中上清液處理后觀察到熒光強(qiáng)度增強(qiáng)可能是由于幾丁質(zhì)的積累造成，而細(xì)胞中出現(xiàn)熒光斑點(diǎn)可能是由于細(xì)胞壁成分的重排導(dǎo)致熒光沾染率的差異，這表明上清液使細(xì)胞壁產(chǎn)生了損傷，從而導(dǎo)致幾丁質(zhì)的補(bǔ)償性增加。

圖2 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞壁完整性的影響Fig.2 Effect of L.plantarum HB13-2 on the cell wall integrity of C.albicans

2.3 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞膜完整性的影響

采用PI和SYTO-9對(duì)白假絲酵母菌進(jìn)行染色，并通過熒光顯微鏡觀察植物乳桿菌HB13-2上清液對(duì)其細(xì)胞膜完整性的影響。PI不能通過完整的細(xì)胞膜對(duì)DNA進(jìn)行染色，但當(dāng)細(xì)胞膜破損使可以進(jìn)入胞內(nèi)對(duì)DNA染色并發(fā)出紅色熒光[23]，而SYTO-9能夠通過細(xì)胞膜對(duì)DNA進(jìn)行染色發(fā)出綠色熒光[24]，因此對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染后從熒光顯微鏡觀察菌體的顏色呈現(xiàn)綠色、黃色、橙色、紅色，紅色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)則表明菌體細(xì)胞膜受損越嚴(yán)重。如圖3所示，未經(jīng)上清液處理過的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色表明菌體細(xì)胞膜完整未出現(xiàn)破損，1/2 MIC處理組菌體仍以綠色為主，少數(shù)菌體呈現(xiàn)黃色，表明在此質(zhì)量濃度處理下對(duì)大部分白假絲酵母菌細(xì)胞膜損傷不大；MIC處理組少部分菌體呈現(xiàn)黃色熒光強(qiáng)度較弱；2 MIC處理組中呈現(xiàn)黃色的菌體數(shù)量增加，少數(shù)菌體呈現(xiàn)橙色；4 MIC處理組紅色熒光強(qiáng)度明顯增加，菌體呈現(xiàn)紅色表明菌體細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重。

圖3 植物乳桿菌HB13-2上清液對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.3 Effect of the culture supernatant of L.plantarum HB13-2 on the cell membrane integrity of C.albicans

為了進(jìn)一步考察上清液對(duì)細(xì)胞膜的破壞，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)破損程度進(jìn)行定量分析。如圖4所示，未經(jīng)處理的白假絲酵母菌膜受損率為0.2%，1/2 MIC處理組膜受損率為2.3%，MIC處理組膜受損率為13.9%，2 MIC處理組膜受損率為56.8%，4 MIC處理組膜受損率為84.3%。因此，流式細(xì)胞儀結(jié)果表明1/2 MIC和MIC處理組對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用均不明顯，2 MIC與4 MIC處理組則顯示出顯著的破壞作用。熒光顯微鏡觀察結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致，均表明上清液處理可以破壞細(xì)胞膜完整性。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析植物乳桿菌HB13-2上清液對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.4 Flow cytometry analysis of the effect of the culture supernatant of L.plantarum HB13-2 on the cell membrane integrity of C.albicans

2.4 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞膜跨膜電勢(shì)的影響

DiSC3(5)是一種親脂性的熒光探針，由于其疏水性和陽(yáng)離子性質(zhì)可以穿透脂質(zhì)雙層并在極化細(xì)胞中積累到高水平[25]。膜去極化后，染料迅速?gòu)募?xì)胞中釋放，隨后可通過熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度從而判斷細(xì)胞膜膜電勢(shì)水平[26]。如圖5所示，未經(jīng)上清液處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度為28.97，經(jīng)Nigericin處理過的陰性對(duì)照組熒光強(qiáng)度為26.325，而經(jīng)1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC處理后的細(xì)胞最終熒光強(qiáng)度分別達(dá)到54.57、66.12、86.305、100.48，隨著上清液質(zhì)量濃度的增加，DiSC3(5)熒光強(qiáng)度增大，呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。細(xì)胞內(nèi)電化學(xué)梯度的破壞與質(zhì)膜通透性的增加相關(guān)[27]，上清液可能通過導(dǎo)致白假絲酵母菌細(xì)胞膜的去極化及通透性增加，從而起到抗真菌作用，這一結(jié)果與杜仲抗菌肽EuCHIT1對(duì)白假絲酵母菌的抑菌機(jī)制類似均可破壞膜電勢(shì)[28]。

圖5 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌跨膜電勢(shì)的影響Fig.5 Effect of L.plantarum HB13-2 on the transmembrane potential of C.albicans

2.5 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖6所示，未經(jīng)上清液處理的白假絲酵母菌菌體完整、飽滿、邊緣清晰，且表面光滑呈球狀，而用不同質(zhì)量濃度植物乳桿菌HB13-2上清液處理6 h后白假絲酵母菌的形態(tài)發(fā)生了不同程度改變。經(jīng)MIC處理后，白假絲酵母菌菌體表面變的粗糙，并出現(xiàn)皺縮，部分菌體表面出現(xiàn)凹陷，并伴有少量附著在菌體上的泄漏內(nèi)容物。經(jīng)2 MIC處理后，白假絲酵母菌菌體表面皺縮，出現(xiàn)嚴(yán)重凹陷并產(chǎn)生空洞，大量泄漏的內(nèi)容物與溶解的細(xì)胞以及細(xì)胞碎片出現(xiàn)，并出現(xiàn)附著團(tuán)聚的現(xiàn)象。

圖6 掃描電鏡觀察植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effect of L.plantarum HB13-2 on the morphological structure of C.albicans observed by SEM

2.6 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌ROS的影響

ROS是在細(xì)胞氧化呼吸過程中產(chǎn)生，還原酶可以消除產(chǎn)生的ROS，以達(dá)到細(xì)胞內(nèi)氧化還原的平衡，當(dāng)ROS水平較高時(shí)可能會(huì)擾亂細(xì)胞正常代謝，破壞細(xì)胞器和細(xì)胞膜，從而進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[29]。DCFH-DA能夠進(jìn)入細(xì)胞，并通過酯酶脫乙?；癁?′,7′-二氯二氫熒光素（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein，DCFH），DCFH不能通過細(xì)胞因此留存在細(xì)胞內(nèi)部，DCFH無熒光但當(dāng)ROS存在時(shí)能夠被氧化為有熒光的2′,7′-二氯熒光素，因此通過測(cè)定熒光強(qiáng)度可以測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的積累水平[30]。如圖7所示，未經(jīng)處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度為9.41，而經(jīng)1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC處理后的細(xì)胞最終熒光強(qiáng)度分別達(dá)到15.78、30.86、56.68、83.995，熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)表明植物乳桿菌HB13-2上清液能顯著增加白假絲酵母菌細(xì)胞內(nèi)ROS水平，并呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。ROS積累是許多抗真菌藥物以及化學(xué)物質(zhì)發(fā)揮抑制和致死作用的機(jī)制之一，伊曲康唑是對(duì)白假絲酵母十分有效的殺菌劑，其主要?dú)⒕鷻C(jī)制是引起白假絲酵母菌ROS的積累誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[31]。經(jīng)香芹酚處理后的白假絲酵母，ROS水平增加并且改變了線粒體膜電位，并影響了線粒體形態(tài)[32]。因此ROS的積累可能是上清液的抑菌機(jī)制之一，并有可能對(duì)白假絲酵母菌的線粒體產(chǎn)生影響。

圖7 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌ROS的影響Fig.7 Effect of L.plantarum HB13-2 on intracellular ROS levels in C.albicans

2.7 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位作為細(xì)胞能量狀態(tài)的指標(biāo)，可以反映線粒體中的質(zhì)子負(fù)荷、電子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和線粒體膜的通透性[33]，因此膜電位的改變也是抗真菌的重要機(jī)制。羅丹明-123是一種陽(yáng)離子親脂性染料，滲透到帶負(fù)電荷的線粒體中，并反映線粒體膜電位[19]。如圖8所示，植物乳桿菌HB13-2以質(zhì)量濃度依賴的方式顯著增強(qiáng)了羅丹明-123熒光強(qiáng)度，未經(jīng)處理過的細(xì)胞熒光強(qiáng)度為9.26，而經(jīng)1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC處理后終熒光強(qiáng)度分別達(dá)到13.36、15.495、25.57、45.96，顯著增加了白假絲酵母菌線粒體膜電位水平。線粒體膜電位的增加表明上清液可以誘導(dǎo)白假絲酵母菌線粒體膜電位的超極化，并誘導(dǎo)線粒體損傷，使線粒體功能出現(xiàn)障礙。線粒體是細(xì)胞凋亡過程中最常見的ROS來源，ROS積累會(huì)導(dǎo)致線粒體膜性能改變，最終改變膜電位[34]。ROS研究結(jié)果表明上清液處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，因此推測(cè)這是導(dǎo)致白假絲酵母菌線粒體膜電位改變的原因之一。

圖8 植物乳桿菌HB13-2對(duì)白假絲酵母菌線粒體膜電位的影響Fig.8 Effect of L.plantarum HB13-2 on mitochondrial membrane potential of C.albicans

3 結(jié)論

植物乳桿菌HB13-2上清液能夠抑制白假絲酵母菌的生長(zhǎng)，并能破壞細(xì)胞壁的完整性，改變細(xì)胞膜通透性并導(dǎo)致跨膜電勢(shì)消散。從微觀結(jié)構(gòu)觀察也發(fā)現(xiàn)經(jīng)上清液處理后菌體產(chǎn)生明顯的皺縮、形變，引起內(nèi)容物的泄漏。另外，上清液處理也會(huì)導(dǎo)致菌體內(nèi)ROS積累以及線粒體膜電位的改變并出現(xiàn)超極化?？傊?，植物乳桿菌HB13-2上清液可通過破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整性、影響膜電勢(shì)、改變菌體形態(tài)、導(dǎo)致ROS積累、損傷線粒體功能對(duì)白假絲酵母菌產(chǎn)生抑制效果。本研究可為植物乳桿菌HB13-2開發(fā)成為口腔益生菌提供科學(xué)依據(jù)。