胡金春 葉嘉政 任思齊 鄭善堅(jiān)

摘要首次報(bào)道了一種寄生于天然水體鰱、鳙魚(yú)鰓部的中華湖蛭（Limnotrachelobdella sinensis）。2019—2022年，每年10月份后在部分水庫(kù)鰱、鳙魚(yú)鰓上發(fā)現(xiàn)少量幼蟲(chóng)感染，翌年4—6月為感染高峰，7月份后自行脫落消失。它吸食魚(yú)鰓上的血液，嚴(yán)重影響魚(yú)體生長(zhǎng)及市場(chǎng)銷售價(jià)格，給漁業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定其為中華湖蛭。利用幾種常用藥物（敵百蟲(chóng)、川楝子、生石灰、硫酸銅）對(duì)中華湖蛭進(jìn)行離體和在體（寄生在鰱魚(yú)鰓上）的浸浴殺滅效果試驗(yàn)。離體試驗(yàn)結(jié)果表明，生石灰200 mg/L、川楝子400.00 mg/L、敵百蟲(chóng)4.00 mg/L浸浴1 h可以全部殺滅中華湖蛭；在體試驗(yàn)表明，400.00 mg/L川楝子、2.00 mg/L敵百蟲(chóng)、100.00 mg/L生石灰浸浴1 h后撈出至清水中暫養(yǎng)24 h觀察，蟲(chóng)體全部死亡脫落而鰱魚(yú)安全。

關(guān)鍵詞中華湖蛭；浸?。粴缧Ч?；離體試驗(yàn)；在體試驗(yàn)

中圖分類號(hào)S 917.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2023）24-0082-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.018

Study on the Identification of Limnotrachelobdella sinensis and the Germicidal Efficacy of Drug Immersion Bath

HU Jinchun1，2，YE Jiazheng1，REN Siqi1 et al

（1.Key Laboratory of Wildlife Biotechnology and Conservation and Utilization of Zhejiang Province/Zhejiang Normal University，Jinhua，Zhejiang 321004;2.Aquatic Technology Promotion Station in Quzhou City，Quzhou，Zhejiang? 324000）

AbstractLimnotrachelobdella sinensis，a freshwater leech parasitic on the gills of Aristichthys nobilis and Hypophthalmichthys molitrix in natural water body，was reported for the first time.During 2019-2022，a small number of larvae were found to be infected on the gills of A.nobilis and H.molitrix in some reservoirs after October each year.The infection peaked from April to June in the following year，and then disappeared after July.It absorbed the blood on the fish gills，which seriously affected the fish growth and market sales price，and brought huge economic losses to the fishery production.It was identified by morphology and molecule methods as L.inensis.The killing effect of several commonlyused drugs （trichlorfon，toosendan，quicklime and cupric sulfate） on L.sinensis was tested by dipping bath in vitro and in vivo （parasitized on the gills of H.molitrix）.The in vitro test showed that soaking with 200.00? mg/L quicklime，400.00? mg/L toosendan and 4.00? mg/L trichlorfon for 1 hour could kill all L.inensis，while in vivo test showed that 400.00? mg/L toosendan，2.00? mg/L trichlorfon and 100.00? mg/L quicklime were soaked for 1 hour and then temporarily cultured in clean water，and all the parasites were killed for 24 hours and H.molitrix was safe.

Key wordsLimnotrachelobdella sinensis;Immersion bath;Germicidal efficacy;In vitro test;In vivo test

鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙（Hypophthalmichthys nobilis）是典型的浮游生物食性魚(yú)類，在我國(guó)主要的大型水庫(kù)、湖泊中具有重要的生態(tài)學(xué)意義。隨著“潔水漁業(yè)”的發(fā)展，我國(guó)水庫(kù)湖泊都以放養(yǎng)鰱鳙魚(yú)為主，一方面鰱、鳙魚(yú)通過(guò)非經(jīng)典生物操縱控制藻類水華的發(fā)生［1］，另一方面水庫(kù)等清水養(yǎng)殖的鰱鳙魚(yú)品質(zhì)較好，能帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)效益，形成了以千島湖有機(jī)魚(yú)等品牌為代表的特色產(chǎn)業(yè)，深受市場(chǎng)喜愛(ài)。自2019年以來(lái)，浙江省部分中小型水庫(kù)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)鳙、鰱魚(yú)鰓上感染類似中華湖蛭（Limnotrachelobdella sinensis）的寄生蟲(chóng)，其他魚(yú)類上未發(fā)生感染。3月上旬在大規(guī)格鳙、鰱魚(yú)鰓上可見(jiàn)少量白色幼蟲(chóng)感染，4—7月發(fā)現(xiàn)大量感染，特別是對(duì)鳙魚(yú)的感染率極高，每條魚(yú)上可見(jiàn)30～50條褐色成蟲(chóng)，雖然不會(huì)引起死亡，但會(huì)影響其銷售，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前已知中華湖蛭在我國(guó)山東、江蘇、湖南和黑龍江地區(qū)廣泛分布，主要利用其強(qiáng)力的尾吸盤(pán)吸附于鯉（Cyprinus carpio）、鯽（Carassius auratus）魚(yú)鰓蓋骨上，頭部和身體的前段游離在鰓腔里面，通過(guò)吻在鰓瓣上吮吸血液［2］。另外，水庫(kù)等大型水體魚(yú)類感染中華湖蛭缺乏有效的防控措施，存在用藥成本大、生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)高的問(wèn)題，考慮到其死亡率不高，筆者認(rèn)為比較經(jīng)濟(jì)的措施是在鰱鳙魚(yú)起捕后采用藥物短期浸浴殺滅蟲(chóng)體。筆者開(kāi)展藥物浸浴對(duì)中華湖蛭的殺滅效果試驗(yàn)，以期為大型水體鰱鳙魚(yú)中華湖蛭的安全有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2020年6月從活體鳙魚(yú)鰓部采集到體長(zhǎng)（45±5） mm、體寬（15±5） mm的魚(yú)蛭（暫命名為JH20200616）500多條，用于鑒定及藥物殺滅效果試驗(yàn)。另外，從該水庫(kù)選擇鰓部感染中華湖蛭數(shù)量相近［（20±2）條］、規(guī)格（3±1） kg/尾的鰱魚(yú)150尾，暫養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖桶內(nèi)。試驗(yàn)用水為經(jīng)曝氣24 h以上的自來(lái)水，試驗(yàn)期間保持曝氣，pH為6.7～7.2，溶解氧7.5～9.0? mg/L，水溫23.5～25.5 ℃。

1.2試驗(yàn)藥物

選擇4種常用殺蟲(chóng)藥物用于試驗(yàn)，敵百蟲(chóng)（含量≥90%，南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司）；五水硫酸銅（含量≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；生石灰、川楝子均購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。其中，川楝子研磨成粉，稱取2 g藥粉，加入400 mL蒸餾水經(jīng)文火煎煮1 h，冷卻后經(jīng)多層滅菌篩絹網(wǎng)過(guò)濾，再用滅菌水定量，調(diào)制成1 g/L的母液，5～7 ℃下放置備用。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1形態(tài)與分子生物學(xué)鑒定。

取寄生蟲(chóng)活體將其置于培養(yǎng)皿中，在蔡司體視顯微鏡（BHCS-LT004）下觀察，進(jìn)行拍照和測(cè)量，并描述其外部形態(tài)特征。使用動(dòng)物基因組 DNA 抽提試劑盒提取寄生蟲(chóng)DNA，查閱文獻(xiàn)設(shè)計(jì)下列引物擴(kuò)增其COI序列［3］。

F1為5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，R1為5′-TAAACTTCAGGGTGACCCAAAAAATCA-3′。

25 μL 反應(yīng)體系：ddH2O 12 μL，Taq 酶10 μL，正、反向引物和模板DNA各1 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

PCR 擴(kuò)增完成后，取 5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI網(wǎng)站在線Blast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列同源性比較，并通過(guò)Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.2離體條件下藥物對(duì)中華湖蛭成蟲(chóng)的殺滅效果試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，每種藥物配制5個(gè)藥物濃度梯度［4］（表1）置于燒杯中，每個(gè)試驗(yàn)燒杯中分別放入中華湖蛭10條，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。藥物浸浴1 h后，觀察并記錄中華湖蛭死亡情況，死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為中華湖蛭身體伸長(zhǎng)、針刺無(wú)反應(yīng)。

1.3.3在體條件下藥物對(duì)中華湖蛭成蟲(chóng)的殺滅效果試驗(yàn)。

根據(jù)離體試驗(yàn)結(jié)果，選擇生石灰、川楝子和敵百蟲(chóng)對(duì)已感染中華湖蛭的鰱魚(yú)進(jìn)行在體試驗(yàn)。藥物濃度同表1，養(yǎng)殖桶試驗(yàn)水體300 L，并在每個(gè)桶內(nèi)放養(yǎng)3尾鰱魚(yú)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。將鰱魚(yú)在藥物中浸浴1 h后撈至清水養(yǎng)殖桶內(nèi)繼續(xù)觀察，試驗(yàn)期間若出現(xiàn)魚(yú)體體色變淡，應(yīng)迅速中斷試驗(yàn)，將其撈至清水養(yǎng)殖桶內(nèi)，試驗(yàn)24 h后再對(duì)魚(yú)體寄生的蟲(chóng)體情況進(jìn)行檢查并記錄。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用Origin軟件繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)特征及鑒定

此次發(fā)現(xiàn)寄生在鳙、鰱魚(yú)鰓上的蟲(chóng)體呈長(zhǎng)橢圓形，背面隆起，腹面平坦。體長(zhǎng)25～60 mm，體寬8～22 mm，頭部呈橫卵圓形，軀干部寬而長(zhǎng)，略呈長(zhǎng)卵圓形，中部最寬闊。頸部狹且短。背面深褐色，腹面灰白色，前、尾兩吸盤(pán)和頸部均呈米黃色，尾吸盤(pán)部位呈深杯狀，腹部?jī)蓚?cè)有膜質(zhì)的搏動(dòng)囊11對(duì)，能有節(jié)律地搏動(dòng)，除第1對(duì)較小外，其余10對(duì)均較大，主要寄生在鰱和鳙魚(yú)鰓弓上以及鰓絲基部或鰓瓣之間（圖1）。這與《中國(guó)動(dòng)物志：環(huán)節(jié)動(dòng)物門 蛭綱》［5］

所描述的中華湖蛭（Limnotrachelobdella sinensis）的形態(tài)特征相吻合。根據(jù)線粒體基因COI進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)JH20200616與Limnotrachelobdella sinensis（LC275140.1）聚為一支（圖2），因此根據(jù)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)數(shù)據(jù)確定為中華湖蛭。

2.2離體條件下藥物對(duì)中華湖蛭的殺滅效果

選擇4種常用漁藥進(jìn)行離體條件下對(duì)中華湖蛭的殺滅效果試驗(yàn)。結(jié)果表明，生石灰200.00 mg/L、川楝子400.00 mg/L、敵百蟲(chóng)4.00 mg/L浸浴1 h可以全部殺滅中華湖蛭（圖3）。硫酸銅濃度高達(dá)200.00 mg/L也只能使60%的中華湖蛭死亡，殺滅效果不理想。

2.3在體條件下藥物對(duì)中華湖蛭的殺滅效果

在體條件下將感染中華湖蛭的鰱魚(yú)進(jìn)行不同濃度藥物浸浴，1 h后撈至清水中暫養(yǎng)24 h進(jìn)行觀察。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，濃度25.00和50.00 mg/L川楝子浸浴1 h的殺滅效果較差，24 h后觀察發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體仍比較活躍；濃度100.00和200.00 mg/L川楝子浸浴后，24 h觀察發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體大部分脫落死亡，但仍有少量蟲(chóng)體存活；濃度400.00 mg/L川楝子浸浴24 h后蟲(chóng)體全部死亡脫落，在此期間鰱魚(yú)活動(dòng)正常，未見(jiàn)不良反應(yīng)。

0.25和0.50 mg/L敵百蟲(chóng)浸浴1 h對(duì)中華湖蛭的殺滅效果較差，24 h后觀察發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體仍比較活躍；1.00 mg/L敵百蟲(chóng)浸浴后，24 h觀察發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體有少量脫落，仍有少量蟲(chóng)體存活；2.00 mg/L敵百蟲(chóng)浸浴1 h可以有效抑制中華湖蛭的活性，且鰱魚(yú)活動(dòng)正常，撈至清水中24 h后蟲(chóng)體全部死亡脫落；4.00 mg/L敵百蟲(chóng)浸浴20 min后鰱魚(yú)出現(xiàn)不適反應(yīng)，主要表現(xiàn)為體色變淡發(fā)白，迅速撈至清水中后很快恢復(fù)正常，24 h后檢查發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體已全部死亡脫落。

12.50、25.00、50.00 mg/L生石灰浸浴1 h對(duì)中華湖蛭的殺滅效果較差，24 h后觀察發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體仍比較活躍；100.00 mg/L生石灰浸浴1 h可以有效抑制中華湖蛭的活性，且鰱魚(yú)活動(dòng)正常，撈至清水中24 h后蟲(chóng)體全部死亡脫落；200.00 mg/L生石灰浸浴5 min后鰱魚(yú)出現(xiàn)不適反應(yīng)，主要表現(xiàn)為活動(dòng)劇烈，體色變淡發(fā)白，迅速撈至清水中后很快恢復(fù)正常，24 h后檢查發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體僅有部分死亡脫落，少數(shù)蟲(chóng)體仍然存活。

綜上所述，對(duì)于感染中華湖蛭的鰱鳙魚(yú)建議使用400.00 mg/L 川楝子、2.00 mg/L敵百蟲(chóng)、100.00 mg/L生石灰浸浴1 h后撈至清水中暫養(yǎng)，可對(duì)中華湖蛭起到較好的殺滅作用，但對(duì)鰱鳙魚(yú)安全。

3討論

隨著潔水漁業(yè)的發(fā)展，我國(guó)大多數(shù)湖泊水庫(kù)以放養(yǎng)鰱鳙魚(yú)為主，2019—2022年在浙江地區(qū)多個(gè)水質(zhì)清澈的水庫(kù)中出現(xiàn)中華湖蛭感染病例，對(duì)鰱鳙魚(yú)養(yǎng)殖的危害較大。從病害流行情況來(lái)看，中華湖蛭寄生在大規(guī)格鰱、鳙魚(yú)（平均體重≥3 kg/尾）鰓弓和鰓絲基部，感染率在90%以上，感染強(qiáng)度大小不等，一般感染強(qiáng)度為8～20條/尾。目前發(fā)現(xiàn)中華湖蛭主要感染鳙魚(yú)，其他魚(yú)類幾乎不感染，僅發(fā)現(xiàn)在少數(shù)大眼華鳊（Sinibrama macrops）鰓上有少量寄生。每年10月底或11月初會(huì)在鰱、鳙魚(yú)鰓上偶見(jiàn)發(fā)生，3月份鰱鳙魚(yú)鰓上就有肉眼可見(jiàn)、數(shù)量不等的幼蟲(chóng)；4—6月份為感染高峰，主要觀察到中華湖蛭的成蟲(chóng)，個(gè)體較大，感染強(qiáng)度高的達(dá)到50～60條/尾；7月份高溫以后自行脫落。調(diào)查發(fā)現(xiàn)水溫在27 ℃以上時(shí)鰱鳙魚(yú)鰓絲寄生的中華湖蛭數(shù)量明顯減少，僅2～4條/尾。中華湖蛭成蟲(chóng)背面深褐色，腹面灰白，與魚(yú)鰓顏色較為相似，而且寄生在鰓瓣之間，不容易被發(fā)現(xiàn)。寄生處魚(yú)鰓表皮組織受到破壞，出現(xiàn)發(fā)白、潰爛的現(xiàn)象，有的魚(yú)鰓甚至出現(xiàn)空洞，引起貧血和繼發(fā)感染，影響鰱鳙魚(yú)正常生長(zhǎng)。

大水面魚(yú)類的寄生蟲(chóng)防控一直是漁業(yè)病害防控中的難點(diǎn)。有關(guān)魚(yú)蛭的藥物防控報(bào)道較少，唐毅等［6］對(duì)寬體金線蛭（Whitmania pigra）幼體的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，寬體金線蛭幼蛭對(duì)伊維菌素、苯扎溴銨、戊二醛敏感，而對(duì)高錳酸鉀、聚維酮碘、二氧化氯不敏感。洪萬(wàn)樹(shù)等［7］研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用1 mg/L敵百蟲(chóng)、100～200 mg/L福爾馬林或者二者混合使用對(duì)大彈涂魚(yú)（Boleophthalmus pectinirostris）寄生魚(yú)蛭的殺滅效果較好，而硫酸銅對(duì)其無(wú)明顯殺滅作用，且高濃度硫酸銅會(huì)使宿主產(chǎn)生不適反應(yīng)。王永波等［8］認(rèn)為1? mg/L的敵百蟲(chóng)和福爾馬林對(duì)石斑魚(yú)（Epinephelus sp.）魚(yú)蛭的殺滅效果有限，0.05 mL/L 阿維菌素可以有效殺滅石斑魚(yú)魚(yú)蛭。敵百蟲(chóng)作為一種有機(jī)磷酯殺蟲(chóng)劑，因其高效、低毒、低殘留性而被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖類寄生蟲(chóng)的防治，但其長(zhǎng)期使用仍會(huì)對(duì)魚(yú)體造成一定的毒害作用，會(huì)產(chǎn)生魚(yú)體殘留和水質(zhì)污染等問(wèn)題［9-10］。另外，王永波等［8］發(fā)現(xiàn)南美白對(duì)蝦（Penaeus vanname）可以攝食1～4 cm的魚(yú)蛭，石斑魚(yú)和蝦苗混養(yǎng)可以一定程度上防止魚(yú)蛭的暴發(fā)。

有別于池塘或小水體魚(yú)蛭的用藥，對(duì)水庫(kù)鰱、鳙魚(yú)寄生的中華湖蛭防控，從經(jīng)濟(jì)和可操作的角度來(lái)看，將鰱、鳙魚(yú)進(jìn)行短時(shí)間浸浴的效果最好。為了保證魚(yú)產(chǎn)品的安全性，筆者建議使用400.00 mg/L川楝子、100.00 mg/L生石灰浸浴1 h進(jìn)行殺蟲(chóng)后清水暫養(yǎng)，一般蟲(chóng)體會(huì)死亡脫落。川楝子所含的川楝素對(duì)寄生蟲(chóng)腸肌產(chǎn)生興奮、麻痹的作用，最終導(dǎo)致蟲(chóng)體能量不足，附著能力降低，繼而被驅(qū)離于體外［11］。王高學(xué)等［12］研究22種植物提取液以及川楝素等化合物對(duì)金魚(yú)指環(huán)蟲(chóng)的殺滅效果，發(fā)現(xiàn)川楝素對(duì)指環(huán)蟲(chóng)的殺滅作用最強(qiáng)。王大鵬等［13］研究發(fā)現(xiàn)將刺激隱核蟲(chóng)（Cryptocaryon irritans）包囊置于濃度60 mg/L、由苦楝樹(shù)葉和其他幾味中草藥制成的復(fù)方藥劑中浸浴4.0～4.5 h，可徹底將蟲(chóng)體殺滅。生石灰的作用機(jī)理是通過(guò)提高水體pH來(lái)殺滅水體中的寄生蟲(chóng)或細(xì)菌等，最終在水中形成CaCO3 ，因而它是無(wú)殘留、綠色環(huán)保的水產(chǎn)常用藥物之一［14］。雖然川楝子、生石灰等短時(shí)間浸浴對(duì)中華湖蛭具有較好的殺滅效果，但無(wú)法對(duì)庫(kù)區(qū)感染中華湖蛭的鰱鳙魚(yú)進(jìn)行防控。因此，今后仍需要進(jìn)一步研究中華湖蛭綠色安全的生態(tài)防控技術(shù)，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期和有效控制。

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