馬丁凌　羅序梅　唐意涵　梁毛迪　李夢環(huán)　侯艷婷　孫超月　周耐明　張君

摘要：目的 研究長鏈脂肪酸C17∶0對GPR40受體的激活作用，并探討其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制。方法 在體外培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞的基礎(chǔ)上，免疫熒光結(jié)合共聚焦顯微鏡檢測受體膜定位和內(nèi)吞情況；通過多功能酶標(biāo)儀檢測Ca2+流的強(qiáng)弱；Western Blot檢測ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)果 免疫熒光結(jié)果顯示：C17∶0可通過招募β-arrestin 2介導(dǎo)GPR40內(nèi)吞；胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員檢測結(jié)果證實(shí)：長鏈脂肪酸C17∶0可作用于GPR40引起胞內(nèi)Ca2+濃度升高；Western Blot結(jié)果顯示：C17∶0可作用于GPR40誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化。結(jié)論 C17∶0是GPR40的內(nèi)源性配體，通過激活Gaq和Gai/o蛋白介導(dǎo)的信號通路，引起胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員及ERK1/2的磷酸化。

關(guān)鍵詞：C17∶0；GPR40；Gaq和Gai/o；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

中圖分類號：R34中圖分類號文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

Study on the effect of C17∶0 activating GPR40 receptor and the molecular

mechanism of signal transduction

MA? Dingling1，LUO? Xumei2，TANG? Yihan1，LIANG? Maodi1，LI? Menghuan1，HOU? Yanting1，SUN? Chaoyue1，ZHOU? Naiming2，ZHANG? Jun1*

（1 School of Medicine，Shihezi University/Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases， Shihezi，Xinjiang

832000， China; 2 School of Life Sciences， Zhejiang University， Hangzhou，Zhejiang 310000， China）

Abstract： ?Objective To study the activation of long chain fatty acid C17∶0 on GPR40 receptor and explore its molecular mechanism of signal transduction. Methods On the basis of HEK293T cells cultured in vitro， the localization and endocytosis of receptor membrane were detected by immunofluorescence combined with confocal microscopy; The strength of Ca2+flow was detected by a multifunctional microplate reader; The phosphorylation level of ERK1/2 was detected by Western Blot. Results The results of immunofluorescence showed that GPR40 endocytosis could be mediated by recruitment of β-arrestin2 at C17∶0; The results of intracellular Ca2+mobilization test confirmed that long chain fatty acid C17∶0 could act on GPR40 to increase intracellular Ca2+concentration; Western Blot results showed that C17∶0 could act on GPR40 to induce ERK1/2 phosphorylation. Conclusion C17∶0 is an endogenous ligand of GPR40， which can cause intracellular Ca2+mobilization and ERK1/2 phosphorylation by activating Gaq and Gai/o protein mediated signal pathways.

Key words： C17∶0;GPR40;Gaq and Gai/o;signal transduction

2型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus， T2DM）是一種復(fù)雜的代謝性疾病，以胰島素抵抗（Insulin Resistance， IR）和β細(xì)胞損傷導(dǎo)致的高血糖為標(biāo)志［1］。肥胖是導(dǎo)致T2DM 發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素［2-3］。有研究表明，肥胖后血漿游離脂肪酸（Free Fatty Acids， FFAs）含量升高是導(dǎo)致T2DM發(fā)生的關(guān)鍵原因［4-5］。但也有研究發(fā)現(xiàn)：并不是體內(nèi)所有FFAs都表現(xiàn)出促進(jìn)T2DM發(fā)生發(fā)展的作用，部分FFAs含量的增加具有改善IR和降低血糖的作用，其中包括奇數(shù)鏈脂肪酸［6］。

有文獻(xiàn)報(bào)道，肥胖個(gè)體血漿奇數(shù)鏈脂肪酸含量降低，并與IR水平及T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)［7-9］。C17∶0是一種含有17個(gè)碳原子基團(tuán)的飽和脂肪酸，屬于奇數(shù)鏈脂肪酸家族。有研究顯示，與同為奇數(shù)鏈脂肪酸的C15∶0相比，C17∶0在機(jī)體中的含量更高，并表現(xiàn)出與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性［10］。此外，C17∶0可顯著改善體內(nèi)葡萄糖耐受能力，并降低高糖刺激下血漿胰島素的分泌，從而發(fā)揮改善T2DM進(jìn)展過程中葡萄糖不耐受的作用［11］。然而，C17∶0通過何種機(jī)制發(fā)揮上述作用，目前尚不明確。

FFAs作為人體重要的能量物質(zhì)和信號分子，主要通過G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors， GPCRs）發(fā)揮調(diào)節(jié)代謝等生理作用［12］。目前已知與FFAs有關(guān)的GPCRs有5種，包括GPR40、GPR43、GPR41、GPR120和GPR84，其中長鏈脂肪酸可通過GPR40發(fā)揮作用［13-14］。GPR40主要在胰島β細(xì)胞中高表達(dá)，其激活被證明能夠促進(jìn)胰島素分泌和改善葡萄糖耐量［15］。大量研究表明， GPR40可參與到多條G蛋白通路中，包括Gαs，Gαi/o和Gαq途徑［16］。開發(fā)合成的GPR40激動(dòng)劑已經(jīng)作為T2DM的治療靶點(diǎn)［17］。已知偶數(shù)長鏈脂肪酸是GPR40受體的配體，然而奇數(shù)長鏈脂肪酸C17∶0是否可通過激活細(xì)胞膜上GPR40受體，發(fā)揮調(diào)控糖代謝的重要作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究在體外培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過免疫熒光、細(xì)胞內(nèi)鈣流測定以及ERK1/2磷酸化檢測等方法，對長鏈脂肪酸C17∶0激活GPR40受體的作用，以及可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行研究，為一步闡明C17∶0發(fā)揮調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝作用的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自HyClone（Beijing， China）。Opti-MEMI還原血清培養(yǎng)基購自Invitrogen（Carlsbad， CA， USA）。C17∶0、GPR40特異性拮抗劑GW1100、Gαi/o抑制劑PTX、PKA抑制劑H89購自Sigma-Aldrich（St. Louis， MO， USA）。Ca2+熒光探針Fura-2/AM購自Dojindo（Kyushu， Japan）。抗磷酸化ERK1/2（Thr202/Tyr204）和抗ERK1/2抗體購自Cell signaling Technology（Danvers， MA， USA）。Gαq抑制劑FR900359、pEGFP-N1載體及HEK293T細(xì)胞系均由周耐明教授（浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）提供。

1.2 分子克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

Flag-GPR40由周耐明教授實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)測序驗(yàn)證無誤，將其作為模板PCR擴(kuò)增GPR40，用于PCR克隆的引物見表1。獲得的PCR產(chǎn)物定向插入到pEGFP-N1載體的HindIII和BamHI位點(diǎn)。杭州擎科生物科技有限公司對上述所有結(jié)構(gòu)進(jìn)行測序，以驗(yàn)證序列和方向。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人胚胎腎293T（HEK293T）細(xì)胞采用含10%滅活FBS、100μg·mL-1的青霉素-鏈霉素和1%谷氨酰胺（Invitrogen， CA）的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃，含5%CO2，濕度一定的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。GPR40質(zhì)粒構(gòu)建體是根據(jù)使用說明，使用YEASEN轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。

1.4 綠色熒光蛋白定位分析

1.4.1 受體膜定位和內(nèi)吞分析

轉(zhuǎn)染后24 h內(nèi)分別將6孔板中瞬時(shí)表達(dá)GPR40-EGFP的HEK293T細(xì)胞接種于底部放置了圓形玻璃片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染后36～48 h內(nèi)進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。首先，棄掉舊的細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS溶液潤洗一次，在37℃下指定時(shí)間內(nèi)下加入C17∶0處理后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次；然后在室溫下用4%多聚甲醛固定10 min，移除固定液后PBS漂洗兩次，加入含有DAPI的PBS溶液染色5 min。棄去后再用PBS溶液潤洗兩次，然后使用細(xì)長的鑷子夾出圓形玻片，將其反蓋在滴有5μL 50%甘油的載玻片上。制好的片子使用Fluoview軟件（Olympus， Tokyo Japan）獲得圖像。激發(fā)在488 nm處進(jìn)行，熒光檢測使用505～530 nm帶通濾波器。使用ImageJ軟件通過線掃描強(qiáng)度觀察熒光分布情況。

1.4.2 β-arrestin招募研究

對于研究受體對于β-arrestin1/2的招募情況，將含有GPR40-Flag的質(zhì)粒和含有β-arrestin1/2的pEGFP-N1質(zhì)粒以3∶1轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞，其余步驟同上。在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞，拍攝并儲(chǔ)存。

1.5 細(xì)胞內(nèi)Ca2+測量

使用熒光鈣指示劑Fura-2/AM檢測細(xì)胞內(nèi)鈣流量。加入含有0.02% EDTA的PBS緩沖液消化表達(dá)受體GPR40的HEK293T細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液。用Hanks緩沖液洗滌2次并懸浮。然后加入3 μL Fura-2-AM和1 μL Pluronic F-127表面活性劑，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min，用Hanks緩沖液洗滌2次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入不同濃度的配體，通過340 nm和380 nm的激發(fā)波長比測量68 s內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)鈣通量。必要時(shí)，在實(shí)驗(yàn)開始之前用各種抑制劑預(yù)處理細(xì)胞。不同抑制劑作用濃度分別為：GW1100，10 μmol·L-1；AH7614，10 μmol·L-1；PTX，100 ng·mL-1；FR900359，1 μmol·L-1；H89，10μmol·L-1。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析

將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GPR40的HEK293T細(xì)胞接種在24孔板中，并在無血清培養(yǎng)基中饑餓1 h，以去除本底反應(yīng)。在用C17∶0刺激相應(yīng)時(shí)間后，加入含有蛋白酶抑制劑（Roche Applied Science）的90μL裂解緩沖液（Beyotime，China），4℃在搖床上裂解1h，然后刮除。使用SDS-PAGE（10%）對總細(xì)胞裂解液進(jìn)行大小分級，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜（Millipore SCHVU01RE）。在室溫下，將膜在含有0.05%Tween 20和5%脫脂奶粉的TBST中封閉1 h，然后用兔單克隆抗pERK1/2抗體（Cell Signaling Technology， USA）和抗兔辣根過氧化物酶結(jié)合二級抗體（Beyotime，China）進(jìn)行檢測。使用抗總ERK1/2（1∶2 000）單克隆抗體作為蛋白質(zhì)負(fù)載的對照。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光基質(zhì)（Cell Signaling Technology）檢測免疫反應(yīng)帶，然后使用Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon，Shanghai， China）掃描膜。ERK1/2磷酸化水平標(biāo)準(zhǔn)化為ERK1/2總量。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用 SPSS 26.0軟件對錄入數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)首先需進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)）、不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)選擇非參數(shù)秩和檢驗(yàn)（數(shù)據(jù)以中位數(shù)呈現(xiàn)）、多組間數(shù)據(jù)相互比較采用單因素方差分析。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長鏈脂肪酸C17∶0可作為GPR40內(nèi)源性配體

已有研究表明，內(nèi)吞是GPCRs激活的重要標(biāo)志［18］，本研究將C端融合EGFP的GPR40真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞后，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡檢測GPR40的定位情況，結(jié)果顯示：在無激動(dòng)劑存在的情況下，GPR40能夠很好地定位于細(xì)胞膜上（圖1A）。轉(zhuǎn)染的GPR40真核表達(dá)質(zhì)粒后，用100μmol·L-1 C17∶0的處理HEK293T細(xì)胞，分別在處理后第5、20、50 min，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡檢測GPR40的定位情況，結(jié)果顯示：GPR40受體均發(fā)生了由細(xì)胞膜至細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)吞現(xiàn)象，內(nèi)吞呈點(diǎn)狀分布且具有時(shí)間和劑量依賴性（圖1B）。β-arrestin是GPCRs轉(zhuǎn)運(yùn)和脫敏的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子，β-arrestin的招募是GPCRs內(nèi)吞最為典型的機(jī)制［19］，本研究結(jié)果顯示：在C17∶0刺激5min和30min后，β-arrestin2從細(xì)胞質(zhì)招募至細(xì)胞膜上（圖1C）。

2.2 長鏈脂肪酸C17∶0可通過激活GPR40，促進(jìn)細(xì)胞的Ca2+動(dòng)員

Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，參與包括激素分泌，肌肉功能，神經(jīng)傳遞，細(xì)胞分裂和分化，以及代謝調(diào)節(jié)等生理過程［20-21］。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+的瞬態(tài)變化在GPCRs介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了明確C17∶0激活GPR40后是否影響細(xì)胞的Ca2+流，本研究進(jìn)行了Ca2+動(dòng)員檢測實(shí)驗(yàn)，如圖2A所示，過表達(dá)GPR40的HEK293T細(xì)胞在C17∶0的作用下，可誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+濃度的快速增加，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。并且，在給予HEK293T細(xì)胞GPR40特異性拮抗劑GW1100預(yù)處理后，再進(jìn)行C17∶0刺激，對細(xì)胞內(nèi)Ca2+的活化情況進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)：GW1100可顯著抑制C17∶0對細(xì)胞Ca2+活化的影響（圖2B）。

2.3 長鏈脂肪酸C17∶0可通過激活GPR40，促進(jìn)ERK1/2信號通路活化

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2的激活，被認(rèn)為是GPCRs是否激活的標(biāo)志性事件［22-23］。

本研究在過表達(dá)GPR40的HEK293T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，C17∶0刺激可誘導(dǎo)ERK1/2的磷酸化，且呈濃度依賴性（圖3A）。時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：C17∶0刺激30min時(shí)，GPR40介導(dǎo)的ERK1/2磷酸化反應(yīng)最強(qiáng)，隨著時(shí)間的延長，反應(yīng)降低（圖3C）。給予GPR40特異性拮抗劑GW1100處理后，C17∶0對ERK1/2磷酸化的促進(jìn)作用被顯著抑制（圖3E）。

2.4 長鏈脂肪酸C17∶0可通過激活GPR40介導(dǎo)Gαq和Gαi/o蛋白偶聯(lián)的信號通路

最初的研究發(fā)現(xiàn)，GPR40受體可與Gaq/11蛋白偶聯(lián)激活PI-PLC，引起Ca2+活化，以及通過DAG/PKC途徑激活ERK1/2磷酸化。也有研究證實(shí)Gai/o蛋白也參與GPR40介導(dǎo)的ERK1/2激活［24-25］。此外，有研究表明，GPR40可以與Gas蛋白有效地偶聯(lián)以增加cAMP濃度［26］。

本研究通過檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+的活化情況，發(fā)現(xiàn)C17∶0通過GPR40介導(dǎo)的Ca2+的活化可以被Gαi/o抑制劑PTX部分抑制，被Gαq抑制劑FR900359幾乎完全抑制。進(jìn)一步確定G蛋白在調(diào)節(jié)GPR40介導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化中作用，發(fā)現(xiàn)Gαi/o抑制劑PTX和Gαq抑制劑FR900359均能顯著逆轉(zhuǎn)C17∶0對ERK1/2磷酸化的促進(jìn)作用（圖4）。

3 討論

游離脂肪酸作為體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)和信號分子，可通過GPCRs參與多種生理途徑［27-28］。長鏈脂肪酸受體GPR40被證明能夠促進(jìn)胰島素分泌和改善葡萄糖耐量，是非常重要的2型糖尿病靶點(diǎn)受體［29］。目前關(guān)于長鏈脂肪酸激活GPR40的機(jī)制研究主要集中在偶數(shù)鏈脂肪酸，有關(guān)奇數(shù)鏈脂肪酸C17∶0能否激活GPR40目前尚無研究報(bào)道。本研究在體外細(xì)胞水平上，通過對多個(gè)信號分子指標(biāo)的檢測，初步證實(shí)C17∶0可作為GPR40的內(nèi)源性配體，這為闡明C17∶0發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝作用的具體分子機(jī)制，提供了有力的支持。

配體誘導(dǎo)的受體內(nèi)吞在GPCRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)中具有重要功能，是介導(dǎo)細(xì)胞信號強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的關(guān)鍵機(jī)制，也是直接反映受體激活的關(guān)鍵因素［30-32］。本研究在對C17∶0介導(dǎo)的GPR40受體內(nèi)吞情況進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)：無配體刺激情況下，GPR40-EGFP主要位于細(xì)胞膜上，而在C17∶0處理后，GPR40-EGFP受體分布發(fā)生變化，集中在了細(xì)胞核周圍。β-arrestin是一類介導(dǎo)受體脫敏的重要可溶性蛋白質(zhì)，是GPCRs信號通路的重要調(diào)節(jié)因子。β-arrestin包括兩個(gè)成員：β-arrestin1和β-arrestin2。兩種亞型在氨基酸序列上高度相似，廣泛分布于各個(gè)組織中［33］。據(jù)報(bào)道，β-arrestin2作為支架蛋白分子在β-arrestins依賴性胰島素信號通路中發(fā)揮重要的作用，β-arrestin2可能作為一個(gè)潛在的靶分子去應(yīng)對IR和T2DM［34］。已有研究表明，β-arrestin通常參與到受體的內(nèi)吞過程中［35］。我們的研究證實(shí)了在C17∶0介導(dǎo)的GPR40的內(nèi)吞中，β-arrestin2被招募到細(xì)胞膜上。

Ca2+濃度的變化是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要步驟，本研究結(jié)果顯示，C17∶0處理細(xì)胞后能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣流的釋放。在對其具體機(jī)制研究后發(fā)現(xiàn)，Gαq抑制劑FR900359處理幾乎可完全阻斷C17∶0介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣流的產(chǎn)生，而Gαi/o抑制劑PTX預(yù)處理，也部分阻斷了C17∶0介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣流的活化。ERK1/2是調(diào)控細(xì)胞生長、分化、增殖和凋亡等生理功能的重要因子。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C17∶0激活GPR40后可顯著促進(jìn)ERK1/2的磷酸化，而Gαi/o抑制劑PTX和Gαq抑制劑FR900359均能顯著逆轉(zhuǎn)C17∶0對ERK1/2磷酸化的促進(jìn)作用。以上結(jié)果表明，C17∶0激活GPR40后介導(dǎo)了Gαq和Gαi/o蛋白雙偶聯(lián)的信號通路。

總之，在本研究中，我們首次探討了長鏈脂肪酸C17∶0介導(dǎo)GPR40的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，證實(shí)了C17∶0可作為內(nèi)源性配體介導(dǎo)介導(dǎo)GPR40與Gaq和Gai/o蛋白雙偶聯(lián)，激活Ca2+信號通路以及ERK1/2信號級聯(lián)。本研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步闡明奇數(shù)鏈脂肪酸激活GPR40受體的作用機(jī)制，也為進(jìn)一步以奇數(shù)鏈脂肪酸為靶點(diǎn)，開發(fā)新型降糖藥物提供了新的理論依據(jù)。

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收稿日期：中文收稿日期2022-11-06

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目（82160156，81960152，82260162），新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)項(xiàng)目子課題（2021AB028，2022AB022）

作者簡介：馬丁凌（1996—），女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

*通信作者：張君（1979—），男，教授，從事肥胖、炎癥及代謝相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)制研究，e-mail： zhangjunyc@163.com。