郭健敏＊，張文強(qiáng)＊，鄧應(yīng)華，蒙飛彪，謝松強(qiáng)，梁純，楊威

（1.廣州灣區(qū)生物醫(yī)藥研究院，廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東省藥物非臨床評價研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中藥非臨床評價分中心，廣東省創(chuàng)新藥物評價與研究工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510990；2.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南 開封 475000；3.香港科技大學(xué)生命科學(xué)部，香港 999077）

芩香清解口服液（Qinxiang Qingjie oral solution，QXQJ）為已上市的中成藥，來源于蒙藥，主要由黃芩、廣藿香、蟬蛻、大黃、生石膏和葛根等12 味中藥制成，具有疏散風(fēng)熱、清瀉里熱、解毒利咽的功效，臨床上用于小兒急性上呼吸道感染表里俱熱證。應(yīng)用兒科人群主要劃分為3 個階段：第1 階段：6 月齡～3 歲，一次5 mL；第2 階段：3～7 歲，一次10 mL；第3 階段：7～14 歲，一次15 mL。前期藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，QXQJ 具有明顯的止痛、解熱、鎮(zhèn)咳、祛痰、消炎和抗菌等作用，針對EV71 病毒引起的幼齡小鼠肌肉肌纖維損傷及炎癥細(xì)胞浸潤亦具有明顯的治療效果［1］。急性呼吸道感染是兒科最為常見的疾病，好發(fā)于≤5歲兒童。因此，本研究選擇出生后4～21日齡（postnatal day 4～21，PND4～PND21）（相當(dāng)于≤2歲嬰幼兒時期）幼齡大鼠進(jìn)行給藥，恢復(fù)期選擇PND22～PND42（相當(dāng)于2～12 歲兒童時期）［2-3］，系統(tǒng)考察重復(fù)給予PND4大鼠QXQJ 18 d后的發(fā)育毒性，并根據(jù)產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，判斷是否有與QXQJ 相關(guān)的特有毒性或與年齡有關(guān)的敏感性差異，為臨床上6 月齡～2 歲兒科人群應(yīng)用QXQJ提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和主要儀器

選用由孕15 日齡健康孕大鼠自然分娩的仔大鼠128 只，雌雄各半，體重7～11 g，孕大鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于廣東萊恩醫(yī)藥研究院SPF 級動物房，自由攝食、飲水，動物房環(huán)境溫度、日溫差、濕度等均符合要求。本研究實(shí)施經(jīng)廣東萊恩醫(yī)藥研究院動物福利與倫理委員會審核并批準(zhǔn)（編號：IA-SE2019037-01）。

QXQJ（廣州一品紅制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20168003，批號：SY10719001）。血液學(xué)和凝血功能檢測試劑（上海長島生物科技有限公司）；血液生化檢測試劑（浙江伊利康生物技術(shù)有限公司）；免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、IgA、IgE、IgM、生長激素（growth hormone，GH）、生長激素釋放肽（growth hormone releasing peptide，GHRP）ELISA 檢測試劑盒（美國R&D Systems）。InAlyzer 型雙能X 射線動物身體成分分析系統(tǒng)（韓國Medikors Inc）；7180 型全自動生化分析儀（日本日立公司）；C3510 型全自動凝血分析儀（北京普利生儀器有限公司）；ELx808 型酶標(biāo)分析儀（美國BioTek）；DM3000 型生物顯微鏡（德國LEICA）。

1.2 動物分組和給藥

于PND2選擇每窩活仔數(shù)≥10只的整窩仔大鼠，將每窩仔大鼠調(diào)整為雌雄各4 只，采用交叉撫育法進(jìn)行分組［4-5］，隨機(jī)重新將所有幼仔組窩撫養(yǎng)，將來源于不同窩的幼仔組成新窩（新窩中不含原窩幼仔），重組好的新窩整窩被分配到一個組別。實(shí)驗(yàn)共分成4 組，即溶劑對照組及QXQJ 3.45，10.35 和28.05 g·kg-1組，每組4 窩，每窩8 只，雌雄各半，共計(jì)16窩128只。

考慮到藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝等情況，在進(jìn)行人用劑量外推時需重點(diǎn)關(guān)注物種和年齡差異［6］。本研究在體表面積等效劑量折算法基礎(chǔ)上，以相應(yīng)年齡幼齡大鼠與成年大鼠體表面積的比值作為系數(shù)加乘，設(shè)QXQJ 給藥劑量（以生藥計(jì)）分別為3.45，10.35 和28.05 g·kg-1，約相當(dāng)于1 歲兒童臨床擬用量（每天15 g生藥量）的1，3和8倍。各組仔大鼠于PND4開始ig給藥，給藥容積為5 mL·kg-1，每天1 次，連續(xù)18 d（PND4～PND21）。溶劑對照組給予等體積純水。

1.3 檢測指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)期間每天觀察1次大鼠的一般狀況，每3 d稱量1 次仔大鼠體重，并在此期間對仔大鼠的生長發(fā)育、神經(jīng)反射、自發(fā)行為和體格進(jìn)行系統(tǒng)檢查。仔大鼠離乳后，每周測定1 次攝食量；于PND22對各組16只活體仔大鼠（雌雄各半）全身骨骼進(jìn)行檢查，于PND42對各組其余16 只股骨骨骼進(jìn)行檢查。于PND22和PND42將檢查后的仔大鼠處死，用于血液學(xué)及凝血、血液生化學(xué)、免疫及生長激素和組織病理學(xué)檢查，具體毒性檢測指標(biāo)見表1。

Tab.1 Toxicity detection indexes of juvenile rats after ig administration of Qinxiang Qingjie oral solution (QXQJ)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

給藥期和恢復(fù)期，正常對照和QXQJ 3.45 g·kg-1組幼齡大鼠一般狀況均未見異常。QXQJ 10.35 g·kg-1組于給藥期PND5～PND16有19 只幼齡大鼠出現(xiàn)黃棕色軟便或稀便，PND17全部恢復(fù)；于PND14～PND18發(fā)現(xiàn)5只腹部膨大，PND19全部恢復(fù)。QXQJ 28.05 g·kg-1組幼齡大鼠于PND6～PND21有32 只出現(xiàn)黃棕色軟便或稀便，于PND8～PND21有32 只腹部膨大，停藥起（PND22）全部恢復(fù)。

2.2 體重

QXQJ 28.05 g ·kg-1組雌雄幼齡大鼠于PND7～PND27體重均顯著低于溶劑對照組（P＜0.05），于PND33起雌雄幼齡大鼠體重與溶劑對照組比均未見明顯差異，表明QXQJ 28.05 g·kg-1重復(fù)給藥可使幼齡大鼠體重在給藥期明顯偏低，停藥恢復(fù)1周后基本恢復(fù)正常（圖1）。

Fig.1 Effect of QXQJ on body mass of juvenile rats.The juvenile SD rats（n=32，half male and half female）in each group were ig given pure water，QXQJ 3.45，10.35 and 28.05 g·kg-1，respectively，once a day，after postnatal day 4（PND4）for 18 d.Then，the remaining rats（n=16，half male and half female）in each group had their observation resumed for 3 weeks.A：female；B：male.±s，n=16 in period PND4-PND21，n=8 in period PND24-PND42.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group.

2.3 攝食量

停藥后測定各組幼齡大鼠攝食量。結(jié)果表明，與溶劑對照組相比，QXQJ 28.05 g·kg-1組PND40雌性幼齡大鼠攝食量顯著降低（P＜0.05），但變化幅度＜20%，且對體重未見影響，認(rèn)為此現(xiàn)象的臨床指導(dǎo)意義較小。其余時間點(diǎn)各組雌雄幼齡大鼠攝食量均未見明顯變化（圖2）。

Fig.2 Effect of QXQJ on food intake of juvenile rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：female；B：male.±s，n=8.＊P＜0.05，compared with vechicle control group.

2.4 生長發(fā)育、神經(jīng)反射和自發(fā)行為

QXQJ 3.45，10.35 和28.05 g·kg-1組幼齡大鼠生長發(fā)育、神經(jīng)反射和自發(fā)行為檢查指標(biāo)均已達(dá)同時期標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)標(biāo)大鼠數(shù)量與溶劑對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）。

Tab.2 Effect of QXQJ on growth development，neural reflex and spontaneous behavior of juvenile rats

2.5 體格

與溶劑對照組相比，QXQJ 28.05 g·kg-1組雌雄幼齡大鼠于PND7～PND21頂臀長、尾長和四肢總長均顯著降低（P＜0.05）；PND7～PND28胸圍亦明顯降低（P＜0.05），表明QXQJ 28.05 g·kg-1重復(fù)給藥可致幼齡大鼠體格在給藥期明顯偏低，停藥恢復(fù)1周后基本恢復(fù)正常（圖3）。

Fig.3 Effect of QXQJ on physical development of juvenile rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：top hip length；B：tail length；C：total length of limbs；D：chest circumference；1：female；2：male.±s，n=16 in period PND4-PND21，n=8 in period PND24-PND42.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group.

2.6 骨骼

與溶劑對照組相比，QXQJ 28.05 g·kg-1組PND22雌雄幼齡大鼠全身骨骼骨比重（bone mineralspecific gravity，BMG）和骨密度（bone mineral density，BMD）均顯著低于溶劑對照組（P＜0.05），QXQJ 3.45，10.35 和28.05 g·kg-1組PND22和PND42雌雄幼齡大鼠全身及股骨骨骼BMG 和BMD 均未見明顯差異，提示QXQJ 28.05 g·kg-1重復(fù)給藥可導(dǎo)致幼齡大鼠骨骼發(fā)育減緩，恢復(fù)期結(jié)束時已全部恢復(fù)正常（圖4）。

Fig.4 Effect of QXQJ on skeletal development of juvenile rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：BMG；B：BMD；1：female；2：male.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group.

2.7 血液學(xué)和凝血

結(jié)果（表3）顯示，與溶劑對照組相比，QXQJ 28.05 g·kg-1組PND22雌雄幼齡大鼠紅細(xì)胞（red blood cells，RBC）數(shù)和平均紅細(xì)胞血紅蛋白（mean corpuscular hemoglobin，MCH）水平均顯著降低（P＜0.05）；QXQJ 10.35 g·kg-1組PND22雌性幼齡大鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞（reticulocytes，RET）數(shù)顯著升高（P＜0.05）；各劑量組凝血指標(biāo)均未見明顯差異。提示QXQJ 28.05 g·kg-1組雌雄幼齡大鼠RBC 和MCH雖降低，但變化幅度較小，未見劑量-毒性關(guān)系?？紤]到同時期該幼齡大鼠體重小于溶劑對照組，認(rèn)為幼齡大鼠消化系統(tǒng)功能尚未發(fā)育完善導(dǎo)致其體重減輕和生理性貧血。

Tab.3 Effect of QXQJ on hematology and coagulation of juvenile rats

2.8 血液生化

與溶劑對照組相比，QXQJ 3.45，10.35 或28.05 g·kg-1組PND22或PND42幼齡大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）顯著降低（P＜0.05）；QXQJ 28.05 g·kg-1組PND22雌雄幼齡大鼠甘油三脂（triglycerides，TG）均顯著升高（P＜0.05），PND22雄性幼齡大鼠總膽固醇（cholesterol，CHOL）顯著升高（P＜0.05）；提示肝功能相關(guān)指標(biāo)（GPT，GOT，ALP 和GLDH）在各劑量組出現(xiàn)散在性差異，未見劑量-毒性關(guān)系，判斷為幼齡大鼠生長發(fā)育過程中正常的生理波動；QXQJ 28.05 g·kg-1組幼齡大鼠TG 和CHOL 有升高現(xiàn)象，停藥3 周后未見相關(guān)性變化，判斷為幼齡大鼠哺乳期正常的生理變化（表4）。

Tab.4 Effect of QXQJ on blood biochemistry of juvenile rats

2.9 免疫和生長激素

與溶劑對照組相比，QXQJ 3.45，10.35 和28.05 g·kg-1組雌雄幼齡大鼠PND22和PND42免疫和生長激素檢測指標(biāo)均未見明顯差異（表5）。

Tab.5 Effect of QXQJ on immunity and growth hormone of juvenile rats

2.10 組織病理

結(jié)果（圖5）顯示，PND22和PND42末次處理后，HE 染色檢查溶劑對照組和QXQJ 28.05g·kg-1組幼齡大鼠腦、心和肝等組織病理變化，均未見相關(guān)性異常變化。

Fig.5 Effect of QXQJ on histopathology changes of juvenile rats by HE staining.See Fig.1 for the rat treatment.

3 討論

QXQJ已上市多年，相關(guān)臨床研究表明，其在治療小兒急性上呼吸道感染表里俱熱證方面，疾病療效、證候療效均不劣于奧司他韋，且用于兒童人群時不良反應(yīng)少，安全性良好［7-8］。本研究中重復(fù)ig給予3 個劑量的QXQJ 后，QXQJ 10.35 和28.05 g·kg-1組幼齡大鼠在給藥期間均出現(xiàn)不同程度的黃棕色軟便或稀便及腹部膨大等癥狀，28.05 g·kg-1劑量組較為明顯，繼而出現(xiàn)體重、體格和骨骼檢查結(jié)果明顯低于溶劑對照組；幼齡大鼠消化道不良癥狀在停藥/離乳后（PND22）全部恢復(fù)，體重和體格在停藥恢復(fù)1 周后基本恢復(fù)正常，骨骼發(fā)育指標(biāo)在恢復(fù)期末與溶劑對照組相比亦無明顯差異。上述不良反應(yīng)具有群體效應(yīng)和持續(xù)性，與臨床研究結(jié)果“芩香清解口服液在改善小兒疾病病情、緩解呼吸道局部及全身癥狀的同時存在輕、中度消化不良反應(yīng)（嘔吐、腹瀉）”［7-8］類似，分析可能與QXQJ 所含組分大黃蒽醌類成分的瀉下作用相關(guān)［8-9］，但QXQJ的急性毒性和長期毒性研究結(jié)果提示，其對成年小鼠和大鼠給藥后均未發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)［10］。推測本研究中QXQJ 10.35 和28.05 g·kg-1組幼齡大鼠出現(xiàn)的不良反應(yīng)與其消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全相關(guān)，停藥后隨其消化系統(tǒng)逐漸發(fā)育完全可全部恢復(fù)。亦考慮到幼齡大鼠尚未離乳，胃容量有限，ig 給予QXQJ 28.05 g·kg-1劑量的濃稠藥液會直接影響其母乳攝入量，造成幼齡大鼠體重、體格和骨骼發(fā)育減緩，停藥后逐漸恢復(fù)正常水平。

兒科人群正處于生長發(fā)育的特殊時期，受晝夜節(jié)律、心理和生理機(jī)能尚未發(fā)育成熟以及病理因素的影響，其在藥物的吸收、分布、代謝、排泄等方面與成年人均存在差異，是臨床用藥風(fēng)險(xiǎn)評估中的敏感人群［11］。兒科用中藥的發(fā)育毒性研究存在諸多困難，如檢測項(xiàng)目繁瑣而檢測技術(shù)手段落后，進(jìn)而影響檢測效率；對幼齡動物的操作方法和護(hù)理經(jīng)驗(yàn)缺乏以及特殊氣味的中藥制劑引起哺乳期母鼠對幼鼠的排斥等因素導(dǎo)致的仔鼠生長發(fā)育減緩甚至死亡；部分中藥制劑的特殊性狀導(dǎo)致幼齡動物給藥操作難度增加，最終遠(yuǎn)不滿足試驗(yàn)的暴露劑量等［12-14］。本研究考慮上述難點(diǎn)對試驗(yàn)進(jìn)行以下優(yōu)化：①給藥期結(jié)束后，采用雙能X射線幼齡大鼠身體成分分析系統(tǒng)（世界衛(wèi)生組織金標(biāo)準(zhǔn)）對各組幼齡大鼠進(jìn)行BMG 及BMD 檢測分析，該系統(tǒng)主要優(yōu)勢為可進(jìn)行活體動物檢測分析，檢測完畢后仍可進(jìn)行其他活體檢查等［15］，可極大提升試驗(yàn)研究中的檢查精度和效率；②重新組窩后將新窩中粘有母鼠糞便和尿液的墊料輕輕涂抹在仔鼠身上和操作人員的手上，重新分配的仔鼠在新窩中至少待10 min 后將代乳母鼠放回籠內(nèi)，以增加代乳母鼠對新仔鼠的熟悉度及哺乳的迫切度；③為降低給予帶氣味的中藥制劑后引起母鼠對仔鼠的排斥概率，每次給予受試物后均輕柔的將仔鼠埋入提前用母鼠尿液淋濕的墊料中以掩蓋或減小母鼠對中藥氣味的識別。

綜上所述，QXQJ 連續(xù)給藥18 d，對PND4SD大鼠無不良反應(yīng)劑量（no observed adverse effect level，NOAEL）為3.45 g·kg-1（相當(dāng)于1歲兒童臨床擬用量的1 倍）；當(dāng)劑量為10.35 和28.05 g·kg-1（相當(dāng)于1 歲兒童臨床擬用量的3 和8 倍）時，可導(dǎo)致未斷乳幼齡大鼠出現(xiàn)黃棕色軟便或稀便及腹部膨大等消化不良癥狀，繼而影響其體格發(fā)育指標(biāo)，離乳后癥狀可緩解，停藥后基本恢復(fù)，表明QXQJ 對幼齡大鼠的生長發(fā)育無明顯毒理學(xué)影響。

本研究針對兒科用中藥發(fā)育毒性試驗(yàn)中存在的特定難點(diǎn)進(jìn)行了探索突破，選擇的檢測技術(shù)及操作方法在滿足中藥發(fā)育毒性評價需求的同時保證了幼齡大鼠系統(tǒng)發(fā)育檢測的精確性和效率，降低了外來因素對幼齡大鼠生長發(fā)育的影響，為兒科用中藥發(fā)育毒性試驗(yàn)研究提供科學(xué)的參考。