劉誠(chéng)誠(chéng), 彭建勇, 李 恒, 藺雨陽(yáng), 宋長(zhǎng)勇, 張春花

(1.攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院, 四川 攀枝花 617061;2.攀枝花市金沙林場(chǎng)同德管護(hù)站, 四川 攀枝花 617007)

花粉活力的高低由植物本身的基因型、花粉類型和遺傳特性所決定,其次還受溫度、濕度、光照等環(huán)境因子影響[1]?；ǚ刍盍Φ臋z測(cè)方法主要有離體萌發(fā)法、授粉法、染色法等。因離體萌發(fā)法操作較復(fù)雜,花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),不適宜花粉活力的快速檢測(cè)[2];而授粉法受環(huán)境因子影響大,近年來研究人員少有采用;染色法因具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),被廣泛采用。

在核桃的雜交育種工作中,父本的花粉活力直接影響雜交試驗(yàn)的成敗。肖真真等[3]和張煥玲等[4]都選用了TTC、I2-KI、MTT染色劑測(cè)定核桃花粉活力,認(rèn)為MTT更適宜快檢;但是在胡青等[5]、趙建建等[6]的核桃花粉活力研究中,TTC染色劑更為有效。因此,不同品種的核桃其花粉活力對(duì)染色劑的反應(yīng)不盡相同,參與雜交育種的品種,需要與之配套的花粉活力快檢方法。本地圓核桃是項(xiàng)目組長(zhǎng)期跟蹤觀測(cè)的優(yōu)良品種,具有果面光滑,縫合線不緊密,果仁飽滿,仁色米白,遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。是甄選出來供雜交育種的優(yōu)良親本,潛在育種價(jià)值高,掌握其花粉特性,摸索出花粉活力規(guī)律迫在眉睫。本試驗(yàn)通過本地圓核桃花粉活力的測(cè)定方法及花粉特性的研究,遴選花粉活力簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定方法,并探尋花粉活力變化規(guī)律和儲(chǔ)存方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及采集方法

試驗(yàn)材料為攀枝花本地優(yōu)良核桃,本地稱為圓核桃,樹齡10年,2018年開始結(jié)果,現(xiàn)處于盛果期,位于攀枝花市仁和區(qū)啊喇鄉(xiāng)起查那村。花粉采集選在無風(fēng)的早上,采集試驗(yàn)所需的雄花序,裝入硫酸紙袋中,放入保溫箱中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室陰干,待花藥自然開裂散粉后,收集于棕色小藥瓶中待測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1花粉活力測(cè)定方法的篩選

取少量收集到的花粉置于烘箱中,100 ℃烘干24 h,至花粉失活作為ck。另取收集到的新鮮花粉,選用醋酸洋紅染色法[7]、氯化三苯基四氮唑(TTC)法[8]、MTT染色法[9]、碘-碘化鉀(I2-KI)[10]染色法分別對(duì)花粉進(jìn)行活力測(cè)定后篩選出適宜檢測(cè)該花粉活力的方法。

1.2.2不同采集時(shí)期花粉活力測(cè)定

選擇散粉始期、散粉盛期、散粉末期采集花序,陰干后抖落收集花粉進(jìn)行活力測(cè)定。

1.2.3不同儲(chǔ)存方式花粉活力測(cè)定

將采集到的花粉分成兩份,一份置于常溫中存儲(chǔ),另一份置于冰箱中冷藏,定時(shí)對(duì)兩份花粉進(jìn)行活力測(cè)定。

1.2.4花粉泡水活力測(cè)定

取少量花粉模擬泡水噴施處理,將花粉混入清水中,并加入少量白糖,分別在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min測(cè)定泡水后的花粉活力。

1.2.5自然散粉活力測(cè)定

收集樹下掉落的核桃雄花序,常溫保存,定時(shí)對(duì)其進(jìn)行活力測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

花粉活力測(cè)定時(shí),每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)在顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野,每個(gè)視野觀察的花粉數(shù)不低于50粒。

花粉活力/%=(有活力的花粉數(shù)量/總花粉數(shù)量)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行多重比較。采用SPSS22.0軟件完成數(shù)據(jù)分析,Excel2019軟件完成制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活力測(cè)定染色劑的比較與選擇

如圖1所示,醋酸洋紅對(duì)花粉染色后,視野內(nèi)活力花粉和失活花粉均呈橙紅色,活力花粉染色較深,失活花粉染色較淺,不能很好區(qū)分花粉是否具有活力;TTC對(duì)花粉染色后,視野內(nèi)的活力花粉染色情況不理想,大部分活力花粉不能染色,失活花粉都不能染色,且多次試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定,時(shí)常出現(xiàn)活力花粉染色失敗,花粉均無法染色的情況;碘-碘化鉀對(duì)花粉染色后,視野內(nèi)的活力花粉和失活花粉均呈紅棕色,不能區(qū)分花粉是否具有活力;MTT對(duì)花粉進(jìn)行染色后,活力花粉呈玫紅色,失活花粉呈黃色或淺粉色,能很好區(qū)分活力花粉和失活花粉。比較四種染色法對(duì)花粉的染色情況MTT法最佳,醋酸洋紅法次之,再次為TTC法,最后為碘-碘化鉀。因此,可采用MTT染色法對(duì)該品種花粉進(jìn)行活力測(cè)定。

注:1號(hào)為活力花粉被I2-KI染色,2號(hào)為失活花粉被I2-KI染色,3號(hào)為活力花粉被TTC染色,4號(hào)為失活花粉被TTC染色,5號(hào)為活力花粉被MTT染色,6號(hào)為失活花粉被MTT染色,7號(hào)為活力花粉被醋酸洋紅染色,8號(hào)為失活花粉被醋酸洋紅染色。圖1 4種染色法對(duì)花粉的染色情況

2.2 不同采集時(shí)期花粉活力

結(jié)果如表1所示,花粉活力在散粉始期較低,為48.442%,在散粉盛期和散粉末期較高,分別為96.136%,93.606%。經(jīng)方差分析顯示,散粉始期花粉活力與散粉盛期、散粉末期在0.05水平上差異顯著。

表1 不同采集時(shí)期花粉活力

2.3 不同存儲(chǔ)方式花粉活力

圖2表明,花粉活力隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),但是冷藏保存的花粉活力下降速度較常溫保存緩慢?；ǚ墼趧偛墒諘r(shí),活力為93.849%,在冷藏5 d內(nèi),花粉活力為96.285%,差異不顯著,冷藏31 d內(nèi),花粉活力在0.05水平上差異顯著,下降趨勢(shì)不明顯,冷藏31 d后,花粉活力差異顯著,下降趨勢(shì)明顯;常溫儲(chǔ)藏花粉,花粉活力差異顯著,活力下降趨勢(shì)明顯,在儲(chǔ)藏10 d后,花粉活力為0。

注:圖中數(shù)值為平均值,不同大、小寫字母表示不同處理間差異顯著(p<0.05)。A為不同儲(chǔ)存方式花粉活力變化;B為泡水后花粉活力變化;C為自然散粉花粉活力變化。圖2 不同處理的花粉活力

2.4 花粉泡水活力變化

如圖2所示,花粉初始活力為93.606%,在泡水后花粉活力下降,且在0.05水平上差異顯著。泡水前5 min,花粉活力下降緩慢,下降至89.935%;泡水10 min,花粉活力迅速下降至6.859%;泡水15 min,花粉活力下降至1.854%;泡水20 min,花粉活力下降至0.518%。

2.5 自然散粉的花粉活力變化

如圖2所示,自然散粉的花粉活力為85.862%,自然儲(chǔ)藏后花粉活力下降,且在0.05水平上差異顯著。在自然儲(chǔ)藏13 d后,花粉活力下降至13.32%,16 d后花粉活力為0。

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

3.1.1核桃花粉活力測(cè)定的選擇

被子植物的有性生殖過程須經(jīng)活力花粉傳到可授性柱頭完成授精[11],因而了解品種花粉活力對(duì)于核桃雜交育種愈發(fā)關(guān)鍵。本研究選用的4種染色劑檢測(cè)花粉活力,并將失活花粉作為對(duì)照,能夠直觀區(qū)分活力花粉和失活花粉的染色情況,準(zhǔn)確篩選出檢測(cè)方法。本研究中,MTT染色法能快速有效的檢測(cè)本地圓核桃花粉活力,而醋酸洋紅染色法、氯化三苯基四氮唑(TTC)法、碘-碘化鉀(I2-KI)不能穩(wěn)定準(zhǔn)確測(cè)定其花粉活力。

在本研究中,核桃活力花粉和失活花粉均可被I2-KI染成紅棕色,活力花粉著色較深,失活花粉則較淺。該方法通過花粉內(nèi)淀粉染色情況來判斷花粉活力,活的花粉有淀粉積累,被I2-KI染成藍(lán)色,而發(fā)育不良的花粉不積累淀粉,用I2-KI染色時(shí)不顯藍(lán)色,另外,其著色程度由花粉壁的薄厚和花粉內(nèi)支鏈淀粉和直鏈淀粉比例高低決定,且直鏈淀粉顯藍(lán)色,支鏈淀粉為紅棕色[12]。本研究中,花粉被I2-KI染色后呈紅棕色,這可能是由于該品種內(nèi)支鏈淀粉占主導(dǎo),直鏈淀粉較少,因而I2-KI染色后呈紅棕色,該顏色與溶液自身顏色相似,故染色后的活力花粉與失活花粉無法區(qū)分。另外,該花粉被I2-KI染色不明顯,可能是因?yàn)樵撈贩N花粉壁通過性不好,本研究中TTC法不能對(duì)花粉進(jìn)行染色,也進(jìn)一步說明這一論證,也有學(xué)者提出TTC染色法對(duì)花粉要求較高,難以準(zhǔn)確測(cè)定花粉活力[13]。在前人的研究中,漾濞大炮[5]、綠嶺[6]、川早1號(hào)[14]等品種的花粉可以被TTC染色,而新新2號(hào)[3]、云新14號(hào)[15]、清香[16]等品種花粉只能被MTT染色。

3.1.2花粉的處理、儲(chǔ)藏與花粉活力關(guān)系

通過將花粉泡水后檢測(cè)其活力,圓核桃花粉經(jīng)泡水處理后5 min幾乎完全失活,孔令通[17]在對(duì)薄殼山核桃的花粉進(jìn)行研究時(shí),發(fā)現(xiàn)泡水噴施花粉液坐果率低,可佐證核桃特定品種的花粉不宜采用泡水噴施的方法授粉?；ǚ刍盍υ谏⒎凼⑵谧顝?qiáng),末期稍差,初期最弱(圖2),花粉的自然成熟散粉是品種在漫長(zhǎng)進(jìn)化后的時(shí)機(jī)選擇,與特定雌蕊的花期進(jìn)行適配,來保證品種下品系多樣性的最優(yōu)策略。不適宜的人工方法和時(shí)機(jī)干預(yù)會(huì)表現(xiàn)為花粉活力的“固執(zhí)現(xiàn)象”(以快速失活或累積不夠?yàn)橹饕憩F(xiàn))。這種花粉活力的“固執(zhí)現(xiàn)象”,是收集花粉進(jìn)行人工授粉或雜交育種中需要注意或設(shè)法利用的參考。劉天鳳等[15]對(duì)不同時(shí)期的花粉活力進(jìn)行了研究,其結(jié)果與本研究不同,說明不同品種的核桃花粉活力特性不同,在雜交育種以及配置授粉樹等工作中,花粉活力的研究顯得尤為重要。

3.2 結(jié) 論

本地圓核桃花粉活力可采用MTT染色法快速、有效檢測(cè)其活力,冷藏處理有利于延緩花粉失活,泡水處理可能加速花粉失活,在核桃授粉中應(yīng)謹(jǐn)慎使用;本研究模擬了自然條件下花粉活力的變化,研究表明,在自然條件下,自然散粉的核桃花粉參考?jí)勖鼮?6 d,可為核桃選擇授粉樹配置提供理論指導(dǎo)。