張新強(qiáng), 王 博, 馮會成

（1. 解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心骨科，北京 100091；2. 河北北方學(xué)院研究生學(xué)院外科，河北 張家口 075051）

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）的主要功能是阻止脛骨前移，并為膝關(guān)節(jié)提供前向和旋轉(zhuǎn)穩(wěn)定性。ACL 斷裂常見于年輕人和體育愛好者，主要由非接觸性減速、跳躍或剪切運(yùn)動造成損傷，出現(xiàn)患側(cè)膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)和疼痛等癥狀，對患者日常生活及運(yùn)動造成嚴(yán)重影響。ACL 斷裂后行ACL 重建（ACL reconstruction，ACLR） 是治療的首選，ACLR 可提供良好的膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性［1］。ACL 損傷的患者如不進(jìn)行有效處理，其患膝骨性關(guān)節(jié)炎的可能性是健康者的3~5 倍［2］。盡管ACL的結(jié)構(gòu)可以從根本上重建，但部分患者術(shù)后早期感覺膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定，這是由于重建的ACL 本體感覺并未恢復(fù)［3］。劉曉磊等［4］研究顯示：ACL 損傷患者ACLR 術(shù)后雙下肢的本體感覺和姿勢控制能力均降低。ACL 損傷患者術(shù)前本體感覺喪失，ACLR術(shù)后以本體感覺訓(xùn)練為主的康復(fù)方案對膝關(guān)節(jié)本體感覺和功能狀態(tài)有顯著改善效果［5］。ACLR 術(shù)后有效的康復(fù)訓(xùn)練對于ACL 損傷患者較為重要，ACLR 術(shù)后康復(fù)可促進(jìn)患者的活動水平和膝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)至受傷前［6］。張曉宇等［7］發(fā)現(xiàn)：ACLR 術(shù)后進(jìn)行早期康復(fù)對膝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)可能存在優(yōu)勢。陳鵬等［8］認(rèn)為：全身振動訓(xùn)練可以改善ACLR 術(shù)后患者的本體感覺和平衡。目前尚未完全闡明ACLR 術(shù)后患者振動刺激治療的振幅強(qiáng)度、振動頻率和作用時間的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究構(gòu)建ACL 損傷兔模型，使用不同振幅強(qiáng)度、振動頻率和作用時間對其進(jìn)行振動刺激治療，探討不同局部脈沖振動刺激治療條件對ACLR 術(shù)后本體感覺恢復(fù)的影響，為臨床實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑和儀器選取健康新西蘭大白兔45 只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0~2.5 kg，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（京）2016-0003，由北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖廠提供，動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0016。鼠抗兔 S-100 單克隆抗體、 多聚體抗小鼠免疫球蛋白 G（immunoglobulin G， IgG） - 辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）試劑盒、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、4%多聚甲醛和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自武漢博士德生物工程有限公司，HE 染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。切片機(jī)、脫水機(jī)和包埋機(jī)購自武漢俊杰電子有限公司，顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，掃描儀購自德國Leica 公司，多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek 公司，PCR 儀購自美國Applied Biosystems 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物造模和分組按參照文獻(xiàn)［9］的方法，選取15 只兔用于提供同種異體移植肌腱的制備。兔麻醉成功后，將其仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，將兔雙側(cè)趾長伸肌腱切下，進(jìn)行脫細(xì)胞去除免疫源性后，置于深低溫冰箱中逐步降溫至－80 ℃保存?zhèn)溆谩? 周后將制備好并儲存于－80 ℃冰箱中的同種異體移植肌腱解凍，將取出的肌腱置于40 ℃、生理鹽水注射液中融化15 min，當(dāng)肌腱恢復(fù)彈性后，置于40 000 U·100 mL－1慶大霉素注射液漂洗5~10 min，再經(jīng)生理鹽水注射液沖洗，肌腱兩端分別采用不吸收線編制縫合后，置入生理鹽水注射液中備用。

選取30 只兔右膝關(guān)節(jié)制備ACL 模型，左膝關(guān)節(jié)不做處理。兔麻醉成功后，膝關(guān)節(jié)術(shù)區(qū)備皮消毒鋪無菌單，切開膝關(guān)節(jié)，顯露ACL，于韌帶上、下止點(diǎn)處切斷ACL，分別于脛骨和股骨ACL 附著處鉆骨隧道。將同種異體肌腱移植物穿過骨道，于屈膝45°狀態(tài)下拉緊肌腱移植物，兩端縫線固定，查前抽屜實(shí)驗(yàn)和Lachman 實(shí)驗(yàn)陰性后，重建韌帶有效，固定牢靠，縫合切口，敷料包扎。術(shù)后每只兔均以單獨(dú)兔籠喂養(yǎng)，術(shù)前和術(shù)后每只兔注射抗生素預(yù)防感染，切口換藥，術(shù)后10 d 所有兔傷口均愈合，未發(fā)生切口感染或延遲愈合等情況。術(shù)后將30 只兔隨機(jī)分為對照組和9 個振動刺激治療組（振動刺激治療1~9 組），每組3 只。對照組兔常規(guī)喂養(yǎng)，振動刺激治療組兔于術(shù)后10 d 開始行局部脈沖振動刺激治療，將局部脈沖振動刺激裝置置于兔膝部進(jìn)行治療，每2 d 治療1 次，共治療12 周。

1.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計振動刺激治療參數(shù)采用“三因素三水平”正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計振動刺激治療參數(shù)，將振幅強(qiáng)度（A）、振動頻率（B） 和作用時間（C）作為治療因素，每個因素設(shè)定3 個水平，分別為振幅強(qiáng)度：2、3和4 mm，振動頻率：25、35 和45 Hz，作用時間：10、20和30 min。振動刺激治療1~9 組依據(jù)振動刺激治療參數(shù)劃分，振動刺激治療1 組參數(shù)為振幅強(qiáng)度4 mm（賦值為3）、振動頻率35 Hz（賦值為2）和作用時間30 min（賦值為3），振動刺激參數(shù)代碼：A3B2C3，振動刺激治療2~8 組進(jìn)行參數(shù)賦值。見表1 和2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計治療因素和水平Tab.1 Treatment factors and levels designed by orthogonal experiment

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計振動刺激治療參數(shù)Tab.2 Vibratory stimulation treatment parameters designed by orthogonal experiment

1.4 ACL 樣本采集和處理干預(yù)治療12 周后將30 只兔采用空氣栓塞法處死，快速暴露并取材ACL，將切取的1/2 韌帶組織置于4%多聚甲醛固定24 h。將另外1/2 韌帶采用無RNA 酶的生理鹽水洗滌，置入5 mL 凍存管并快速投入液氮中，再放入－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HE 染色觀察各組兔ACL 本體感受器形態(tài)表現(xiàn)更換容器中4%多聚甲醛，浸泡2 h。PBS 緩沖液浸泡清洗15 min，3 次。二甲苯脫水透明，石蠟浸蠟，包埋機(jī)包埋。冷凍臺放置10 min 后取下蠟塊。采用切片機(jī)切片，厚度為3 μm。石蠟切片脫蠟至水，烘干，蘇木素和伊紅染色，100%酒精脫水2 s，烘干后中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組兔ACL 本體感受器形態(tài)表現(xiàn)并拍照。

1.6 S100 免疫組織化學(xué)染色觀察各組兔ACL 本體感受器分型兔ACL 樣本切片常規(guī)脫蠟至水。將內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑滴加于組織上，室溫孵育10 min，雙蒸水清洗滅活。滴加 5% BSA 封閉液，37 ℃孵育30 min。甩去多余液體，不洗滌。一抗孵育4 ℃過夜。取出后 37 ℃復(fù)溫30 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。滴加聚合 HRP 抗兔/小鼠IgG，37 ℃孵育30 min。PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。滴加DAB 顯色液顯色，顯微鏡下觀察并控制反應(yīng)時間。水洗后復(fù)染，滴加蘇木素， 室溫孵育1 min，PBS 緩沖液清洗，堿性溶液返藍(lán)，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 計數(shù)各組兔ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)采用參考文獻(xiàn)［10］中ACL 本體感受器分型方法，光學(xué)微鏡下觀察各組兔ACL 本體感受器HE 染色切片和S100 免疫組織化學(xué)染色切片，于ACL 脛骨和股骨端分別取2 張切片，中間取1 張切片，分別記錄S100 免疫組織化學(xué)染色切片中類Ruffini 小體數(shù)、類Pacinian 小體數(shù)和類Golgi 腱器官數(shù)，計算各組兔ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)。由3 名相關(guān)專業(yè)知識人員經(jīng)過培訓(xùn)后進(jìn)行計數(shù)，取平均值。ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)=類Ruffini 小體數(shù)+類Pacinian 小體數(shù)+類Golgi 腱器官數(shù)。

1.8 實(shí)時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組兔ACL 組織中生長相關(guān)蛋白43（growth associated protein-43，GAP-43）mRNA 表達(dá)水平提取各組兔ACL 組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行RT-qPCR 法檢測。引物序列見表3。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，63 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計算各組兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達(dá)水平。

表3 PCR 引物序列Tab.3 Primer sequences of PCR

1.9 正交分析法篩選ACLR 術(shù)后康復(fù)振動刺激治療最優(yōu)參數(shù)計算振動刺激治療1~9 組兔ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)和GAP-43 mRNA 表達(dá)水平的平均值，建立正交分析表，計算K 值和R 值，判定振幅強(qiáng)度、振動頻率和作用時間3 個影響因素的順序和相應(yīng)因素的最優(yōu)參數(shù)。K 值為相應(yīng)因素三水平對應(yīng)的各組兔ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)和GAP43 mRNA表達(dá)水平的平均值，R 值為相應(yīng)因素中K 值的極差。K1：振幅強(qiáng)度2 mm、振動頻率25 Hz 和作用時間10 min；K2：振幅強(qiáng)度3 mm、振動頻率35 Hz 和作用時間20 min；K3：振幅強(qiáng)度4 mm、振動頻率45 Hz 和作用時間30 min。同組中K 值越大，相應(yīng)參數(shù)下該指標(biāo)的治療效果越好；R 值越大，相應(yīng)因素對該指標(biāo)的影響越大。根據(jù)無空白列有重復(fù)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方差分析，F(xiàn) 值越大，則相應(yīng)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析采用 SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組兔ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)和ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達(dá)水平均呈正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ACL 模型鑒定兔模型中可見移植物張力尚可，無松弛狀態(tài)，前抽屜實(shí)驗(yàn)和Lachman 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。治療后取ACL 組織，可見移植物連續(xù)性存在，與脛骨和股骨腱骨愈合。見圖1 和2。

圖1 移植的ACL 組織Fig. 1 Transplanted ACL tissue

圖2 移植后ACL 組織愈合情況Fig. 2 Healing of ACL tissue after transplantation

2.2 各組兔ACL 本體感受器形態(tài)表現(xiàn)和分型ACL 本體感受器中可見Ruffini 小體為卵圓形或樹突狀形態(tài)，直徑25~330 μm；Pacinian 小體為圓形或橢圓形感受器，直徑40~220 μm；Golgi 腱器官感受器呈梭形，直徑140~900 μm；游離神經(jīng)末梢為無髓鞘神經(jīng)末梢，長度0.5~1.5 μm。移植ACL中本體感受器主要分布于ACL 的脛骨和股骨附著點(diǎn)，主要為類Ruffini 小體和類Pacinian 小體，無典型的類Golgi 腱器官。見圖3 和4。

圖3 兔正常ACL 中本體感受器（HE，×200）Fig. 3 Proprioceptors in normal ACL of rabbits (HE,×200)

圖4 各組兔ACL 本體感受器分型（S100 免疫組織化學(xué)，×400）Fig. 4 ACL proprioceptor types of rabbits in various groups (S100 immunohistochemstry,×400)

2.3 各組兔ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)與對照組比較，振動刺激治療3、振動刺激治療5 和振動刺激治療7 組兔ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)明顯增加（F=28.49，P<0.01）。見表4。

表4 各組兔ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)Tab. 4 Number of ACL proprioceptor cells of rabbits in various groups(n=3，±s）

表4 各組兔ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)Tab. 4 Number of ACL proprioceptor cells of rabbits in various groups(n=3，±s）

*P<0.01 compared with control group.

?

2.4 各組兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達(dá)水平各組兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.83，P>0.05）。見表5。

表5 各組大白兔ACL 組織中GAP- 43 mRNA 表達(dá)水平Tab. 5 Expression levels of GAP- 43 mRNA in ACL tissue of rabbits in various groups(n=3，±s）

表5 各組大白兔ACL 組織中GAP- 43 mRNA 表達(dá)水平Tab. 5 Expression levels of GAP- 43 mRNA in ACL tissue of rabbits in various groups(n=3，±s）

?

2.5 不同振動刺激參數(shù)下兔ACL 本體感受器數(shù)振幅強(qiáng)度、振動頻率和作用時間對局部脈沖振動刺激治療ACLR 術(shù)后本體感受器數(shù)均存在較大影響，影響程度（以F值計）為振幅強(qiáng)度>作用時間>振動頻率。不同振幅強(qiáng)度治療條件下，ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)排序?yàn)? mm>2 mm>4 mm，最優(yōu)振幅強(qiáng)度為3 mm；不同振動頻率治療條件下，ACL本體感受器細(xì)胞數(shù)排序?yàn)?5 Hz>35 Hz>45 Hz，最優(yōu)振動頻率為25 Hz；不同作用時間下，ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)排序?yàn)?0 min>30 min>20 min，最佳作用時間為10 min。見表6 和7。

表6 ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)方差分析Tab.6 Variance analysis on number of ACL proprioceptor cells

表7 不同振動刺激參數(shù)下ACL 本體感受器細(xì)胞數(shù)正交分析Tab.7 Orthogonal analysis on number of ACL proprioceptor cells under different vibratory stimulation parameters

2.6 不同振動刺激參數(shù)下兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達(dá)水平振幅強(qiáng)度、振動頻率和作用時間對局部脈沖振動刺激治療ACLR 術(shù)后兔ACL 組織中GAP-43 mRNA表達(dá)水平均無明顯影響（以F值計）。2、3 和4 mm 振幅強(qiáng)度作用后，ACLR 術(shù)后兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達(dá)水平無明顯變化；25、35 和45 Hz 振動頻率作用后，ACLR 術(shù)后兔ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達(dá)水平無明顯變化；作用10、20 和30 min 后，ACLR 術(shù)后兔ACL組織中GAP-43 mRNA 表達(dá)水平無明顯變化。見表8 和9。

表8 兔ACL 組織中GAP- 43 mRNA 表達(dá)水平方差分析Tab.8 ANOVA on expression levels of GAP- 43 mRNA in ACL tissue of rabbits

表9 不同振動刺激參數(shù)下兔ACL 組織中GAP- 43 mRNA表達(dá)水平正交分析Tab. 9 Orthogonal analysis on expression levels of GAP- 43 mRNA in ACL tissue of rabbits under different vibration stimulation parameters

3 討 論

ACL 中包括Ruffini 小體、 Pacinian 小體、Golgi 腱器官和游離神經(jīng)末梢等重要的膝關(guān)節(jié)本體感覺結(jié)構(gòu)［11］。其主要位于韌帶的脛骨和股骨附著點(diǎn)，分別參與意識靜態(tài)狀態(tài)下關(guān)節(jié)位置覺、檢測關(guān)節(jié)運(yùn)動/加速度和調(diào)節(jié)反射性肌肉收縮，向中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供有膝關(guān)節(jié)位置和運(yùn)動及力和力的感覺傳入反饋［12-14］。振動刺激治療是ACLR 術(shù)后康復(fù)的重要部分，可激活本體感覺發(fā)生反射，使肌肉受到振動刺激后不自主收縮進(jìn)而得到迅速康復(fù)。

研究［15］顯示：振動可刺激人體多個生物系統(tǒng)，可引起包括皮膚感受器、關(guān)節(jié)本體感受器、前庭系統(tǒng)變化和神經(jīng)遞質(zhì)和激素濃度變化。研究［16］顯示：低振幅機(jī)械噪聲振動刺激治療對ACLR 術(shù)后患者的本體感覺恢復(fù)有積極作用，可提高本體感覺敏銳度。本研究結(jié)果顯示：合適條件下的局部脈沖振動刺激治療可明顯增加模型兔的本體感受器細(xì)胞數(shù)，提示局部脈沖振動刺激治療可促進(jìn)ACLR 術(shù)后兔本體感覺恢復(fù)，達(dá)到加快兔ACLR 術(shù)后康復(fù)的目的。

振動刺激治療可改善ACLR 術(shù)后患者的本體感覺恢復(fù)，但振動刺激參數(shù)與治療效果的關(guān)系尚未完全闡明。研究［17］顯示：振動頻率在26~44 Hz 時可提高肌肉力量，振動頻率<20 Hz 僅引起肌肉放松，>50 Hz 將引起肌肉損傷。HAN 等［18］發(fā)現(xiàn)：在20 Hz 振動頻率下ACL 感受器細(xì)胞的增殖活性較對照組升高20%。本研究結(jié)果顯示：局部脈沖振動刺激治療最主要的影響參數(shù)是振幅強(qiáng)度，而振幅強(qiáng)度為3 mm、振動頻率為25 Hz 和作用時間為10 min 是ACL 本體感受器細(xì)胞增殖的最優(yōu)參數(shù)。因此，臨床上對ACLR 術(shù)后患者行局部脈沖振動刺激治療時，可以通過降低振幅強(qiáng)度、降低振動頻率和縮短治療時間以提高治療效果。

GAP-43 是一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性生長相關(guān)蛋白，在神經(jīng)發(fā)育和再生過程中表達(dá)。研究［19］顯示：當(dāng)ACL 損傷時，本體感受器中GAP-43 被激活，GAP-43 表達(dá)水平升高。本研究結(jié)果顯示：振幅強(qiáng)度、振動頻率和作用時間對局部脈沖振動刺激治療ACLR 術(shù)后ACL 組織中GAP-43 mRNA 表達(dá)水平均無明顯影響，考慮為本研究實(shí)驗(yàn)持續(xù)時間較短，需行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，局部脈沖振動刺激治療可促進(jìn)兔ACLR 術(shù)后ACL 本體感受器恢復(fù)。振幅強(qiáng)度、振動頻率和作用時間是局部脈沖振動刺激治療ACLR術(shù)后本體感覺恢復(fù)的影響因素，其中振幅強(qiáng)度是最主要的影響因素?？刹捎玫驼穹?、低振動頻率和短時間的局部脈沖振動刺激治療加快ACLR 術(shù)后兔本體感覺恢復(fù)。