王曉妮, 郭 濤, 羅啟云, 關(guān)立鋒

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院燒傷整形美容科，寧夏 銀川 750004）

增生性瘢痕是皮膚發(fā)生損傷后出現(xiàn)的病理性改變，在細(xì)菌感染和過度炎癥反應(yīng)等因素的調(diào)控下，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞 （hypertrophic scar fibroblasts，HSFBs） 大量增殖，膠原合成與分解平衡被打破，細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，從而造成瘢痕增生，影響患者美觀程度，嚴(yán)重者會并發(fā)局部潰爛甚至癌變，給患者帶來巨大的心理壓力和精神痛苦［1-3］。松蘿酸具有抗氧化、抗炎和抗病毒等多種藥理學(xué)活性，可促進(jìn)創(chuàng)面愈合和控制創(chuàng)面瘢痕過度增生［4-6］。松蘿酸可抑制兔耳增生性瘢痕內(nèi)血管生成，從而抑制增生性瘢痕的形成［7］。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） 屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）亞族，JNK 相關(guān)信號通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中具有重要作用［8］。研究［9］顯示：A 型肉毒素通過激活JNK 信號通路可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡和抑制成纖維細(xì)胞增殖。松蘿酸在創(chuàng)面愈合過程中對病理性瘢痕形成的影響和JNK 信號通路的作用尚未完全闡明。本研究探討松蘿酸對HSFBs增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，闡明其對JNK/MAPK 信號通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器HSFBs 購自美國ATCC 公司。松蘿酸（純度>98%） 購自美國Sigma 公司， 噻唑藍(lán) （methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco 公司，磷酸化JNK （phosphorylated JNK，p-JNK）、JNK、B 細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax） 和GAPDH 抗體購自美國Abcam 公司。CytoFLEX 型流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter 公司，680 型全自動酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組將HSFBs 培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度，待細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時進(jìn)行細(xì)胞傳代。取第4 代對數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以每孔2×103個細(xì)胞的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長后，將細(xì)胞分為對照組、10 μmol·L－1松蘿酸組、20 μmol·L－1松蘿酸組和50 μmol·L－1松蘿酸組，對照組細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)液，各濃度松蘿酸組細(xì)胞更換含不同濃度松蘿酸培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h 后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT 法檢測各組細(xì)胞存活率取各組處理后細(xì)胞，每孔加入10 μL 0.5 g·L－1MTT 溶液繼續(xù)孵育4 h，加入200 μL 二甲基亞砜，培養(yǎng)箱中孵育15 min，采用酶標(biāo)儀于波長490 nm 處測定吸光度（A）值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A 值－空白組A 值）/（對照組A 值－空白組A 值）×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率取各組處理后細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2 次，加入500 μL PBS 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和PI，輕輕震蕩混勻，室溫下避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力取各組處理后細(xì)胞，將Matrigel 與DMEM 培養(yǎng)基按1∶9 稀釋，Transwell 小室中加入稀釋后基質(zhì)膠，培養(yǎng)箱中靜置30 min。將細(xì)胞制成1×105mL－1細(xì)胞懸液，取100 μL 細(xì)胞懸液置于Transwell 小室的上室中，Transwell 小室的下室中加入500 μL含5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS 緩沖液清洗，顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)各組侵襲細(xì)胞數(shù)。另取處理后細(xì)胞，除上室中不加Matrigel 外，其余操作步驟同上。結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下觀察并拍照，并計(jì)數(shù)各組遷移細(xì)胞數(shù)。以侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)代表各組細(xì)胞侵襲和遷移能力。

1.6 Western blotting 法檢測細(xì)胞中p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平取各組處理后細(xì)胞，裂解液裂解，離心取上清液，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，取蛋白25 μg 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫封閉1 h，一抗p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5 000） 室溫孵育2 h，ECL 法顯色，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡率與對照組比較，10、20 和50 μmol·L－1松蘿酸組細(xì)胞存活率均降低（P<0.05），細(xì)胞凋亡率均升高（P<0.05）。與10 μmol·L－1松蘿酸組比較，20 和50 μmol·L－1松蘿酸組細(xì)胞存活率均降低（P<0.05），細(xì)胞凋亡率均升高（P<0.05）。與20 μmol·L－1松蘿酸組比較，50 μmol·L－1松蘿酸組細(xì)胞存活率降低（P<0.05），細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）。見圖1 和表1。

表1 各組細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡率Tab. 1 Survival rates and apoptotic rates of cells in various groups（n=3，x±s，η/%）

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率Fig. 1 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.2 各組侵襲細(xì)胞數(shù)與對照組比較，10、20 和50 μmol·L－1松蘿酸組侵襲細(xì)胞數(shù)均減少（P<0.05）。與10 μmol·L－1松蘿酸組比較， 20 和50 μmol·L－1松蘿酸組侵襲細(xì)胞數(shù)均減少（P<0.05）。與20 μmol·L－1松蘿酸組比較，50 μmol·L－1松蘿酸組侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05）。見圖2和表2。

表2 各組侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)Tab. 2 Numbers of invasion cells and migration cells in various groups（n=3，±s）

表2 各組侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)Tab. 2 Numbers of invasion cells and migration cells in various groups（n=3，±s）

*P<0.05 compared with control group； △P<0.05 compared with 10 μmol·L－1 usnic acid group； #P<0.05 compared with 20 μmol·L－1 usnic acid group.

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圖2 結(jié)晶紫染色觀察各組侵襲細(xì)胞數(shù)（×400）Fig. 2 Number of invasion cells in various groups observed by crystal violet staining(×400)

2.3 各組遷移細(xì)胞數(shù)與對照組比較，10、20 和50 μmol·L－1松蘿酸組遷移細(xì)胞數(shù)均減少（P<0.05）。與10 μ mol·L－1松蘿酸組比較， 20 和50 μmol·L－1松蘿酸組遷移細(xì)胞數(shù)均減少（P<0.05）。與20 μmol·L－1松蘿酸組比較，50 μmol·L－1松蘿酸組遷移細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05）。見圖3 和表2。

圖3 結(jié)晶紫染色觀察各組遷移細(xì)胞數(shù)（×400）Fig. 3 Number of migration cells in various groups observed by crystal violet staining(×400)

2.4 各組細(xì)胞中JNK、p-JNK、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平與對照組比較，10、20 和50 μmol·L－1松蘿酸組細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平均降低（P<0.05），Bax 和p-JNK 蛋白表達(dá)水平均升高（P<0.05）。與10 μ mol·L－1松蘿酸組比較，20 和50 μmol·L－1松蘿酸組細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平均降低（P<0.05），Bax 和p-JNK 蛋白表達(dá)水平均升高（P<0.05）。與20 μ mol·L－1松蘿酸組比較，50 μmol·L－1松蘿酸組細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05），Bax 和p-JNK 蛋白表達(dá)水平均升高（P<0.05）。各組JNK 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖4 和表3。

表3 各組細(xì)胞中p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平Tab. 3 Expression levels of p-JNK, JNK, Bcl-2, and Bax proteins in cells in various groups（n=3，±s）

表3 各組細(xì)胞中p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平Tab. 3 Expression levels of p-JNK, JNK, Bcl-2, and Bax proteins in cells in various groups（n=3，±s）

*P<0.05 compared with control group； △P<0.05 compared with 10 μmol·L－1 usnic acid group； #P<0.05 compared with 20 μmol·L－1 usnic acid group.

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圖4 各組細(xì)胞中p-JNK、JNK、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 4 Electrophoregram of expressions of p-JNK,JNK, Bcl-2, and Bax proteins in cells in various groups

3 討 論

臨床上治療瘢痕的方法主要包括壓迫、冷凍、激光手術(shù)等，但由于其各自的局限性和副作用，較難獲得理想的治療效果，因此需要開發(fā)新型治療增生性疤痕藥物［10-11］。厚樸酚和山柰酚等中藥可通過抑制HSFBs 的增殖活性發(fā)揮抗瘢痕增生的作用［12-13］。松蘿酸在低等地衣植物中含量較高，是一種具有獨(dú)特二苯并呋喃骨架的次生代謝產(chǎn)物，具有抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。研究［14-15］顯示：松蘿酸可抑制乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。但目前關(guān)于松蘿酸在HSFBs 增殖、遷移和侵襲中的研究較少。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，10、20 和50 μmol·L－1松蘿酸組細(xì)胞存活率均降低，而細(xì)胞凋亡率均升高，且呈劑量依賴性，提示松蘿酸可抑制HSFBs 增殖和誘導(dǎo)HSFBs 凋亡。

研究［16］證實(shí)：松蘿酸具有誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用。松蘿酸可阻滯細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞DNA 合成和產(chǎn)生細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞的惡性增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，10、20 和50 μmol·L－1松蘿酸組侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均減少，且隨松蘿酸濃度的升高細(xì)胞數(shù)逐漸遞減，提示松蘿酸可增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附性，使細(xì)胞不易處于游離狀態(tài)，抑制HSFBs 遷移和侵襲。

MAPK 信號通路參與多種病理生理過程，是真核細(xì)胞調(diào)控和介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要系統(tǒng)，而JNK 是MAPK 信號通路中的重要支路［17］。研究［18］顯示：同源盒B9 通過激活MAPK 信號通路促進(jìn)增生性瘢痕的形成。激活MAPK 信號通路可降低脂多糖刺激的類增生性瘢痕成纖維細(xì)胞活性［19］。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，10、20和50 μmol·L－1松蘿酸組細(xì)胞中p-JNK 蛋白表達(dá)水平升高，且呈劑量依賴性，提示松蘿酸可上調(diào)JNK 磷酸化，激活JNK/MAPK 信號通路。

細(xì)胞凋亡是多種基因共同作用的結(jié)果，Bcl-2家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡中具有重要作用，該家族主要包括抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax，當(dāng)細(xì)胞受損或增殖受到抑制時，Bax 和Bcl-2 的表達(dá)失衡，Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低，從而增加線粒體膜通透性，啟動細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)［19-23］。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，10、20和50 μmol·L－1松蘿酸組細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平均降低，Bax 蛋白表達(dá)水平均升高，且呈劑量依賴性，提示松蘿酸可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)并誘導(dǎo)HSFBs 凋亡。與DERICI 等［24］的研究結(jié)果一致。

綜上所述，松蘿酸可抑制HSFBs 增殖、侵襲和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時可促進(jìn)JNK 磷酸化，激活MAPK/JNK 信號通路。