王梓默, 林士杰, 朱紅波, 何懷江, 張大偉, 楊 帆

(1. 吉林省林業(yè)科學(xué)研究院, 吉林 長(zhǎng)春 130033; 2. 吉林省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院, 吉林 長(zhǎng)春 130022)

作為以細(xì)胞全能性理論為基礎(chǔ)的無(wú)性繁殖技術(shù),植物組織培養(yǎng)具有能夠保持母本優(yōu)良性狀、繁殖速度快等優(yōu)勢(shì),對(duì)于有性繁殖難度大、扦插不易成活的林木繁殖具有重要的應(yīng)用價(jià)值,目前已被廣泛應(yīng)用于離體快繁[1]、種質(zhì)資源保存、脫毒苗木培育、遺傳育種及物種保護(hù)等方面[2]。但在林木組織培養(yǎng)的過(guò)程中經(jīng)常發(fā)生褐化現(xiàn)象,不僅影響外植體的生長(zhǎng),甚至可能直接導(dǎo)致培養(yǎng)物死亡,有效控制褐化已經(jīng)成為林木組織培養(yǎng)成功率提高的關(guān)鍵[3-5]。本文概述了近年來(lái)林木組織培養(yǎng)褐化研究進(jìn)展,總結(jié)了褐化的影響因素與控制途徑,以期為木本植物高效組培技術(shù)體系的建立提供參考。

1 林木組織培養(yǎng)褐化的影響因素

關(guān)于林木組織培養(yǎng)褐化的原因主要集中于2類觀點(diǎn):第一種觀點(diǎn)認(rèn)為褐化主要是由過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等與底物酚類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成醌類物質(zhì),醌類物質(zhì)經(jīng)脫水、聚合產(chǎn)生黑褐色物質(zhì),使外植體及培養(yǎng)基褐化,導(dǎo)致樹(shù)木生長(zhǎng)受阻甚至死亡,即酶促褐化[6, 7];第二種觀點(diǎn)認(rèn)為組培過(guò)程中受不利外界條件的影響,造成了植物細(xì)胞程序性死亡,即脅迫褐化[8]。2種褐化問(wèn)題發(fā)生機(jī)制的本質(zhì)區(qū)別在于是否有酚類物質(zhì)參與反應(yīng)。林木組織培養(yǎng)褐化的發(fā)生,一方面與外植體的選擇有關(guān),主要指所取外植體本身的遺傳特性、生理狀態(tài)等;另一方面受開(kāi)展組織培養(yǎng)的條件影響,既包括溫度、光照等培養(yǎng)條件,也包括培養(yǎng)基的成分[9]。

1.1 外植體的遺傳特性及生理狀態(tài)

1.1.1 外植體的遺傳特性

組織培養(yǎng)過(guò)程中褐化發(fā)生與樹(shù)種類型和基因型有關(guān),不同物種間褐化發(fā)生的情況不同。已有研究證明,酚酸、黃酮、單寧、木質(zhì)素、色素等的含量與木本植物的褐化程度密切相關(guān)[10],這些物質(zhì)含量較高的樹(shù)種更容易發(fā)生褐化,如梨[11]、桃[12]、蘋(píng)果[13]、銀杏[14]、核桃[15]等木本植物更容易在組織培養(yǎng)過(guò)程中遇到褐變問(wèn)題。不同品種間褐化也存在差異,與植物中所含酚類物質(zhì)的數(shù)量、種類及酶活性不同有關(guān)。崔雪梅以同科不同屬的暴馬丁香、水曲柳作為試驗(yàn)樹(shù)種,發(fā)現(xiàn)組織培養(yǎng)過(guò)程中水曲柳外植體發(fā)生褐變的概率明顯高于暴馬丁香,可能是由于水曲柳中多酚物質(zhì)含量高于暴馬丁香,同時(shí)暴馬丁香中多酚氧化酶(PPO)的活性較低,降低了對(duì)酚類物質(zhì)的氧化能力[16]。涂俊凡等對(duì)沙梨帶芽莖段無(wú)菌培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)褐化差異與外植體的基因型相關(guān),6個(gè)試驗(yàn)品種中“金水2號(hào)”較容易褐變,“圓黃”非常容易褐變,其余4個(gè)品種褐變程度明顯較輕[17]。丁植磊等對(duì)12種油茶品種進(jìn)行花藥愈傷組織的誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)雖然每個(gè)油茶品種均有褐化現(xiàn)象,但不同油茶物種間差別較大,其中紅花油茶的褐化現(xiàn)象明顯比白花油茶嚴(yán)重[18]。李新鳳等的研究表明,牡丹組織培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意基因型的選擇,不同品種牡丹間組培褐化率差異顯著,褐化程度較輕的“金陽(yáng)”“金閣”和“賽雪塔”更適合做外植體[19]。

1.1.2 外植體的生長(zhǎng)部位與生理狀態(tài)

外植體的生長(zhǎng)部位與生理狀態(tài)也是影響組織培養(yǎng)褐化的主要因素。以同一樹(shù)種不同部位器官作為外植體或以不同生理狀態(tài)下的相同器官作為外植體時(shí),樹(shù)木的褐化情況也有所不同,常見(jiàn)外植體包括根莖的萌芽、根、腋芽和頂芽等。在臺(tái)灣榿木[20]、隴東海棠[21]的組織培養(yǎng)過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)以莖尖為外植體時(shí)褐變發(fā)生早,且褐化率及因褐化死亡率明顯高于帶芽莖段,帶芽莖段是更好的外植體材料。楊蘭芳以茶條槭當(dāng)年生萌條的頂芽和帶芽莖段為外植體進(jìn)行初代試驗(yàn),研究結(jié)果表明,帶芽莖段與頂芽相比褐化嚴(yán)重,褐化率達(dá)20.35 %[22]。張繼偉通過(guò)對(duì)10年生琵琶樹(shù)幼嫩葉的葉柄及葉脈離體培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)隨葉柄、中葉脈、上葉脈褐化率的增加,存活率及愈傷組織發(fā)生率依次降低,篩選出中葉葉柄為理想的培養(yǎng)材料[23]。喻娜的研究結(jié)果表明,銀杏莖尖的幼嫩程度對(duì)其接種后褐化程度產(chǎn)生直接影響,以當(dāng)年生相對(duì)幼嫩的嫩芽作為外植體褐化率明顯高于枝條上的幼莖尖[24]。黃燕芬等對(duì)茶樹(shù)組織培養(yǎng)外植體褐化的研究結(jié)果表明,保留帶腋芽葉片2/5時(shí)能夠緩解腋芽褐化現(xiàn)象,但需注意葉片消耗培養(yǎng)基養(yǎng)分的問(wèn)題[25]。

外植體的大小也對(duì)褐化程度有一定影響。李圓圓通過(guò)對(duì)刺楸頂芽離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),較大頂芽作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)褐化現(xiàn)象嚴(yán)重,褐化圈較大,相對(duì)較小的頂芽其褐化圈相對(duì)較小[26]。宋春暉等對(duì)柱狀蘋(píng)果進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)外植體莖段過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加污染率,同時(shí)導(dǎo)致萌芽率降低,選擇帶有2個(gè)腋芽的莖段作為外植體時(shí)生長(zhǎng)效果最佳[27]。以不同材料為外植體時(shí),其大小對(duì)褐化程度的影響也不同。張繼偉等對(duì)琵琶樹(shù)幼嫩葉進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn),葉片的大小對(duì)組培褐化率影響十分明顯,其中大葉片的褐化率反而最低[23]。

取材季節(jié)和消毒時(shí)間也與外植體的褐變率關(guān)系密切。對(duì)茶樹(shù)離體增殖與再生體系研究表明,秋季取材的污染率較高,一方面可能是由于春季腋芽剛萌生,自身攜帶的細(xì)菌相對(duì)較少,而秋季取材時(shí)腋芽已經(jīng)經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間的生長(zhǎng),攜帶的細(xì)菌增加,因此消毒相對(duì)更難;另一方面可能與春季茶樹(shù)新梢中的多酚物質(zhì)含量比秋季更低有關(guān)。因此,選擇春季取材外植體的褐化率更低[28]。陳麗等對(duì)血皮槭快繁外植體褐化問(wèn)題的研究發(fā)現(xiàn),不同時(shí)間采摘的外植體褐化程度不同,在4—5月采摘的外植體褐化和分化均較少,而7—8月采摘的外植體褐化率較高,只有在6月采摘的外植體褐化少且分化高[29]。對(duì)刺楸莖椴進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn),接近夏季時(shí)取材,外植體的褐化現(xiàn)象較5月更加嚴(yán)重,誘導(dǎo)分化困難且污染率更高[26]。在對(duì)楸樹(shù)、板栗、鄧恩桉等愈傷組織誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn),通過(guò)酒精、升貢等對(duì)外植體消毒處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)褐變率上升,萌芽率降低[30]。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基的組分與形態(tài)

培養(yǎng)基是外植體的生長(zhǎng)環(huán)境,其組分與形態(tài)都影響著外植體的褐化率。對(duì)桑樹(shù)[31]、柿樹(shù)[32]、蘋(píng)果梨[33]、茶樹(shù)[25]等進(jìn)行組織培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),木本植物在1/2 DKW或者1/2 MS培養(yǎng)基上褐化程度減輕。對(duì)華蓋木的組織培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基硬度較高時(shí)褐化較輕,褐化死亡率降低[34]。當(dāng)培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽、蔗糖與大量元素濃度過(guò)高時(shí)會(huì)促進(jìn)植物體細(xì)胞中酚類物質(zhì)的合成,加劇外植體的褐化[8]。pH決定培養(yǎng)基的滲透壓、影響酚類物質(zhì)與多酚氧化酶(PPO)和過(guò)氧化物酶(POD)等的結(jié)合位點(diǎn)[35],當(dāng)培養(yǎng)基pH過(guò)高時(shí)外植體更容易發(fā)生褐化[36]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的添加也對(duì)褐化產(chǎn)生影響,已有研究表明,在高濃度的外源激素作用下鄧恩桉、巨桉帶芽莖段誘導(dǎo)褐化率較高,降低激素濃度后褐化現(xiàn)象得到緩解[37]。同種激素對(duì)不同樹(shù)種組培褐化影響不同,在紫杉芽誘導(dǎo)過(guò)程中添加6-BA后加劇了褐化,而在南方紅豆杉組培過(guò)程中添加6-BA對(duì)外植體的褐化卻起到了抑制作用[38]。此外,抗氧化劑與吸附劑也能夠有效阻止褐化發(fā)生,其抑制褐化的作用在核桃[15]、桑樹(shù)[31]、紅豆杉[39]、華蓋木[34]的組織培養(yǎng)過(guò)程中均得到了證實(shí)。

1.2.2 培養(yǎng)條件

溫度影響多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)等的活性[40],與組織培養(yǎng)褐化現(xiàn)象緊密相關(guān),在中華紅葉楊組織培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),高溫時(shí)酶活性增強(qiáng),褐化現(xiàn)象加劇[41]。雷樊登將接種后的茶樹(shù)腋芽置于25 ℃和8 ℃條件下避光培養(yǎng)16 h后,再置于25 ℃條件下培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)溫度升高明顯促進(jìn)了褐變,褐化率比低溫培養(yǎng)褐化率高18.1 %[28]。但不同植物對(duì)溫度的反應(yīng)不同,已有研究表明,低溫預(yù)處理能夠顯著影響水曲柳外植體發(fā)生數(shù),但對(duì)于外植體褐變率的影響并不顯著[42]。此外,光照也是影響褐化發(fā)生的主要培養(yǎng)條件之一,王曉麗等以直干桉超級(jí)苗莖段為外植體開(kāi)展組培快繁技術(shù)研究,發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)條件下外植體褐化率顯著降低[43]。

2 林木組織培養(yǎng)褐化的控制途徑

2.1 合適取材與優(yōu)化處理

為了避免林木組織培養(yǎng)過(guò)程中褐化問(wèn)題發(fā)生,首先應(yīng)優(yōu)化外植體的選擇和處理。多項(xiàng)試驗(yàn)研究證明,多年生、木質(zhì)化程度高的木本植物枝條與高度分化的組織更容易發(fā)生褐化,因此,外植體應(yīng)盡量選擇幼嫩植株上分生能力強(qiáng)的部位。取材時(shí)間應(yīng)盡量避免夏季,在冬季或春季休眠期取材,枝條中酚類物質(zhì)含量較低。不同品種、不同取材部位的外植體對(duì)消毒劑的耐受程度不同,應(yīng)根據(jù)組培對(duì)象的生理特性與組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇消毒劑類型、濃度與消毒時(shí)間,避免消毒時(shí)間過(guò)久加劇褐變[13]。Bonga等在巨桉組織培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),取材切割產(chǎn)生的創(chuàng)面與體積之比越大時(shí)褐化現(xiàn)象越嚴(yán)重[38]。因此,在獲取外植體時(shí)切口盡量平整,避免產(chǎn)生大面積創(chuàng)面。此外,在接種之前對(duì)外植體進(jìn)行遮光、低溫保存以及用無(wú)菌水沖洗也能降低褐變率[44]。

2.2 調(diào)整適宜的培養(yǎng)條件

創(chuàng)建適宜的培養(yǎng)條件能促進(jìn)細(xì)胞脫分化和再分化,抑制褐化發(fā)生。通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)離子、蔗糖以及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑適宜配比能減少褐化發(fā)生。在桑樹(shù)和核桃組織培養(yǎng)過(guò)程中降低無(wú)機(jī)鹽濃度后外植體的褐變率也隨之下降[35, 45]。此外,在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑與吸附劑也能減少褐化。常用的抗氧化劑包括檸檬酸、植酸、血清白蛋白、維生素C、維生素E、聚乙烯吡咯烷酮等,吸附劑包括活性炭、PVP等,通常吸附劑的使用濃度為0.1 %～0.5 %,根據(jù)不同的培養(yǎng)材料設(shè)計(jì)試驗(yàn),篩選抑制褐變效果更好的抗氧化劑與吸附劑種類及濃度[46]。在不影響試材生長(zhǎng)和分化的前提下,接種后可以通過(guò)降低溫度、遮光培養(yǎng)、黑暗培養(yǎng)等方法抑制褐化。在木本植物組織培養(yǎng)過(guò)程中,可以根據(jù)培養(yǎng)材料的生理特性及褐化程度采用多種方法綜合防控褐化現(xiàn)象的發(fā)生。張俊琦等在牡丹組織培養(yǎng)防止褐化的研究中發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加吸附劑并結(jié)合暗培養(yǎng),能夠有效緩解褐化[47]。李婷婷等對(duì)不同基因型刺梨葉片愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果表明,春季取材后在100 mg·L-1VC溶液中浸泡12 h,在培養(yǎng)基中添加2.0 g·L-1的檸檬酸或0.4 g·L-1的AgNO3可以有效控制葉片褐化的發(fā)生[48]。張俊林等對(duì)核桃莖段抗褐化研究發(fā)現(xiàn),首先通過(guò)24 h的1～2 ℃低溫處理,再用20 %的Na2S2O3溶液浸泡20～30 min后進(jìn)行8～10 h的流水沖洗,在培養(yǎng)基中添加2.0 g·L-1PVP時(shí)外植體的褐化率達(dá)到最低[49]。

3 展望

褐化問(wèn)題作為植物組織培養(yǎng)中的難題之一,不僅延長(zhǎng)了組織培養(yǎng)的時(shí)間并提高了經(jīng)濟(jì)成本,同時(shí)制約著組織培養(yǎng)快繁技術(shù)在科研工作與實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。本文對(duì)林木組織培養(yǎng)過(guò)程中的影響因素進(jìn)行總結(jié)與分析,針對(duì)性地提出了組織培養(yǎng)褐化的控制途徑,不僅適用于預(yù)防褐變,同時(shí)適用于緩解已有褐化現(xiàn)象,為進(jìn)一步開(kāi)展高效林木組培技術(shù)研究提供參考。目前,無(wú)糖培養(yǎng)、開(kāi)放式組培與開(kāi)放式光自養(yǎng)微繁等新技術(shù)的研發(fā)為林木組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展提供了機(jī)遇,但組織培養(yǎng)技術(shù)自動(dòng)化程度與國(guó)外相比仍有待提高。隨著組織培養(yǎng)新技術(shù)的不斷發(fā)展與完善,組織培養(yǎng)條件高度自動(dòng)化調(diào)節(jié)將成為未來(lái)的主要研究方向,實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)環(huán)境中光、溫、氣、水的自動(dòng)化調(diào)控,能夠有效控制褐化問(wèn)題的產(chǎn)生,提高林木組織培養(yǎng)成功率,降低組培苗生產(chǎn)成本,對(duì)林木組織培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。