任志勇，聶啟軍，董斌峰，胡志偉，張俊紅，王 坤，李金泉

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部高山蔬菜生態(tài)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所 武漢 430064； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院 武漢 430070； 3.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 武漢 430072）

薹用白菜由十字花科蕓薹種中以花薹為食用器官的變種或亞種組成，主要包括紅菜薹（Brassica rapassp.chinensisvar.purpurea）、菜心（B.rapassp.parachinensis）以及白菜薹[1]。紅菜薹是起源于長江流域的不結(jié)球白菜變種，莖葉呈紫紅色，食用品質(zhì)極佳，是湖北、湖南及四川等長江流域省份秋冬季節(jié)栽培的重要特色蔬菜[2]。菜心則起源于我國的華南地區(qū)，生長周期短，規(guī)?；N植基地遍布全國各地，可實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)，已成為新興的大宗葉菜類蔬菜[3]。白菜薹主要在我國南方地區(qū)的秋冬季節(jié)種植[4]，構(gòu)成較為復(fù)雜，最早期的白菜薹是農(nóng)民在長期種植過程中選擇出來的一類具有早抽薹特性的弱冬性不結(jié)球白菜（B.rapassp.chinensis）品種，育種家則通過將不結(jié)球白菜與不需低溫春化即可抽薹的菜心雜交，再進(jìn)一步通過系統(tǒng)的自交選擇獲得的能夠在年前抽薹的常規(guī)品種[5]。而當(dāng)前市場上流行的白菜薹雜交品種則主要由不結(jié)球白菜與菜心雜交配組產(chǎn)生[6-7]。薹用白菜主要由幼嫩花薹為食用器官，不同類型又有所區(qū)別，其中紅菜薹主要食用花蕾、薹莖，薹葉食用較少，菜心與白菜薹則三者均可食用。

與其他十字花科蔬菜一樣，早期的薹用白菜雜交品種選育主要利用自交不親和技術(shù)，然而自交不親和技術(shù)生產(chǎn)雜交種成本較高，需要通過人工剝蕾繁殖制種親本，雜交種純度也受親本自交不親和性強(qiáng)弱的影響[8]。對于十字花科蔬菜而言，食用器官不是種子，利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）選育雜交種時(shí)無需將父本改造為恢復(fù)系，只需創(chuàng)制出母本的不育系即可。因此，近年來一些在油菜中成熟使用的CMS 在薹用白菜雜交品種選育中也被廣泛應(yīng)用。PolimaCMS 是由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)從甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)，并最早在油菜育種中成熟應(yīng)用的CMS 類型，其不育性由orf 224基因控制[9]。PolimaCMS 已被轉(zhuǎn)育到其他十字花科蔬菜如紅菜薹、小白菜中，但該類型CMS 本身在甘藍(lán)型油菜中便存在微粉的現(xiàn)象，其微粉程度在遺傳背景變異較大的十字花科蔬菜中變得更不穩(wěn)定，對其應(yīng)用也產(chǎn)生了一定限制[10-11]。OguraCMS 也是在油菜中應(yīng)用較為成功的CMS，敗育徹底，最初在蘿卜中發(fā)現(xiàn)并通過細(xì)胞工程手段導(dǎo)入到了油菜中，其不育性由orf 138基因控制[12-13]。已有的研究表明，OguraCMS 在轉(zhuǎn)育到不同類型十字花科蔬菜如芥菜、白菜與甘藍(lán)類蔬菜后，仍可保持?jǐn)∮龔氐椎奶匦?，因此OguraCMS 也是現(xiàn)階段在十字花科蔬菜中廣泛應(yīng)用的CMS 類型[14-16]。HauCMS 是在芥菜中發(fā)現(xiàn)的敗育徹底型CMS，也是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)繼PolimaCMS 后發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)在油菜中具有應(yīng)用價(jià)值的CMS 類型，其敗育特性由orf 288基因控制，通過遠(yuǎn)緣雜交導(dǎo)入到油菜中后仍能保持?jǐn)∮龔氐椎奶匦訹17]，目前該CMS 在菜心及白菜薹育種中已有成功應(yīng)用的研究報(bào)道[18-19]。

現(xiàn)階段Polima，Ogura與HauCMS 類型均已轉(zhuǎn)育到薹用白菜中，與使用原始的不育源或油菜作為不育胞質(zhì)供體相比，以已有的CMS 薹用白菜不育系及性狀優(yōu)良的CMS 雜交品種作為不育胞質(zhì)供體可提高不育系的創(chuàng)制效率，如近年來新育成的白菜薹品種天成早薹1 號、菜心品種粵翠2 號及紅菜薹品種申紫薹仙均是基于已有的薹用白菜不育系進(jìn)行的母本不育系轉(zhuǎn)育[7，20-21]。市場上同時(shí)存在不同類型的CMS 雜交品種，也為育種家創(chuàng)制不同類型CMS 雜交種提供了便利。然而一些CMS 類型的敗育特征較為相似，如Ogura與HauCMS，在育種實(shí)踐中筆者也發(fā)現(xiàn)已有的Polima分子標(biāo)記無法將Polima與HauCMS 區(qū)分開。同時(shí)筆者也發(fā)現(xiàn)了一些具有特殊敗育特征的薹用白菜商品種，然而由于多數(shù)商品種的來源與選育信息無法獲取，現(xiàn)階段需要特異性更強(qiáng)的CMS 類型鑒定分子標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)對當(dāng)前薹用白菜品種CMS 類型的精準(zhǔn)鑒定。

基于以上問題，筆者對已報(bào)道在薹用白菜品種選育中使用的Polima、Ogura及HauCMS 進(jìn)行序列分析，開發(fā)特異性分子標(biāo)記，首先解決現(xiàn)有Polima分子標(biāo)記在HauCMS 中的假陽性問題，進(jìn)一步設(shè)計(jì)多重PCR 聚合分子標(biāo)記，能夠同時(shí)對3 種不育胞質(zhì)與正?？捎|(zhì)進(jìn)行檢測，并利用開發(fā)的特異性標(biāo)記對收集的薹用白菜CMS 類型進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果可為當(dāng)前薹用白菜育種提供精準(zhǔn)高效的CMS 鑒定分子標(biāo)記，同時(shí)也可厘清當(dāng)前薹用白菜育種中CMS 的應(yīng)用特征。

1 材料與方法

1.1 材料

筆者前期通過武漢市大東門種子市場與湖北漢蔬創(chuàng)一農(nóng)業(yè)科技有限公司收集了一批主流的紅菜薹、白菜薹與菜心商品種以及處于初步示范階段的雜交組合，于2021、2022 及2023 年的2-5 月份在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊家堰試驗(yàn)基地內(nèi)進(jìn)行育性觀察，將其中符合CMS 遺傳特性即當(dāng)代表現(xiàn)出不育特性、作母本與常規(guī)可育材料雜交后的F1代仍能保持不育特性的28 個(gè)品種/組合用于本試驗(yàn)（表1）。其中HCT1801 與BCT1815 為2 個(gè)特殊育性材料，二者大部分單株均敗育徹底，但均存在少量不完全敗育的單株。OguraCMS 對照材料紫御60、鄂紅5 號與PolimaCMS 對照材料靚紅70、鄂紅2號均為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院薹用蔬菜研究團(tuán)隊(duì)自主培育的紅菜薹雜交品種。HauCMS 對照材料JC73A 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)萬正杰教授提供，Ogura恢復(fù)系對照材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所胡瓊研究員提供，其他作為可育對照的材料均為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院薹用蔬菜研究團(tuán)隊(duì)保存的種質(zhì)資源與自交系。

表1 28 個(gè)CMS 薹用白菜品種/組合信息Table 1 Information of the twenty-eight flowering Chinese cabbage varieties

1.2 方法

1.2.1 不同CMS 類型序列特異性比對 將PolimaCMS、OguraCMS 及HauCMS 對應(yīng)基因orf 224、orf 138及orf 288的基因序列分別與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的PolimaCMS、OguraCMS、HauCMS 的線粒體基因組序列（NCBI 登錄號依次為FR715249，AB694744，KF736092）、白菜正常胞質(zhì)的線粒體基因組序列（NC_016125）及核基因組序列（GCF_000309985）進(jìn)行逐一比對，根據(jù)同源性序列的水平來評估3 個(gè)CMS 類型基因的特異性。其中基因與線粒體/核基因組間的比對利用NCBI 中的序列間Blast 功能完成，鑒定到高度同源的序列后，進(jìn)一步使用EMBL-EBI 數(shù)據(jù)庫中的MUSCLE 軟件對同源性序列進(jìn)行比對分析[22]。

1.2.2 特異性分子標(biāo)記的設(shè)計(jì) 對于存在同源性序列干擾的CMS 基因，采取等位基因特異性PCR的策略[23]，在同源序列存在變異較大的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，并通過在引物3’端引入堿基錯(cuò)配的方式提升引物擴(kuò)增的特異性，初步完成標(biāo)記設(shè)計(jì)后，使用不同類型的薹用白菜品種將新標(biāo)記與該CMS 已有的標(biāo)記進(jìn)行檢測效果比較，確定新標(biāo)記的特異性。對于序列特異性較強(qiáng)的CMS 基因，直接以其序列為模板進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。為了開發(fā)具有共顯性特征的CMS 類型鑒定分子標(biāo)記，利用正常胞質(zhì)與3 種類型CMS 胞質(zhì)間的保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物，保守區(qū)域通過mVISTA 比對軟件進(jìn)行鑒定和獲取[24]。獲得3 種CMS 類型的特異引物及與正常胞質(zhì)間的通用引物后，將不同引物對混合在一起進(jìn)行測試，根據(jù)擴(kuò)增效果調(diào)整各引物對比例，獲取最佳檢測效果，最終得到可區(qū)分3 種CMS 及正?？捎|(zhì)的CMS 多重PCR 分子標(biāo)記。在標(biāo)記開發(fā)過程中引物設(shè)計(jì)相關(guān)的退火溫度評估與二聚體分析均使用Oligo 7 軟件完成[25]。

1.2.3 分子標(biāo)記的檢測 分子標(biāo)記檢測試驗(yàn)于2023 年8 月在蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

采用CTAB 法提取DNA，用ddH2O 溶解DNA，并將質(zhì)量濃度調(diào)至100～400 ng·μL-1，用于PCR 擴(kuò)增。10 μL PCR 反應(yīng)體系為：1.0 μL 10 ×Easy Taq buffer，0.2 μL dNTP（10 mmol·L-1），0.1 μL Easy Taq 酶（5 U·μL-1，北京全式金生物），2.0 μL 待測樣品DNA（100～400 ng·μL-1），單標(biāo)記PCR 時(shí)加0.2 μL 正向與反向引物（10 μmol·L-1），多標(biāo)記聚合PCR 引物用量則根據(jù)優(yōu)化后各標(biāo)記引物的濃度配比而定，最后加ddH2O 補(bǔ)足總體積至10 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，單標(biāo)記PCR 退火溫度為55 ℃，時(shí)間30 s，多引物聚合PCR退火溫度為58 ℃，時(shí)間30 s，72 ℃延伸45 s，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，其中OguraCMS 恢復(fù)基因Rfo分子標(biāo)記CIN6 的條帶差異僅有8 bp[26]，采取4%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.4 不同類型薹用白菜CMS 基因型的檢測 利用新開發(fā)的CMS 多重PCR 分子標(biāo)記對收集的28個(gè)具有CMS 遺傳特征的雜交品種/組合進(jìn)行鑒定。對特殊育性材料HCT1801 與BCT1815 中的不完全敗育單株的不育花、可育花及葉片分別進(jìn)行檢測，以確定CMS 類型，根據(jù)CMS 鑒定類型結(jié)果，進(jìn)一步利用對應(yīng)CMS 的恢復(fù)基因分子標(biāo)記確定是否攜帶恢復(fù)基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性CMS分子標(biāo)記的開發(fā)與驗(yàn)證

PolimaCMS 敗育基因orf 224在HauCMS 線粒體基因組中比對到一段高度同源的序列，為了保證Polima分子標(biāo)記的特異性，將其引物設(shè)計(jì)在orf 224與對應(yīng)HauCMS 同源性序列中變異較大的區(qū)域（圖1），并分別在正向引物3’端第6 位堿基和反向引物3’端第2 位堿基引入錯(cuò)配以提高擴(kuò)增特異性（表2）。選取2 個(gè)已在育種中應(yīng)用的Polima分子標(biāo)記P1122、Pol_3132，與新開發(fā)的Polima分子標(biāo)記進(jìn)行特異性比較。結(jié)果表明，新設(shè)計(jì)的Polima標(biāo)記在HauCMS 及其他測試的薹用白菜中均無假陽性（圖2-C），而P1122 與Pol_3132 均在HauCMS 中出現(xiàn)假陽性結(jié)果，同時(shí)Pol_3132 還在部分紅菜薹中出現(xiàn)弱陽性條帶（圖2-A～B）。OguraCMS 敗育基因orf 138的序列特異性較高，在與其他類型胞質(zhì)與正常胞質(zhì)線粒體及核基因組進(jìn)行比對后，均未鑒定到同源性較高的序列，因此直接以其序列模板進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。由于HauCMS 基因orf 288在各CMS 線粒體基因組及核基因組中均存在高度同源序列，因此用衡雙平等[19]的方法從HauCMS 線粒體基因組中鑒定的特異性序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。通用引物則設(shè)計(jì)在PolimaCMS、HauCMS、OguraCMS 與正常胞質(zhì)線粒體基因組的保守序列區(qū)域。為了兼顧多重PCR 的擴(kuò)增效果，所有引物的設(shè)計(jì)模擬最適退火溫度均為58～60 ℃，經(jīng)過多輪的多重PCR 測試優(yōu)化后，各CMS 類型的最佳引物濃度比例、序列及擴(kuò)增目的條帶大小信息見表2，將開發(fā)的多重PCR 分子標(biāo)記命名為Brcms_M，Brcms_M 在不同的CMS 類型及正常胞質(zhì)材料中均表現(xiàn)出良好的特異性（圖2-D）。

圖1 orf 224 與Hau CMS 中的同源性序列比對Fig.1 Sequence alignment of orf 224 and corresponding homologous sequence from Hau CMS

圖2 CMS 多重PCR 分子標(biāo)記Brcms_M 的特異性驗(yàn)證Fig.2 Specificity verification of the multiplex PCR CMS marker Brcms_M

表2 Brcms_M 標(biāo)記信息Table 2 Information of marker Brcms_M

2.2 28個(gè)薹用白菜品種/組合CMS類型的檢測

利用新開發(fā)的CMS 多重PCR 分子標(biāo)記Brcms_M 對28 個(gè)薹用白菜CMS 不育品種/組合進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示除紅菜薹HCT1801 與白菜薹BCT1815 為OguraCMS 外，其他不完全敗育的品種均為PolimaCMS（圖3，表1）。11 個(gè)紅菜薹品種/組合中有8 個(gè)為PolimaCMS，3 個(gè)為OguraCMS，表明當(dāng)前紅菜薹CMS 雜交種仍以Polima類型為主。8 個(gè)白菜薹雜交品種/組合中僅有1 個(gè)為PolimaCMS，其他均為OguraCMS，9 個(gè)菜心CMS雜交品種/組合則均為Ogura類型，表明白菜薹與菜心雜交品種選育中Ogura為主要應(yīng)用的CMS 類型。

圖3 28 個(gè)薹用白菜品種/組合CMS 類型鑒定Fig.3 CMS type identification of the twenty-eight flowering Chinese cabbage varieties

2.3 特殊育性材料的CMS類型鑒定與分析

從湖北漢蔬創(chuàng)一農(nóng)業(yè)科技有限公司收集的紅菜薹雜交組合HCT1801 與白菜薹雜交組合BCT1815 均鑒定為OguraCMS 類型，但2 個(gè)組合中均存在不完全敗育單株，這種單株在生長后期會同時(shí)存在不育花與可育花（圖4-A～B）。使用Brcms_M 對不完全敗育單株的不育花、可育花進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，不育花與可育花的胞質(zhì)也均為Ogura類型（圖4-C）。利用OguraCMS 恢復(fù)基因Rfo的分子標(biāo)記CIN6 對HCT1801 與BCT1815 的不完全敗育單株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明HCT1801 與BCT1815 的不完全敗育單株均不含恢復(fù)基因Rfo（圖4-D）。

圖4 HCT1801 與BCT1815 不完全敗育株的表型與基因型鑒定Fig.4 Phenotype and genotype identification of two partial sterility varieties HCT1801 and BCT1815

3 討論與結(jié)論

薹用白菜是我國南方地區(qū)重要的十字花科蔬菜品類，其品種選育與其他十字花科蔬菜一樣，主要經(jīng)歷了常規(guī)種、自交不親和及CMS 雜交種3 個(gè)階段。當(dāng)前，十字花科的CMS 研究和育種應(yīng)用均取得了較大進(jìn)展，OguraCMS 敗育徹底，在提高雜交種純度及知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)方面優(yōu)勢明顯，近年來從國外引進(jìn)的優(yōu)良大白菜與甘藍(lán)、青花菜品種中也以O(shè)guraCMS 型雜交種居多。筆者的研究結(jié)果表明，OguraCMS 也是當(dāng)前薹用白菜育種中傾向于使用的類型，8 個(gè)白菜薹品種/組合中7 個(gè)均為OguraCMS 雜交種，而在薹用白菜雜交品種選育中起步較晚的菜心，則全部為OguraCMS 雜交種。紅菜薹因早期雜交品種選育階段PolimaCMS 應(yīng)用較多，一些市場競爭力較強(qiáng)的Polima型雜交種仍然占據(jù)主導(dǎo)地位。HauCMS 相較于PolimaCMS、OguraCMS 發(fā)現(xiàn)較晚，雖然有報(bào)道其已應(yīng)用于薹用白菜育種，但在筆者研究中收集的商業(yè)雜交種中未發(fā)現(xiàn)，可能與該類型在薹用白菜育種中的應(yīng)用較晚，目前還未產(chǎn)生市場競爭力較強(qiáng)的品種有關(guān)。

在育種工作中，具有市場競爭力的CMS 商業(yè)雜交種實(shí)際上也被育種家視為重要的育種材料。在將親本改造為不育系的過程中，育種家可直接利用已有的CMS 雜交品種作為不育源。而隨著十字花科蔬菜恢復(fù)系材料創(chuàng)制工作的持續(xù)推進(jìn)，通過對CMS 商業(yè)雜交品種進(jìn)行育性轉(zhuǎn)換，可直接利用這類品種中的優(yōu)異特性如根腫病抗性[27-29]。對于薹用白菜而言，CMS 雜交品種的持續(xù)更迭使得不同CMS類型同時(shí)存在于市場中，這也與筆者的CMS 類型鑒定結(jié)果相契合。而在利用這些CMS 品種時(shí)，一個(gè)可以對CMS 類型進(jìn)行精準(zhǔn)、高效鑒定的分子標(biāo)記顯得尤為重要，筆者研究開發(fā)的CMS 多重PCR特異性分子標(biāo)記Brcms_M 可對PolimaCMS、OguraCMS、HauCMS 及正常胞質(zhì)同時(shí)進(jìn)行鑒定。同時(shí)，相較于現(xiàn)有的Polima分子標(biāo)記如P1122[30]、Pol_3132[31-32]，Brcms_M 也解決了因序列同源性較高而導(dǎo)致在HauCMS 材料中出現(xiàn)的假陽性問題。

筆者在收集的CMS 品種/組合中鑒定到了2 個(gè)特殊育性的OguraCMS 組合即紅菜薹HCT1801與白菜薹BCT1815，2 個(gè)組合中均出現(xiàn)了部分可育單株，即在生長中后期同一單株上出現(xiàn)了可育花與不育花同時(shí)存在的現(xiàn)象。Brcms_M 鑒定結(jié)果表明這類單株的可育與不育花均為OguraCMS 類型。而已有的研究表明，OguraCMS 敗育十分徹底，其敗育基因orf 138早在花藥發(fā)育的四分體時(shí)期即進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)而引起線粒體發(fā)育異常，且此后花藥絨氈層細(xì)胞的各個(gè)發(fā)育時(shí)期均不存在正常結(jié)構(gòu)的線粒體[33]。OguraCMS 恢復(fù)基因Rfo表達(dá)的蛋白可結(jié)合在orf 138mRNA 的編碼區(qū)，充當(dāng)核糖體阻滯劑，阻礙沿orf 138mRNA 的翻譯延伸從而解除orf 138的毒性，使育性恢復(fù)[13]，但筆者在2 個(gè)特殊育性組合HCT1801 與BCT1815 的部分可育株中均未檢測到恢復(fù)基因Rfo。這種育性部分恢復(fù)的現(xiàn)象也有可能是線粒體中orf 138拷貝數(shù)變化引起的育性回復(fù)突變。已有的研究表明，CMS 材料受自身遺傳背景的影響，細(xì)胞質(zhì)線粒體中不育基因的拷貝數(shù)也會發(fā)生變化，從而產(chǎn)生育性回復(fù)突變體，但在自然條件下這種情況發(fā)生的概率極低，十字花科僅在芥菜CMS材料中報(bào)道其線粒體基因orf 220拷貝數(shù)變化導(dǎo)致的育性回復(fù)突變[34]。此外，HCT1801 與BCT1815中也可能存在能部分恢復(fù)OguraCMS 育性的新恢復(fù)基因，筆者也計(jì)劃在下一步研究工作中將部分可育的單株花粉授到正常的OguraCMS 不育系上，觀察其F1的育性特征來驗(yàn)證新的恢復(fù)基因是否存在。

綜上所述，筆者開發(fā)了特異性多重PCR 分子標(biāo)記Brcms_M，可對PolimaCMS、OguraCMS、HauCMS 及正常胞質(zhì)同時(shí)進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定，表明Polima是當(dāng)前紅菜薹育種中主要應(yīng)用的CMS 類型，白菜薹與菜心CMS 則均以O(shè)gura類型為主，同時(shí)發(fā)現(xiàn)2 個(gè)存在不完全敗育現(xiàn)象且不含恢復(fù)基因Rfo的OguraCMS 組合HCT1801 與BCT1815。